劉娟娟 李平 江幸福 程云霞 張蕾

摘要 ：保幼激素（juvenile hormone， JH）是由咽側(cè)體分泌的倍半萜類化合物，可以調(diào)控昆蟲的很多生理過程，如發(fā)育、變態(tài)、生殖等。作為bHLH?PAS（helix?loop?helix?Per?ARNT?Sim）轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一的methoprene?tolerant （Met）是JH的受體，在JH的信號傳導(dǎo)過程中有非常重要的作用。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)合RNAi技術(shù)測定了沉默Met基因后黏蟲Mythimna separata的Vg基因表達(dá)、卵巢發(fā)育和生殖行為，旨在探究Met基因在黏蟲生殖過程中的功能。結(jié)果表明當(dāng)Met基因沉默后，與卵巢發(fā)育密切相關(guān)的卵黃原蛋白（vitellogenin， Vg）基因表達(dá)量下調(diào)了50%，從而顯著抑制了卵巢發(fā)育，并導(dǎo)致產(chǎn)卵顯著延遲、產(chǎn)卵歷期顯著縮短，產(chǎn)卵量顯著下降。結(jié)果表明Met基因是黏蟲生殖發(fā)育過程中的關(guān)鍵受體基因，它通過調(diào)節(jié)后續(xù)Vg的表達(dá)和沉積，來達(dá)到控制卵巢發(fā)育，從而調(diào)控生殖作用。

關(guān)鍵詞 ：黏蟲;?保幼激素;?Met;?卵黃原蛋白;?生殖

中圖分類號：

Q965

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2019113

Function of methoprene?tolerant genes in the reproduction of Mythimna separata

LIU Juanjuan1，?LI Ping2，?JIANG Xingfu1，?CHENG Yunxia1，?ZHANG Lei1

（1. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection， Chinese Academy of

Agricultural Sciences， Beijing?100193， China; 2. Nanjing Agricultural University， Nanjing?210095， China）

Abstract

Juvenile hormone （JH） is a sesquiterpene compound secreted by the corpus allatum and can regulate many physiological processes of insects， such as development， metamorphosis， reproduction， etc. Methoprene?tolerant （Met）， belonging to the family of the basic helix?loop?helix?Per?ARNT?Sim （bHLH?PAS）transcription factors， is most likely the receptor of juvenile hormone （JH） and plays a crucial role in JH signaling pathway. In this study， we used qPCR combined with RNAi to determine the expression of Vg gene， ovarian development and reproductive behavior in M.separata after silencing Met gene， aiming to explore the functions of Met in the reproduction of M.separata. The results showed that， when Met gene was silenced， the expression of Vg gene， which is closely related to ovarian development， was down?regulated by 50%， leading to the significant inhibition of ovarian development， the delay of oviposition and the decrease of oviposition period and egg production. The results indicated that the Met gene is a key receptor gene in the process of reproductive development of M.separata. It regulates the expression and deposition of Vg to control ovarian development and regulate reproduction in M.separata.

Key words

Mythimna separata;?juvenile hormone;?methoprene?tolerant;?vitellogenin;?reproduction

生殖是昆蟲在生態(tài)系統(tǒng)中維持種群繁衍的基本特性[1]。保幼激素（juvenile hormone， JH）是由昆蟲的咽側(cè)體分泌的倍半萜類化合物，參與調(diào)控昆蟲生長、發(fā)育、變態(tài)、滯育和繁殖等多個(gè)過程。在雌性成蟲中JH通過控制卵黃原蛋白的合成和攝取來調(diào)控昆蟲的生殖行為[2]。研究發(fā)現(xiàn)棉鈴象甲Anthonomus grandis、德國小蠊Blattella germanica、赤擬谷盜Tribolium castaneum咽側(cè)體分泌的JH通常誘導(dǎo)卵黃原蛋白（vitellogenin，Vg）在脂肪體中合成，分泌到血淋巴中，進(jìn)而被卵母細(xì)胞吸收[35]。此外，對蟑螂和蝗蟲外源點(diǎn)滴保幼激素類似物后，可以誘導(dǎo)卵黃原蛋白在脂肪體內(nèi)大量合成[69]。

