高彥萍 張武 王國祥 席春艷 吳雁斌 梁宏杰 呂和平

摘要 ：馬鈴薯卷葉病毒Potato leafroll virus （PLRV）是目前嚴重影響馬鈴薯產(chǎn)量與品質(zhì)的主要病毒之一，給馬鈴薯產(chǎn)業(yè)造成巨大損失。本研究采用環(huán)介導等溫核酸擴增（loop?mediated isothermal amplification， LAMP）技術(shù)建立PLRV的RT?LAMP檢測方法。采取單因素變化試驗，對RT?LAMP反應(yīng)體系中多個因素包括引物組合、溫度條件及Mg2+、betaine、Bst 3.0 DNA聚合酶、dNTPs、UNG、SYBR Green Ⅰ和引物組合的濃度進行一系列試驗和優(yōu)化。采用RT?PCR檢測方法進行平行比對試驗，對優(yōu)化后的RT?LAMP反應(yīng)體系進行了驗證。結(jié)果表明，最佳引物組合為P3，最適反應(yīng)溫度62℃，25 μL反應(yīng)體系中，Mg2+、betaine、Bst 3.0 DNA聚合酶和UNG的最佳終濃度分別為4 mmol/L、0 mmol/L、0.64 U/μL和0.08 U/μL，dNTPs的最佳用量為1 μL（dATP、dGTP、dCTP各0.4 mmol/L，dUTP 1.2 mmol/L），SYBR Green Ⅰ（20×）的最佳用量1 μL，primer mix的最佳用量2.5 μL（PLRV?FIP/BIP、PLRV?F3/B3和PLRV?LF/LB的濃度分別為0.8、0.2 μmol/L和0.6 μmol/L），RNA模板1 μL（2 ng/μL），加DEPC?H2O至25 μL，反應(yīng)時間50 min。優(yōu)化后的RT?LAMP檢測結(jié)果與RT?PCR一致，且可視化判讀結(jié)果。因此，建立的PLRV RT?LAMP檢測方法為進一步開發(fā)RT?LAMP檢測試劑盒及其實際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 ：馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）;?反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增（RT?LAMP）;?檢測方法

中圖分類號：

S 435.32

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2018484

Optimization of the PLRV RT?LAMP detection method

GAO Yanping1，3，?ZHANG Wu1，3，?WANG Guoxiang2，?XI Chunyan1，?WU Yanbin1，3，?LIANG Hongjie1，3，?L Heping1，3

（1. Potato Institute， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou?730070， China; 2. Institute of Chinese Herbal

Medicines， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou?730070， China; 3. Gansu Engineering Technology

Research Center of Potato Seed （Seedling） Virus Detection and Evaluation， Lanzhou?730070， China）

Abstract

Potato leafroll virus （PLRV） is currently one of the main threats for the yield and quality of potatoes， having caused tremendous damages to the potato industry. In this study， a PLRV reverse transcription?loop mediated isothermal amplification （RT?LAMP） method was established based on the loop?mediated isothermal amplification （LAMP）. Single?factor experiments were conducted to test and optimize the RT?LAMP reaction system， including the primers， temperature， Mg2+， betaine， Bst 3.0 DNA polymerase， dNTPs， UNG， SYBR Green Ⅰ and primer mix concentrations. The optimized RT?LAMP reaction system was then verified through parallel?controlled test using the reverse transcription?polymerase chain reaction （RT?PCR） method. The results showed that， in the optimized reaction conditions， the primer pair was P3 and the reaction temperature was 62℃; in the 25 μL reaction system， the concentrations of Mg2+， betaine Bst 3.0 DNA polymerase， and UNG were 4 mmol/L， 0 mmol/L， 0.64 U/μL， and 0.08 U/μL， respectively; the dosage for dNTPs was 1 μL （0.4 mmol/L for dATP， dGTP， and dCTP， respectively， and 1.2 mmol/L for dUTP）; the dosage for SYBR Green Ⅰ（20×） was 1 μL; the dosage for the primer mix was 2.5 μL （the corresponding concentrations for PLRV?FIP/BIP， PLRV?F3/B3， and PLRV?LF/LB was 0.8 μmol/L， 0.2 μmol/L， and 0.6 μmol/L， respectively）; for the 1 μL RNA template （2 ng/μL）， additional DEPC?H2O was added to get a final 25 μL volume， and the reaction time was 50 min. The optimized RT?LAMP provided the same detection result as RT?PCR and the interpretation could be visualized. These results confirmed that our PLRV RT?LAMP reaction system provides a basis for further developing RT?LAMP detection kits and for their practical application.

