趙效南 苑曉萌 張印 胡明 王文博 劉玉慶

摘要：本研究于2015—2016年從山東省主要乳制品生產(chǎn)城市的生鮮乳罐裝車中采集412份生鮮牛乳樣品，對(duì)其進(jìn)行金黃色葡萄球菌的分離鑒定，并采用微量肉湯稀釋法對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。結(jié)果表明，從412份生鮮牛乳中共分離到148株金黃色葡萄球菌，分離率為35.8%;金黃色葡萄球菌對(duì)青霉素的耐藥率最高，為77.7%，其次為紅霉素，耐藥率為58.1%，對(duì)萬古霉素和阿莫西林/克拉維酸的耐藥率較低，分別為0.7%和1.4%，所有菌株對(duì)利奈唑胺表現(xiàn)為敏感。本研究結(jié)果可為山東地區(qū)生鮮牛乳中金黃色葡萄球菌的監(jiān)測(cè)與防控，以及養(yǎng)殖場(chǎng)中抗生素的規(guī)范使用提供參考。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌;生鮮牛乳;污染狀況;耐藥性

中圖分類號(hào)：S432.4+2?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A?文章編號(hào)：1001-4942（2019）12-0096-04

Abstract?In the study， four hundred and twelve fresh milk samples were collected from the fresh milk canning trucks in the main dairy production cities of Shandong Province during 2015-2016. The S. aureus was isolated， identified and conducted antibiotic sensitivity tests by micro-broth dilution method. The results showed that 148 strains of S. aureus were isolated with the isolated rate as 35.8%. S. aureus had the highest resistance rate to penicillin as 77.7%， followed by erythromycin with the resistance rate as 58.1%， but had lower resistance rates to vancomycin and amoxicillin/clavulanic acid showing as 0.7% and 1.4%， respectively.All strains were sensitive to linezolid. The results could provide references for the monitoring and prevention of S. aureus in fresh milk， and regulate the use of antibiotics in farms of Shandong Province.

Keywords?Staphylococcus aureus; Fresh milk; Contamination Status; Antimicrobial resistance

金黃色葡萄球菌是一種條件性致病菌，常存在于環(huán)境以及人和動(dòng)物的皮膚和粘膜中[1]，可導(dǎo)致多種感染，包括關(guān)節(jié)炎、尿路感染、乳腺炎和亞臨床乳腺炎等，還可引起人體淺表皮膚感染甚至引發(fā)嚴(yán)重致命的侵入性疾病[2]，通常由生鮮牛乳和乳制品加工廠中分離得到[3]。

奶牛乳房炎在奶牛養(yǎng)殖業(yè)中發(fā)生最為普遍，被認(rèn)為是世界上最昂貴的奶牛疾病之一，通常由微生物引起，而金黃色葡萄球菌是該病最主要的致病菌[4]。患有乳房炎的奶牛通常會(huì)將大量細(xì)菌帶入牛奶供應(yīng)鏈中，被污染的牛奶可能含有能夠引起食物中毒的致病菌株，從而對(duì)公共安全造成危害[5]。目前，抗生素是治療金黃色葡萄球菌的主要藥物，但隨著大量使用，耐藥菌株不斷出現(xiàn)，甚至出現(xiàn)“超級(jí)細(xì)菌”[6]。近幾年，有關(guān)生鮮牛乳中金黃色葡萄球菌的耐藥性研究相對(duì)缺乏。因此，本研究從生鮮牛乳中進(jìn)行金黃色葡萄球菌的分離鑒定并對(duì)該細(xì)菌的耐藥性進(jìn)行分析，旨在為我國(guó)奶牛乳房炎治療選擇合適抗生素，同時(shí)為動(dòng)物性食品安全和人類公共健康提供合理的檢測(cè)數(shù)據(jù)。

1?材料與方法

1.1?樣品采集

2015—2016年，分別從山東省主要乳制品生產(chǎn)城市的生鮮乳罐裝車中采集412份生鮮牛乳樣品，其中濟(jì)南市130份、濰坊市114份、日照市14份、泰安市62份、德州市32份、臨沂市60份。每輛運(yùn)輸車取樣1次，取樣前需攪拌生鮮牛乳，將所取樣品置于冰盒中，立即帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌學(xué)分析。

1.2?金黃色葡萄球菌的分離與鑒定

分別對(duì)412份生鮮牛乳樣品進(jìn)行倍比稀釋，再涂布到Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基上，35℃需氧培養(yǎng)24～48 h。對(duì)于每個(gè)樣本，取4個(gè)具有典型金黃色葡萄球菌外觀特征（黑色外觀并被透明圈包圍）的菌落進(jìn)行純化，再通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行確定，并用甘油保存于-20℃。

1.3?藥敏試驗(yàn)