研究表明，JH需要通過受體才能發(fā)揮作用。前期對許多昆蟲的JH信號傳導(dǎo)的分子機(jī)制研究表明作為bHLH?PAS轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一的Met（methoprene?tolerant）最有可能為JH的受體。RNAi干擾赤擬谷盜Met基因后，出現(xiàn)了早熟蛹[10]。Met與JH共同調(diào)節(jié)著昆蟲的生殖、卵巢的發(fā)育和Vg的合成。雙翅目果蠅Met突變體[1112]以及RNAi干擾Met基因后的埃及伊蚊[1314]都表現(xiàn)出卵巢發(fā)育遲緩和生殖力下降。在太平洋碩蠊Diploptera punctata和臭蟲Cimex lectularius中，Met基因被沉默后顯著降低了Vg信使RNA （mRNA）的表達(dá)[1516]。在直翅目東亞飛蝗 Locusta migratoria中已經(jīng)證實(shí)JH通過Met基因控制卵黃發(fā)生和卵母細(xì)胞成熟[17]。

黏蟲Mythimna separata是一種典型遠(yuǎn)距離遷飛害蟲，寄主植物達(dá)100多種，是嚴(yán)重威脅我國玉米、小麥和水稻三大主糧生產(chǎn)的重大害蟲。新中國成立后黏蟲多次暴發(fā)成災(zāi)并造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展[18]。前期研究發(fā)現(xiàn)，JH調(diào)控貫穿在黏蟲遷飛和生殖的過程中。黏蟲在性成熟前開始遷飛，經(jīng)過長距離遷飛后遷入種群的JH和卵巢發(fā)育級別均高于遷出種群[1920]。羽化后1日齡飛行顯著提升咽側(cè)體（corpus allatum，CA）的活性，加速飛行肌降解[21]。1日齡點(diǎn)滴JH類似物（juvenile hormone analogue， JHA）使產(chǎn)卵提前，飛行能力下降;1日齡是JH作用的關(guān)鍵時(shí)期[22]。此外，羽化后1日齡黏蟲Met基因的表達(dá)量顯著高于其他日齡，且黏蟲飛行2個(gè)夜晚后卵巢內(nèi)Met表達(dá)量顯著提高[23]。因此明確JH在黏蟲生殖過程中的信號傳導(dǎo)途徑，可以提高黏蟲的預(yù)測預(yù)報(bào)和防控水平。在本研究中，利用RNA干擾技術(shù)，抑制Met基因的表達(dá)，從而明確了Met在黏蟲生殖過程中的功能。

1?材料方法

1.1?試驗(yàn)材料

供試?yán)ハx：野外采集黏蟲成蟲在實(shí)驗(yàn)室繁殖1、2代后的成蟲供試。幼蟲采用約40 cm高的玉米葉飼養(yǎng)，飼養(yǎng)密度為10頭/瓶，溫度為24℃，光周期為L∥D=14 h∥10 h，相對濕度為70%左右[24]。

主要儀器和試劑：熒光定量7500 Real?time PCR（ABI公司，美國）;微量注射儀（WPI公司，美國）。TRIzol試劑（Invitrogen公司，美國）;反轉(zhuǎn)錄試劑盒FastQuant RT Kit（with gDNase）（天根生物科技有限公司，北京）;實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒SuperReal PreMix Plus（SYBRGreen）（天根生物科技有限公司，北京）;普通引物合成（生工生物工程股份有限公司，上海）;Taq Master Mix（Dye Plus）（諾唯贊生物科技有限公司，南京）;基因干擾引物（銳博生物科技有限公司，廣州）。