Key words

Potato leafroll virus（PLRV）;?RT?LAMP;?reaction system

馬鈴薯Solanum tuberosum是世界第四大糧食作物[1]。病毒病是引起馬鈴薯退化的主要原因。馬鈴薯卷葉病毒Potato leafroll virus （PLRV）是目前嚴重影響馬鈴薯產(chǎn)量與品質(zhì)的主要病毒之一，給馬鈴薯產(chǎn)業(yè)造成巨大損失[23]。病毒檢測是馬鈴薯病毒病害防治、預(yù)測預(yù)報、脫毒種薯（苗）培育等過程中的一個重要環(huán)節(jié)。PLRV檢測主要有ELISA[4]、RT?PCR[5]、多重RT?PCR[6]、real?time RT?PCR[7]、基因芯片亦稱為DNA微點陣（DNA microarray）等方法。ELISA法雖然高通量，但耗時長、程序不簡便、靈敏度較低; 而RT?PCR、多重RT?PCR 和real?time RT?PCR核酸檢測技術(shù)雖然具有靈敏度和特異性高以及同步性等優(yōu)點，但存在儀器昂貴、成本高、專業(yè)性強，

技術(shù)難度大和成本高問題，難以在生產(chǎn)實際中推廣應(yīng)用。環(huán)介導等溫核酸擴增（loop?mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)是Notomi等[8]2000年建立的一種的分子檢測技術(shù)，該技術(shù)針對靶基因的6個特定區(qū)域設(shè)計4種特異性引物，利用DNA鏈置換聚合酶（Bst DNA polymerase），在恒溫（60～65℃）條件下對靶基因進行擴增，具有特異性強、靈敏度高、操作簡單、快速且適合于多種檢測環(huán)境等優(yōu)點。自開發(fā)以來，被廣泛應(yīng)用于許多領(lǐng)域的基因檢測[912]。RT?LAMP 技術(shù)在植物病毒檢測方面亦表現(xiàn)出簡便、快捷、準確的特點[1314]。本研究對PLRV RT?LAMP反應(yīng)體系中多個因子進行了優(yōu)化，建立了PLRV RT?LAMP檢測方法，旨在為PLRV RT?LAMP檢測試劑盒的進一步開發(fā)及實際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1?材料和方法

1.1?材料

1.1.1?生物材料

本試驗所用PLRV陰、陽性對照是甘肅省馬鈴薯脫毒種薯（種苗）病毒檢測及安全評價工程技術(shù)研究中心實驗室保存的離體組培苗。

1.1.2?主要試劑

植物多糖多酚RNA提取試劑盒[RNAprep Pure Plant Kit（Q5613）]購自天根公司，RNasin ribonuclease inhibitor、M?MLV reverse transcriptase、rTaq DNA polymerase、UNG（RNase inhibitor）、MgSO4、dNTP mix等購自TaKaRa公司，Bst 3.0 DNA polymerase 購自New England Biolabs公司，Betaine、SYBR Green Ⅰ等購自索萊寶公司，DEPC購自Vetec公司，GeneFinderTM購自至善生物公司，硝基四氮唑藍（NBT）、瓊脂糖等購自Promega公司，DAS?ELISA試劑盒購自Bio?Rad公司。

1.1.3?主要儀器

VORTEX?GENIE2/2T漩渦混勻儀（美國SI）、iCEN?24臺式高速離心機（杭州奧盛公司）、君意?JY600C電泳儀（北京君意公司）、Tanon?3500R瓊脂凝膠成像系統(tǒng)（上海天能公司）、Nano Drop 2000 Spectrophotometer（Thermo Fisher Scientific）、BIO?RAD T100TM Thermal Cycler（BIO?RAD）、筆式紫外燈11SC?1（Spectronics公司）。

1.2?方法

1.2.1?引物設(shè)計

已有研究表明，世界上已報道PLRV全基因序列高度同源，較其他種類病毒存在序列的保守性[7，15];PLRV的CP基因同樣具有高度的同源性及核酸一致率[16]。從GenBank檢索并下載PLRV的CP基因序列，通過比對獲得保守區(qū)域，利用Primer Explorer V 4.0軟件設(shè)計4組RT?LAMP引物，經(jīng)試驗篩選出1組特異性引物。RT?PCR采用標準SN/T 2627?2010中的引物序列[17]。引物信息見表1。引物由上海生工生物公司合成。

