周園園 吳治然 貢長怡 韋朝領(lǐng) 張立新

摘要 ：茶樹是我國重要的經(jīng)濟作物，茶園葉病的流行會造成嚴重的經(jīng)濟損失。2017年10月到2018年1月從安徽、福建和湖北省茶區(qū)的9 個茶樹品種上采集代表性茶葉斑病葉，該病害的發(fā)病癥狀與由Colletotrichum spp.引起的茶炭疽病相似。采用組織分離法從發(fā)病葉片組織分離獲得26 株菌落形態(tài)一致的真菌分離物，顯微鏡觀察結(jié)果顯示，各菌株分生孢子的產(chǎn)生方式和形態(tài)特征相似。為進一步明確菌株的分類地位，選取2株來自安徽廬江和宣城地區(qū)的代表性菌株（EC?6和XBC1?3）進行多基因片段的PCR擴增和序列分析。結(jié)果表明，代表性菌株EC?6和XBC1?3的ITS、gpd、tef?1a基因序列分別與交鏈格孢Alternaria alternata參考菌株CBS 107.27的序列（KP124300， KP124157， KP125075）相似性為100%、99%和100%，結(jié)合菌株形態(tài)學觀察以及柯赫氏法則驗證，證實交鏈格孢是引起該茶樹葉斑病的致病菌。這是在安徽茶區(qū)首次發(fā)現(xiàn)由致病性鏈格孢引起茶樹葉斑病。

關(guān)鍵詞 ：茶樹葉斑病;?鏈格孢;?致病性;?鑒定

中圖分類號：

S 435.711

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2018458

Identification of Alternaria alternata causing leaf spot

disease of Camellia sinensis

ZHOU Yuanyuan1，?WU Zhiran1，?GONG Changyi1，?WEI Chaoling2，?ZHANG Lixin1

（1. College of Plant Protection， Anhui Agricultural University， Hefei?230036， China; 2. State Key

Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization， Anhui Agricultural University， Hefei?230036， China）

Abstract

The tea plant， Camellia sinensis （L.） O. Kuntze， is a crucial commercial crop in China. The foliar diseases often resulted in serious production loss during epidemic outbreak in tea plantations in China. From October 2017 to January 2018， representative diseased leaves showing similar symptoms with anthracnose disease were collected from tea plants of nine varieties in tea plantations in Anhui， Fujian and Hubei provinces. A total of 26 isolates were recovered consistently from symptomatic leaves by tissue isolation， and identified as Alternaria sp. by morphological features. The two strains （EC?6， XBC1?3） from Lujiang county and Xuancheng regions in Anhui province， respectively， were representatively selected for further identification by PCR amplification and sequence analysis. Using BLAST analysis of NCBI， the internal transcribed spacer （ITS） region， the gpd and tef?1a gene sequences of the two strains shared 100%， 99% and 100% sequence identity with those of the A.alternata strain CBS107.27 in GenBank （KP124300， KP124157， KP125075）， respectively. Based on the morphological characters， sequences analysis as well as pathogenicity tests， the causal pathogen was identified as A. alternata. This is the first report of A. alternata causing leaf spot disease of tea plants in Anhui province.

Key words

leaf spot disease of tea plant;?Alternaria alternata;?pathogenicity;?identification

茶樹Camellia sinensis （L.） O. Kuntze起源于云南[1]，是我國重要的經(jīng)濟作物。我國對茶樹病害的研究多集中在葉部病害，原因一方面在于葉部病害是我國茶樹的主要病害，另一方面是茶樹的經(jīng)濟價值多集中在葉片，茶樹芽和葉的品質(zhì)直接影響到茶葉的生產(chǎn)和經(jīng)濟價值[2]。茶樹葉部病害已記載的有126 種，主要有炭疽病、輪斑病和茶餅病等[24]。根據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）的記錄，2016 年中國生產(chǎn)茶葉241萬 t左右。若茶樹種植區(qū)發(fā)生嚴重葉病，則會造成茶葉大量減產(chǎn)。2017年10月到2018年1月分別在安徽、福建和湖北采集到茶葉斑病葉，其癥狀與Colletotrichum?spp.引起的茶炭疽病[4]癥狀相似。為弄清該茶樹葉斑病的病原，本研究對病原菌進行了分離與致病性測定，并通過形態(tài)學觀察和分子生物學手段對該病原菌進行種類鑒定，以期為該病害的監(jiān)測和防控提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?病樣采集及病菌分離