采用美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute， CLSI）推薦的微量肉湯稀釋法，對(duì)試驗(yàn)分離鑒定的金黃色葡萄球菌進(jìn)行18種抗菌藥物最小抑菌濃度的測(cè)定?？咕幬锇ǎ呵嗝顾亍⒛髁?克拉維酸、紅霉素、克林霉素、恩諾沙星、氧氟沙星、頭孢噻呋、頭孢西丁、磺胺異惡唑、苯唑西林、萬古霉素、復(fù)方新諾明、多西環(huán)素、氟苯尼考、泰妙菌素、替米考星、慶大霉素、利奈唑胺。以大腸埃希菌ATCC25922作為藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株，結(jié)果判定及質(zhì)量控制按2018年CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[7]，將所有金黃色葡萄球菌分為S（敏感）、I（中度敏感）和R（耐藥）。本試驗(yàn)抗生素判定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.4?數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2016軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?金黃色葡萄球菌的分離鑒定結(jié)果

經(jīng)鑒定，412份生鮮牛乳中共分離出148株金黃色葡萄球菌，分離率為35.9%（表2）。

2.2?藥敏試驗(yàn)結(jié)果

本試驗(yàn)采用微量肉湯稀釋法，對(duì)148株金黃色葡萄球菌進(jìn)行了18種抗生素藥物敏感性檢測(cè)。結(jié)果（表3）顯示，金黃色葡萄球菌對(duì)青霉素的耐藥率最高，為77.7%;其次為紅霉素，耐藥率為58.1%;對(duì)克林霉素和磺胺異惡唑的耐藥率均為37.8%;對(duì)萬古霉素和阿莫西林/克拉維酸的耐藥率較低，分別為0.7%和1.4%，而所有菌株均對(duì)利奈唑胺表現(xiàn)為敏感。

3?討論與結(jié)論

金黃色葡萄球菌對(duì)牛群和生鮮牛乳的污染是乳制品生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的一個(gè)重要問題[8]。Hennekinne等[9]認(rèn)為乳品廠原料乳中金黃色葡萄球菌的存在，是乳制品食品鏈的潛在威脅，污染嚴(yán)重可導(dǎo)致食源性疾病的爆發(fā)。Asao等[10]報(bào)道的史上最大的食源性疾病爆發(fā)的起因就是食品中細(xì)菌的污染，涉及13 420名感染者。此外，乳品業(yè)的成本負(fù)擔(dān)巨大，牛群動(dòng)物的乳房炎會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)奶量顯著下降，相關(guān)的獸醫(yī)和治療成本也會(huì)大大增加，在某些情況下需要宰殺病牛[9]。因此，本研究對(duì)生鮮牛乳中金黃色葡萄球菌的分離鑒定和藥物敏感性檢測(cè)結(jié)果，可在一定程度上了解生鮮牛乳中金黃色葡萄球菌的污染情況和耐藥性，為生產(chǎn)中藥物使用提供幫助，具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究生鮮牛乳中金黃色葡萄球菌的分離率為35.9%，高于杜琳等[11]報(bào)道的從內(nèi)蒙古自治區(qū)等五省區(qū)牛乳中金黃色葡萄球菌12.1%的分離率，但低于田會(huì)麗等[12]報(bào)道的石河子地區(qū)的70.83%的分離率，與吳星星等[13]報(bào)道的烏魯木齊地區(qū)生鮮牛乳中金黃色葡萄球菌33.7%的分離率結(jié)果相當(dāng)。而國(guó)外生鮮牛乳中金黃色葡萄球菌的分離情況希臘西北部為40%[14]，意大利為53.5%[15]，美國(guó)為62.0%[16]，巴西為56.0%[17]。因此，金黃色葡萄球菌分離率的不同可能跟樣本量大小、樣品儲(chǔ)存方法、分離方法、地區(qū)和季節(jié)等因素有關(guān)。

本研究中，148株金黃色葡萄球菌對(duì)大部分抗生素呈現(xiàn)不同程度的耐藥性。它們對(duì)青霉素的耐藥率最高，為77.7%，低于闞秋琪等[18]研究的江蘇省某奶牛場(chǎng)金黃色葡萄球菌對(duì)青霉素的耐藥率（100%），但高于McMillan等[19]報(bào)道的維多利亞地區(qū)對(duì)青霉素15.4%的耐藥率，這可能與奶牛養(yǎng)殖過程中青霉素使用量或使用不合理有關(guān);對(duì)紅霉素的耐藥率為58.1%，稍高于吳星星等[13]?研究的對(duì)紅霉素40.0%的耐藥率，但低于邱梅等[20]報(bào)道的對(duì)紅霉素100%的耐藥率;對(duì)利奈唑胺、萬古霉素和阿莫西林/克拉維酸耐藥率較低，與王秋冬等[21]的檢測(cè)結(jié)果一致，這與養(yǎng)殖場(chǎng)中較少使用這些抗生素有關(guān)。

綜合分析可知，山東地區(qū)生鮮牛乳中金黃色葡萄球菌污染比較嚴(yán)重，并且該菌耐藥性存在差異，因而建議生產(chǎn)上應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況合理使用抗生素，同時(shí)加強(qiáng)對(duì)生鮮牛乳中金黃色葡萄球菌的監(jiān)控。

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