1.2.2?RNA的提取

使用天根公司的植物多糖多酚RNA提取試劑盒，根據(jù)試劑盒提供的步驟抽提病毒RNA總核酸，測定濃度后-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3?RT?LAMP基本體系

基本反應(yīng)體系參考Bst 3.0 DNA polymerase說明書。25 μL反應(yīng)體系： 2.5 μL 10×Bst buffer，1.5 μL 100 mmol/L MgSO4（10×Bst buffer中已包含20 mmol/L MgSO4），0～1.2 μL 1 mmol/L betaine，0.5～2.0 μL Bst 3.0 DNA polymerase （8 U/μL），0.5～2.0 μL dNTPs （10 mmol/L dATP、dGTP和dCTP，30 mmol/L dUTP），1～4.0 μL 10×primer mix （8 μmol/L FIP/BIP; 2 μmol/L F3/B3; 6 μmol/L Loop F/R）， 0.5～1.5 μL UNG（2 U/μL），0.5～20 μL 20×SYBR Green Ⅰ，1 ng～1 μg模板RNA，加DEPC?H2O至25 μL，60～70℃孵育30 min～1 h。

1.2.4?RT?LAMP檢測體系優(yōu)化

通過單因素變化試驗分別對RT?LAMP體系中的反應(yīng)溫度和引物濃度等條件進行優(yōu)化。設(shè)置反應(yīng)溫度50、55、60、62.5、65、70℃，Mg2+濃度1、2、4、6、8 mmol/L，betaine濃度0、0.4、0.8、1.0、1.2 mmol/L，Bst 3.0 DNA聚合酶（8 U/μL）加入量0.1、0.3、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0 μL，dNTPs加入量0.4、08、10、1.2、1.4、1.6 μL等（10 mmol/L dATP、dCTP和dGTP，30 mmol/L dUTP）; UNG濃度（2 U/μL），加入量0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 μL，SYBR GreenⅠ（20×）加入量0.5、1.0、1.5、2.0 μL，10×primer mix（8 μmol/L FIP/BIP; 2 μmol/L F3/B3; 6 μmol/L LF/LR）加入量1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 μL，反應(yīng)時間根據(jù)實時熒光PCR的擴增曲線進行判斷。為了及時發(fā)現(xiàn)RT?LAMP試驗過程中的氣溶膠污染，設(shè)置不加RNA模板對照（no template control，NTC）和陰性對照（negative control）。qPCR測定反應(yīng)條件和主要組分不同梯度的Ct值變化，結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳擴增條帶分析，確定不同因子的最佳條件或濃度。

1.2.5?RT?LAMP反應(yīng)體系驗證

對優(yōu)化的RT?LAMP反應(yīng)體系，采用RT?PCR進行平行比對驗證，RT?PCR檢測按標準SN/T 2627?2010[14]的改進方法進行。結(jié)果判讀： RT?PCR擴增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳分析。RT?LAMP擴增產(chǎn)物（1）反應(yīng)結(jié)束后，取產(chǎn)物5 μL用2%瓊脂糖凝膠電泳分析; （2）加入1 μL 1 000×SYBR Green Ⅰ，振蕩混勻，直接目視觀察結(jié)果，或者加入1 μL 50×SYBR Green Ⅰ，振蕩混勻，紫外線下觀察結(jié)果。

2?結(jié)果與分析

2.1?引物篩選

用RT?LAMP基本反應(yīng)體系（各組分參考數(shù)值范圍取中值），對設(shè)計的4組引物（P1～P4）進行篩選，反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，4組引物均能擴增出條帶，其中P3組擴增條帶亮度最好，故選用P3組作為體系優(yōu)化的引物（圖1）。

2.2?反應(yīng)溫度優(yōu)化

利用篩選獲得的引物組，設(shè)置6個反應(yīng)溫度梯度50、55、60、62.5、65、70℃，NTC對照和陰性對照溫度62.5℃。結(jié)果顯示該引物的反應(yīng)溫度條件較為寬松，溫度55～65℃均有擴增條帶，60～65℃擴增條帶亮度清晰，試驗體系反應(yīng)溫度確定為62℃（圖2）。

2.3?Mg2+濃度優(yōu)化

設(shè)置Mg2+濃度5個梯度1、2、4、6、8 mmol/L進行試驗，NTC對照和陰性對照Mg2+濃度為4 mmol/L。結(jié)果顯示RT?LAMP反應(yīng)在Mg2+濃度為