在安徽、福建和湖北省主要產(chǎn)茶區(qū)的9個茶樹品種（‘春蘭‘鄂茶1 號‘柿大茶黃種‘桃源大葉‘皖茶91‘白茶1號‘紫娟‘梅占‘五峰212）上采集癥狀相似的葉斑病葉，采用組織分離法[5]分離病原菌。取新鮮病葉，在病健交界處剪取1 cm2的小塊，在0.1%的升汞中消毒2 min，70%乙醇浸泡30 s，然后用無菌水沖洗3次，每次20 s，晾干，接種至PDA 平板上，在28℃黑暗條件下培養(yǎng)。待長出菌落后轉(zhuǎn)接到另一平板上純化培養(yǎng)，將純培養(yǎng)獲得的菌株保存到PDA 斜面?zhèn)溆谩?/p>

1.2?形態(tài)學觀察

將純化后的菌株在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后分別用6 mm的打孔器取菌餅轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基中央，在28℃黑暗條件下培養(yǎng)，于第3天和第7天觀察和記錄菌落形態(tài)和顏色，并用十字交叉法測量菌落直徑。菌株在PDA 培養(yǎng)基上產(chǎn)孢后，在光學顯微鏡下觀察菌落形態(tài)，記錄各菌株分生孢子的形態(tài)特征和大小。

1.3?分子鑒定

選取2株代表性菌株（EC?6和XBC1?3）對其進行ITS、gpd和tef?1a基因的擴增和序列分析，其中菌株EC?6分離于安徽廬江茶園的發(fā)病品種‘鄂茶1號，XBC1?3分離于宣城茶區(qū)的發(fā)病品種‘白茶1號。通過CTAB 法提取菌株的基因組DNA，然后以基因組DNA為模板，分別采用通用引物ITS1/ITS4[6]、gpd1/gpd2[7]和EF1?728F/EF1?986R[7]進行基因片段的PCR擴增，引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。PCR 擴增選用25 μL體系： 2×Es Taq Master Mix 12.5 μL，菌株DNA 2 μL，引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL。

ITS的PCR擴增反應條件： 94℃預變性90 s; 94℃變性20 s，59℃退火20 s，72℃延伸50 s，共30 個循環(huán); 72℃終延伸5 min。

gpd基因的PCR擴增反應條件：94℃預變性4 min;94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，共30 個循環(huán); 72℃終延伸5 min。

tef?1a 基因的PCR擴增反應條件： 94℃預變性5 min; 94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸90 s，共40個循環(huán); 72℃終延伸7 min。

擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將目的片段送至合肥擎科生物科技有限公司進行測序。將獲得的序列結(jié)果在NCBI（National Center for Biotechnology Information）數(shù)據(jù)庫中進行BLAST同源性搜索， 明確與測試菌株序列同源性高的參考菌株及其物種地位。

1.4?致病性測定

采用分生孢子懸浮液接種[8]進行致病性測定。將菌株在PDA 培養(yǎng)基上活化，用無菌水洗下分生孢子，調(diào)配成濃度為1×105個/mL的分生孢子懸浮液。以健康‘舒茶早的離體葉片和離體枝條上的葉片為材料，用滅菌的大頭針從葉片背面刺傷邊緣，然后將配制好的分生孢子懸浮液100 μL滴至葉片刺傷部位，以無菌水接種作為空白對照，每個菌株3 次重復。離體葉片接種后放置于鋪有保濕濾紙的滅菌培養(yǎng)皿中; 在離體枝條上接種葉片后，將離體枝條插入盛有蒸餾水的三角瓶中。將接種的茶葉片和枝條放于人工氣候箱中培養(yǎng)，設(shè)置溫度28℃，L∥D=12 h∥12 h，濕度為90%，并逐日對接種的葉片發(fā)病情況做觀察記錄。