1.2?試驗(yàn)方法

RNAi引物設(shè)計(jì)與合成：利用NCBI及黏蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫查找出Met基因（登錄號：MH050927.1）序列，由銳博生物有限公司（廣州）公司設(shè)計(jì)并合成3條Met基因的siRNA片段及1條與黏蟲任何基因的轉(zhuǎn)錄本都不同源的陰性對照（NC）siRNA片段（表1）。

RNAi引物篩選：注射日齡為初羽化1日齡，注射濃度為0.1 nmol/μL，體積為2 μL，注射部位為雌蛾腹部第5～6節(jié)間膜，取樣時(shí)間為注射后24、48、72 h。共設(shè)置5組處理，每組處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。其中以注射相同體積的無RNA酶水為空白對照，以NC為陰性對照0.1 nmol/μL，以siRNA?1、siRNA?2、siRNA?3為Met基因RNA干擾處理組。注射后解剖卵巢取樣，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測對Met基因的干擾效果，沉默效率=（1-基因沉默后組織中Met基因的表達(dá)量/清水對照組織中Met基因的表達(dá)量）×100%。篩選出沉默效率最高的siRNA片段及注射后時(shí)間。

Met基因的功能驗(yàn)證：根據(jù)以上引物篩選結(jié)果，選取抑制效果最佳的Met基因的siRNA片段，選擇初羽化1日齡雌蛾進(jìn)行注射，以注射siRNA的黏蟲為處理，注射濃度為0.1 nmol/μL，體積為2 μL;以注射相同濃度和體積NC的黏蟲作為陰性對照;以注射相同體積的無RNA酶水作為對照;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測定RNA干擾48 h后Vg基因的相對表達(dá)量，研究Met基因表達(dá)被抑制后卵巢發(fā)育情況;此外，注射后立即與雄蛾一比一配對，每日飼喂5%新鮮蜂蜜水直至成蟲死亡，記錄產(chǎn)卵前期、總產(chǎn)卵量、產(chǎn)卵歷期、交配次數(shù)等參數(shù)。

1.2.1?總RNA的提取及cDNA的合成

取處理后雌蛾的卵巢3對放入無RNA酶離心管中，利用TRIzol方法提取總RNA。用無RNA酶水溶解后，用NanoDrop分光光度計(jì)測定核酸濃度以及OD260/OD280。參照Transcriptor First Strand cDNA Synthesis試劑盒（天根生物科技有限公司，北京）合成cDNA。

1.2.2?實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)

從黏蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫及NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫獲得黏蟲Vg基因（登錄號：KF501044.1）和Met基因序列，由上海生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并篩選出比較合理的引物Met?qF/Met?qR、Vg?qF/Vg?qR，用于qPCR試驗(yàn)。內(nèi)參基因選擇黏蟲β?actin基因[2526]（登錄號：GQ856238.1）。

本試驗(yàn)采用的方法是SYBR Green法。每個(gè)處理有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)及3個(gè)技術(shù)重復(fù)。熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性15 min后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，循環(huán)條件包括95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸32 s;Met基因的反應(yīng)體系：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，上下游引物各0.6 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA模板2 μL，加RNAase?free ddH2O補(bǔ)齊至20 μL。Vg基因的反應(yīng)體系：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，上下游引物各0.8 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA模板2 μL，加RNAase?free ddH2O補(bǔ)齊至20 μL。

1.2.3?數(shù)據(jù)處理與分析

使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)得到的參數(shù)均由均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。通過2-△△Ct法對黏蟲Met和Vg基因定量測定數(shù)據(jù)中的Ct值進(jìn)行處理分析。所有數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析（one?way ANOVA），平均數(shù)多重比較使用Tukeys HSD法，差異顯著性檢驗(yàn)水平為P<0.05。