2～8 mmol/L 4個反應(yīng)條件下均有擴增，Mg2+濃度

大于4 mmol/L，瀑布狀條帶清晰明顯（圖3），擴增曲線的Ct值隨Mg2+濃度變化呈先降后升的趨勢，Mg2+濃度為4 mmol/L時，Ct值最低（表2）。因此，RT?LAMP檢測Mg2+濃度采用4 mmol/L。

2.4?Betaine濃度優(yōu)化

分別設(shè)置5個betaine濃度梯度0、0.4、0.8、1.0、1.2 mmol/L，NTC對照和陰性對照的betaine濃度為0.8 mmol/L。結(jié)果顯示，RT?LAMP反應(yīng)在betaine濃度為0～1.2 mmol/L 5個濃度梯度下均有擴增，隨betaine濃度的變化，瀑布狀條帶變化不明顯（圖4），betaine濃度為0 mmol/L 時，擴增曲線Ct值最小（表2）。因此，betaine的最佳濃度為0 mmol/L。

2.5?dNTPs濃度優(yōu)化

設(shè)置6個dNTPs （dATP、dGTP和dCTP 10 mmol/L each，dUTP 30 mmol/L）濃度梯度，加入量分別為0.4、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 μL，NTC對照和陰性對照的加入量為1.0 μL。結(jié)果顯示，dNTPs加入量在0.4～1.6 μL均有擴增，加入量1.0 μL時，擴增條帶最亮（圖5）。擴增反應(yīng)的Ct值隨dNTPs加入量呈先降后升的趨勢，dNTPs加入量為1.0 μL時Ct值最小（表2）。因此，RT?LAMP檢測時dNTPs加入量采用1.0 μL（對應(yīng)濃度dATP、dGTP和dCTP 0.4 mmol/L，dUTP 1.2 mmol/L）。

2.6?Bst 3.0 DNA聚合酶濃度優(yōu)化

設(shè)置Bst 3.0 DNA聚合酶（8 U/μL）加入量為0.1、0.3、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0 μL，NTC對照和陰性對照的加入量為1.0 μL。結(jié)果顯示，酶的加入量越多，凝膠電泳的瀑布狀條帶越明顯。酶的加入量為0.1～0.5 μL時，有較弱的擴增，Ct值較大; 當酶的加入量為0.75～2.0 μL時，Ct值隨酶加入量增大而減小，酶的加入量2.0 μL時，Ct值最?。ū?）。因此，選擇BST 3.0 DNA聚合酶（8 U/μL）的加入量為2.0 μL（對應(yīng)濃度為0.64 U/μL）。

2.7?UNG濃度優(yōu)化

UNG（2 U/μL），設(shè)置6種不同的濃度梯度，加入量分別為0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 μL，NTC對照

和陰性對照的加入量為1.0 μL。結(jié)果顯示，UNG加入量在0.5～1.25 μL有擴增，1.5 μL無擴增，在0.5～1.25 μL，Ct值隨UNG加入量增加呈先降后升的趨勢，UNG加入量為1 μL時Ct值最低（表2），因此，RT?LAMP檢測時UNG加入量為1 μL。

2.8?SYBR Green Ⅰ濃度優(yōu)化

設(shè)置4個SYBR Green Ⅰ（20×）濃度，加入量分別為0.5、1.0、1.5、2.0 μL，NTC對照和陰性對照的加入量為1.0 μL。結(jié)果顯示，SYBR Green Ⅰ加入量在0.5～2.0 μL時均有擴增; Ct值隨SYBR Green Ⅰ加入量的增加并無顯著降低，表明染料濃度在一定范圍內(nèi)對RT?LAMP擴增反應(yīng)無顯著影響，加入量1 μL時Ct值相對較低（表2）。因此，RT?LAMP檢測時SYBR Green Ⅰ加入量為1 μL。

2.9?Primer mix濃度篩選

設(shè)置7組primer mix（10×，8 μmol/L FIP/BIP，2 μmol/L F3/B3，6 μmol/L LF/LR）濃度，加入量分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 μL，陰性對照加入25 μL。結(jié)果顯示，primer mix加入量在1.0～4.0 μL時均有擴增，在2.5～4.0 μL時擴增效率較高，但擴增Ct值差別不大，表明primer mix加入量在超過2.5 μL時達到飽和（表2）。由于primer mix加入量為2.5 μL時Ct值相對最小，因此，RT?LAMP檢測時primer mix加入量為2.5 μL（0.8 μmol/L PLRV?FIP/BIP，02 μmol/L PLRV?F3/B3，06 μmol/L PLRV?LF/LB）。