2?結(jié)果與分析

2.1?病原菌分離

從安徽、福建和湖北省不同茶區(qū)的9 個茶樹品種上采集的病葉癥狀相似，表現(xiàn)為病斑紅褐色或棕褐色，部分葉片病斑中央灰白，病斑上散生有黑色霉點（圖1a～c）。采用組織分離法獲得了菌落形態(tài)一致的26株菌株。25℃下在PDA平板培養(yǎng)3 d后，菌落形態(tài)表現(xiàn)為正面致密，呈較規(guī)則圓形，菌落正面中央橄欖褐色，邊緣白色; 背面中央深褐色，邊緣白色，菌落直徑約42 mm×47 mm; 培養(yǎng)7 d后，菌落直徑約72 mm×72 mm，分生孢子為卵形或倒棍棒形，褐色至黃褐色，大小為（18.0～30.0） μm×（4.0～15.0） μm，橫隔膜1～3 個， 縱斜隔膜1～3個。短喙柱狀或錐狀（圖1d～f）。根據(jù)菌落和分生孢子形態(tài)學特征[8]，可初步認為獲得的分離菌株為鏈格孢屬Alternaria成員。

2.2?分子鑒定

以選取的代表性菌株EC?6和XBC1?3的基因組DNA為模板，分別PCR擴增ITS、gpd和tef?1a基因片段，其擴增片段大小分別約為560、580和280 bp（圖2）。將測序后得到的基因片段序列分別在NCBI網(wǎng)站進行BLAST分析。結(jié)果表明，菌株EC?6 的ITS、gpd和tef?1a基因序列（MH588262、MH593373和MH593371）與交鏈格孢A. alternata參考菌株CBS107.27 的序列 （KP124300， KP124157，KP125075）同源性分別為100%、99.0%和100%;菌株XBC1?3的ITS，gpd和tef?1a基因序列（MH588263、MH593374和MH593372）同樣與交鏈格孢CBS107.27表現(xiàn)出很高的序列同源性，其序列相似性分別達到100%、99.6%和100%。

2.3?致病性測定

將分離獲得的交鏈格孢菌株的分生孢子懸浮液，創(chuàng)傷接種到健康‘舒茶早離體葉片和離體枝條上的葉片，接種7 d后，接種葉片上環(huán)繞接種點出現(xiàn)明顯的紅褐色病斑，病斑直徑1～3 cm; 接種14 d后，病斑中央變?yōu)榛野咨?，病斑直徑擴展至2～4 cm。接種無菌水的對照組則未觀察到病斑（圖3）。采用組織分離法從接種發(fā)病的葉片上再次分離病原菌，可分離獲得與原始接種病原菌菌落形態(tài)一致的菌落，經(jīng)形態(tài)學觀察和ITS序列分析證實是最初接種的交鏈格孢，完成柯赫氏法則驗證。這表明交鏈格孢是引起茶樹葉斑病的致病因子。

3?討論

迄今全世界已發(fā)表的鏈格孢種級分類單位500 個左右，廣泛分布于自然界中，該類群菌既是動植物內(nèi)生菌，也可以是動植物病原菌。李秀凱曾報道交鏈格孢可引起甲癬[9]。鏈格孢形態(tài)特征醒目，易于辨認至屬，但種間變異幅度大，難以確定到種[910]。在真菌學研究中，傳統(tǒng)的真菌鑒定主要依靠菌落、分生孢子和子實體的形態(tài)特征等來鑒定。Simmons主張以三維產(chǎn)孢表型作為區(qū)分小孢子鏈格孢的指標之一，但需要操作者有足夠的經(jīng)驗[9]。除了傳統(tǒng)的形態(tài)學方法，近年來有越來越多的學者采用了多基因鑒定的方法對鏈格孢屬真菌進行區(qū)分和鑒定[11]。嚴進等[12]研究發(fā)現(xiàn)ITS和gpd基因序列可以將鏈格孢屬中大孢子種群和小孢子種群區(qū)分開。本文采用ITS、gpd和tef?1a 3個基因序列對分離菌株進行分析和鑒定，結(jié)合形態(tài)學特征將引起茶樹葉斑病的致病菌鑒定為交鏈格孢A. alternata。

國內(nèi)外關(guān)于鏈格孢引起茶樹葉部病害的報道很少，目前僅有兩篇文獻報道了由交鏈格孢引起的茶樹葉斑病[1314]，而對該病原在茶園的流行規(guī)律尚不清楚。2005年在印度孟加拉北部地區(qū)的茶園苗圃中品種‘T?17出現(xiàn)葉斑病，超過70%的茶苗葉片受到了感染，經(jīng)鑒定確定為由交鏈格孢引起[13];2012年在中國湖北省羅田縣茶樹未知品種的嫩葉上發(fā)生葉斑病，超過20%的嫩葉受到了感染，后經(jīng)鑒定為交鏈格孢引起[14]。在本研究中，筆者在湖北、福建和安徽茶園的多個茶樹品種上發(fā)現(xiàn)由交鏈格孢引起的茶樹葉斑病，表明致病性鏈格孢在茶樹品種上的?；圆粡姡軌蚯秩敬蠖鄶?shù)茶品種，不同茶品種對交鏈格孢的抗病性急需進一步深入研究。