2?結(jié)果與分析

2.1?siRNA片段的篩選

從Met基因熒光定量的結(jié)果（圖1）可以看出：3個(gè)處理時(shí)間的結(jié)果中陰性對照與清水對照沒有顯著性的差異;注射后24 h，siRNA?1、siRNA?2、siRNA?3 3條片段均無顯著的沉默效果（F4，40=3.719， P=0063），片段siRNA?2沉默效率最高，為64%;注射后48 h，片段siRNA?2有顯著的沉默效果（F4，40=6.257， P<0.05），其中片段siRNA?2的沉默效率可達(dá)80%以上;注射后72 h，片段siRNA?2仍有顯著的沉默效果但沉默效率下降（F4，40=12.253， P<0.05），其中片段siRNA?2的沉默效率降為58%。因此，片段siRNA?2對Met基因的沉默效率最高，并且處理后48 h沉默效果最佳。

2.2?Met基因干擾后對Vg基因表達(dá)量以及卵巢發(fā)育的影響

通過以上siRNA片段的篩選結(jié)果，采用片段siRNA?2干擾Met基因48 h后，Vg基因的表達(dá)量顯著下調(diào)（F2，6=15.402， P=0.004），與清水對照相比下調(diào)了約50%;陰性對照與清水對照相比Vg基因的表達(dá)量沒有顯著性變化（圖2）。從圖3可以看出，干擾Met基因后，卵巢的發(fā)育級別與對照相比顯著降低（F2，57=10.091， P<0.05）。從圖4可以看出，Met基因被干擾48 h后，卵巢的發(fā)育顯著減緩，卵巢管透明，卵粒還未形成，卵黃尚未沉積，卵巢的發(fā)育級別多數(shù)為1級;清水對照卵巢的發(fā)育級別多數(shù)為2級，卵巢管為白色，卵巢管中已形成卵粒。

2.3?Met基因干擾對黏蟲生殖和壽命的影響

如圖5所示，黏蟲成蟲的Met基因被沉默后，對黏蟲的產(chǎn)卵前期有顯著影響（F2，57=4.756， P<005）， 產(chǎn)卵前期與對照相比延長了0.61 d，且差異顯著;陰性對照與清水對照相比沒有顯著性差異。從表3可以看出，干擾成蟲的Met基因后，對交配次數(shù)（F2，57=1.307， P=0.261）、雌蟲壽命（F2，57=2.355， P=0103）均無顯著影響;但與清水對照相比，產(chǎn)卵量（F2，57=7.467， P<0.05）顯著下降，產(chǎn)卵歷期（F2，57=5.880， P<0.05）顯著縮短（縮短了0.78 d），交配率下降了27百分點(diǎn)。

3?討論

在本研究中發(fā)現(xiàn)，干擾黏蟲的Met基因48 h后，Vg基因的表達(dá)量顯著下調(diào)。有研究顯示，鞘翅目赤擬谷盜Met基因被干擾后卵子發(fā)生受阻以及Vg的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)[5]，與本研究結(jié)果相符。此外，干擾雌性成蟲的Met基因后，顯著抑制了黏蟲卵巢的發(fā)育和生殖。這與大猿葉蟲Colaphellus bowringi Baly和褐飛虱Nilaparvata lugens Stl的相關(guān)研究相符， 沉默大猿葉蟲和褐飛虱的Met基因后都表現(xiàn)出卵巢發(fā)育遲緩，且褐飛虱的產(chǎn)卵前期顯著延長，產(chǎn)卵量顯著下降[2728]。黏蟲Met基因表達(dá)被抑制后，JH不能與受體結(jié)合，JH下游的信號傳導(dǎo)受阻，抑制了Vg基因的表達(dá)，從而影響雌性個(gè)體的生殖和卵巢的發(fā)育。保幼激素（JH）的主要功能是促進(jìn)Vg在雌性成蟲脂肪體中的合成，Vg分泌到血淋巴中，被卵母細(xì)胞吸收，從而促進(jìn)卵巢的發(fā)育和成熟。正常的卵細(xì)胞生長依賴于卵母細(xì)胞大量攝取Vg。因此，根據(jù)結(jié)果推斷，在干擾黏蟲的Met基因后，JH的信號傳導(dǎo)通路受阻，Vg基因的轉(zhuǎn)錄受阻，表達(dá)量下降。卵母細(xì)胞由于不能攝取足夠的Vg，其發(fā)育和成熟受阻，從而抑制了卵巢的發(fā)育以及生殖。對飛蝗的研究發(fā)現(xiàn)，RNAi抑制Met基因表達(dá)后，不僅阻止了JH誘導(dǎo)Vg的表達(dá)、阻斷了卵巢發(fā)育和脂質(zhì)沉積，而且影響卵泡上皮細(xì)胞的大小以及降低了卵泡細(xì)胞的通暢性（卵泡開放），而卵泡細(xì)胞之間的細(xì)胞間空隙是將Vg轉(zhuǎn)移到卵母細(xì)胞所必需的通道[17]。此外，JH會(huì)影響DNA復(fù)制，RNAi抑制Met表達(dá)后，降低了飛蝗脂肪體細(xì)胞的倍數(shù)性和DNA含量進(jìn)而影響卵黃的形成和卵母細(xì)胞的成熟[2930]。