2.10?RT?LAMP反應(yīng)體系驗證

對上述優(yōu)化后的RT?LAMP反應(yīng)體系采用RT?PCR進行平行比對驗證。結(jié)果表明：RT?LAMP檢測結(jié)果與RT?PCR一致（圖6a～b）。RT?LAMP反應(yīng)產(chǎn)物中加入高濃度（1 000×）SYBR Green Ⅰ后，陽性產(chǎn)物顏色變?yōu)榫G色，NTC和陰性對照產(chǎn)物顏色為褐色，加入低濃度（50×）SYBR Green Ⅰ后，紫外線下（筆式紫外燈）陽性樣品發(fā)出強熒光，NTC和陰性對照沒有熒光（圖6c～d）。因此，RT?LAMP檢測可通過肉眼觀察直接判斷結(jié)果，較RT?PCR簡單容易。

3?結(jié)論與討論

本研究基于PLRV CP基因序列，設(shè)置了4組LAMP引物，篩選出最佳引物組P3，對反應(yīng)條件及主要組分，包括反應(yīng)溫度、Mg2+、betaine、Bst 3.0 DNA聚合酶、dNTPs、UNG、SYBR Green Ⅰ和引物組合等的濃度，采用單因素變化法進行了篩選優(yōu)化。從結(jié)果看出，對PLRV RT?LAMP檢測影響較明顯的因子有引物及其濃度、Mg2+濃度、Bst 3.0 DNA聚合酶濃度、dNTPs濃度和UNG濃度，影響較小的因子是SYBR Green Ⅰ 濃度和反應(yīng)溫度。最佳引物組為P3，在25 μL反應(yīng)體系中：primer mix的最佳加入量為2.5 μL （PLRV?FIP/BIP、PLRV?F3/B3和PLRV?LF/LB的終濃度分別為0.8 μmol/L、0.2 μmol/L和0.6 μmol/L），Mg2+的最佳終濃度為4 mmol/L，Bst 3.0 DNA聚合酶（8 U/μL）的最佳加入量為2 μL，dNTPs （dATP、dGTP、dCTP各0.4 mmol/L，dUTP 1.2 mmol/L），UNG（2 U/μL）的最佳用量均是1 μL，SYBR Green Ⅰ（20×）加入量為1.0 μL，反應(yīng)溫度是62℃。

目前多種植物的病毒檢測采用了便捷，快速、高效的RT?LAMP技術(shù)，如柑橘衰退病毒[13]，葡萄A病毒、潛隱環(huán)斑病毒和輕型黃邊病毒[1820]，辣椒黃脈病毒[21]，水稻多種病毒[14， 22]等。本研究實現(xiàn)了對馬鈴薯卷葉病毒RT?LAMP檢測方法的全面優(yōu)化，對優(yōu)化的檢測方法采用了RT?PCR標準檢測方法進行平行比對驗證，二者檢測結(jié)果一致。而且，RT?LAMP檢測可通過肉眼觀察直接判斷結(jié)果（可視化判讀結(jié)果），較RT?PCR簡單容易，可滿足科研、基層單位和簡陋現(xiàn)場等對該病毒檢測的需要。

RT?LAMP 技術(shù)采用6條引物擴增，有極高的特異性，但試驗中也存在假陽性現(xiàn)象。主要由于其具有高的靈敏性，能檢測到空氣中的陽性氣溶膠微粒造成[2223]。在同一地方長期操作，易在空氣中形成氣溶膠，操作過程中若樣品混有陽性的氣溶膠顆粒就易污染。本試驗總結(jié)前人試驗經(jīng)驗，嚴格操作規(guī)范，不同操作分區(qū)進行，反應(yīng)液分裝備用，保持實驗室空氣清潔，勤換手套和實驗服，做到了有效避免氣溶膠污染的發(fā)生。同時，每次試驗設(shè)計空白對照和陰性對照，以便及時發(fā)現(xiàn)氣溶膠假陽性污染和及時采取防污染措施。試驗中需要開蓋操作，操作周圍空氣中可能易形成陽性氣溶膠，造成試驗交叉污染;生產(chǎn)檢測實踐中，將可視化試劑1 μL SYBR Green Ⅰ在反應(yīng)前滴加到PCR管蓋子內(nèi)側(cè)頂部，反應(yīng)結(jié)束后振蕩3 s，瞬時離心5 s，然后觀察結(jié)果，這樣可以避免因開蓋引起的氣溶膠交叉污染，從而避免結(jié)果判讀的假陽性。

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（責任編輯：楊明麗）