在前人的研究中，鏈格孢一直被視為茶樹內(nèi)生菌[15]。內(nèi)生菌通常被認為是存在于健康的植物體內(nèi)并不引起植物致病的一類微生物。游見明研究發(fā)現(xiàn)，在四川省茶樹葉片中，鏈格孢是優(yōu)勢內(nèi)生菌群[1617]。然而，隨著對茶樹病害種類的廣泛調(diào)查和研究深入，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)交鏈格孢可以引起茶樹葉斑病。此外，在對茶園病害調(diào)查中，由交鏈格孢引起的茶樹葉斑病和由炭疽菌復合群引起的茶樹炭疽病癥狀極其相似，很容易混淆。因此，在茶園生產(chǎn)和管理過程中，有必要深入調(diào)查兩種病害的發(fā)病特點和流行規(guī)律，因地制宜地制定病害防治措施，防止由交鏈格孢引起的葉斑病在不同茶園大面積發(fā)生和流行。

參考文獻

[1]?季鵬章，張俊，王平盛，等.云南古茶樹（園）遺傳多樣性的ISSR分析[J].茶葉科學，2007（4）：271279.

[2]?孫曉玲.中國重要茶樹葉部病害的研究現(xiàn)狀及展望[J].中國茶葉，2016，38（12）：1213.

[3]?陳宗懋，陳雪芬.世界茶樹病原名錄[J].茶葉科學，1988（2）：6576.

[4]?劉威，葉乃興，陳玉森，等.茶樹炭疽菌Colletotrichum fructicola的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J].茶葉科學，2014，34（1）：95104.

[5]?方中達.植病研究方法[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998：122142.

[6]?陳鳳毛.真菌ITS區(qū)序列結(jié)構(gòu)及其應用[J].林業(yè)科技開發(fā)，2007（2）：57.

[7]?DENG Jianxin， PAUL N C， PARK M S， et al. Molecular characterization， morphology， and pathogenicity of Alternaria panax， from araliaceous plants in Korea [J]. Mycological Progress， 2013， 12（2）： 383396.

[8]?WOUDENBERG J H C，GROENEWALD J Z，BINDER M，et al.Alternaria redefined [J].Studies in Mycology，2013，75（1）：171.

[9]?張?zhí)煊?鏈格孢屬[M].中國真菌志.第十六卷.北京：科學出版社，2003：125.

[10]王洪凱，張?zhí)煊?，張?應用5.8S rDNA及ITS區(qū)序列分析鏈格孢種級分類[J].菌物系統(tǒng)，2001（2）：168173.

[11]ZHANG L X， SHI Y R， YU J H， et al. First report of leaf blight caused by Alternaria alternata on Trichosanthes kirilowii Maxim in China [J]. Plant Disease， 2016， 100（5）： 1021.

[12]嚴進， 施宗偉， 宋福， 等. 河北和山東鴨梨果實上鏈格孢菌鑒定[J]. 植物保護學報， 2009， 36（1）： 3743.

[13]CHAKRABORTY B N， DASBISWAS R， SHARMA M. Alternaria alternata—a new foliar fungal pathogen of tea in North Bengal， India [J]. Plant Pathology， 2006， 55（2）： 303.

[14]ZHOU L X， XU W X. First report of Alternaria alternata causing leaf spots of tea （Camellia sinensis） in China [J]. Plant Disease， 2014， 98（5）： 697.

[15]王雪萍，譚榮榮，曹丹，等.茶樹內(nèi)生真菌研究進展[J].湖北農(nóng)業(yè)學報，2015，54（23）：58085812.

[16]游見明.茶樹中內(nèi)生菌的動態(tài)分布[J].廣西植物，2008，28（1）：8285.

[17]游見明.茶樹內(nèi)生菌的分離[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2009，48（5）：11681170.

（責任編輯：田?喆）