干擾大猿葉蟲Met基因后注射JHA，發(fā)現(xiàn)Vg1和Vg2相對表達(dá)均顯著下降[26]。在黏蟲的前期研究中發(fā)現(xiàn)羽化后1日齡點(diǎn)滴保幼激素類似物后，可以縮短產(chǎn)卵前期，卵巢的發(fā)育進(jìn)度顯著加快[23]。因此，為進(jìn)一步明確Met為JHA的受體，需要對Met基因干擾48 h后的初羽化黏蟲點(diǎn)滴JHA，測定對Vg基因表達(dá)量、卵巢發(fā)育以及產(chǎn)卵前期、產(chǎn)卵歷期的影響。通過點(diǎn)滴JHA的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明黏蟲JH通過受體Met基因促進(jìn)Vg基因的表達(dá)和卵巢的發(fā)育，從而進(jìn)一步證實(shí)Met在黏蟲生殖過程中的重要作用。通過一系列的結(jié)果中推斷出JH的受體Met基因在黏蟲生殖過程中對于JH的信號傳導(dǎo)以及功能的發(fā)揮有至關(guān)重要的作用。然而，黏蟲Met下游對卵黃生成作用以及卵母細(xì)胞成熟的分子調(diào)控機(jī)制仍不清楚。前期研究發(fā)現(xiàn)C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子Kr?h1 （Kruppel?homolog 1）是Met的直接靶標(biāo)基因[31]。沉默蟑螂的Met基因后不僅使Met mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)，也使它下游的靶基因Kr?h1的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低[16]。沉默赤擬谷盜Kr?h1基因后出現(xiàn)了早熟蛹，這與Met基因和合成JH的甲基轉(zhuǎn)移酶（JHAMT）下調(diào)的結(jié)果相似[3233]。因此，為了完善黏蟲JH下游卵黃發(fā)生和卵母細(xì)胞成熟的分子調(diào)控機(jī)制，需要進(jìn)一步研究Kr?h1在黏蟲生殖過程中的功能。

本研究發(fā)現(xiàn)干擾Met基因的表達(dá)后，阻礙了卵巢的發(fā)育和Vg基因的表達(dá)，抑制了生殖。因此，本研究結(jié)果表明JH通過與受體Met結(jié)合調(diào)控Vg的轉(zhuǎn)錄和卵巢的發(fā)育，進(jìn)而影響生殖。本研究證明了Met在黏蟲生殖中過程中的重要作用，對從生理和分子層面解析黏蟲遷飛致災(zāi)的調(diào)控機(jī)理、提高預(yù)測預(yù)報(bào)和防控水平具有重要意義。

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（責(zé)任編輯：田?喆）