劉少丹 ，閔濤 ，辛國斌 ，張大明

（1.迪安鑒定科學研究院，浙江 杭州 310000；2.上海迪安司法鑒定有限公司，上海 200000；3.北京市公安司法鑒定中心，北京 100192）

法醫(yī)毒物分析中，氣相色譜-質譜（gas chroma?tography-mass spectrometry，GC-MS）定性分析結果的確認主要基于兩部分：一是保留時間的確認；二是質譜數據的分析。質譜數據的分析需要在確認保留時間的前提下進行。離子豐度比是指物質的特征碎片離子的豐度與基峰豐度的比值。通常特征碎片離子相對豐度的確認指標是根據相對豐度或離子豐度比的大小分段進行比較的，目前最常見的分段是按照特征碎片離子相對豐度或離子豐度比的大小將其分為4段，各段有其相應的最大允許偏差[1-8]。但是目前也有一些指南的判定不考慮相對豐度或離子豐度比的大小[9-14]。國家標準[15-17]中，要求質譜特征碎片離子及相對豐度一致；行業(yè)標準[18]中，則要求譜庫檢索匹配率不低于90%。另一行業(yè)標準[19]僅要求生物樣本中出現相應特征碎片離子即可，對相對豐度沒有提出要求。雖然近年來發(fā)布的標準方法、規(guī)范或指南性文件中，不同應用領域均對色譜-質譜定性判斷給出了明確的判定要求，但是各標準差異較大，即使是同領域的不同標準[4，14]也存在差異，尚不明確其定性判定要求的具體數值因何而來。同時，多數指南均提出待檢樣本應與空白添加標準物質或標準物質溶液在可比較的濃度、同一批處理及相同的條件下測定[1-5，9-17]。da SILVA[20]運用氣相色譜-串聯質譜（gas chromatog?raphy-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）研究2種農藥檢出限水平的色譜質譜圖，采用貝葉斯定理分析數據，發(fā)現相對豐度的偏差無法設定為一個具體數值，只有藥物濃度在檢測限（limit of examination，LOE）以上時才有陽性的可能。MOL等[21]運用不同的液相色譜-質譜儀研究蔬菜水果中農藥的離子豐度比的最大允許相對偏差，判定范圍為±45%，但是該實驗沒有考慮濃度與離子豐度比偏差的關系。另外，質譜數據的分析不僅與待測物質濃度有關，還需考慮其他因素，如選擇合適的特征離子（峰）的數量。多數指南[1-5，9-13，15-17]中要求，在全掃描或者選擇離子監(jiān)測（se?lected ion monitor，SIM）模式下需選擇至少3個碎片，同時要求所選擇的特征離子的信噪比（S/N）必須大于3。在此基礎上，本研究通過采用GC-MS全掃描模式對地西泮、艾司唑侖、敵敵畏和甲拌磷4種常見藥（毒）物進行檢測，以探討GC-MS檢測血樣中常見藥（毒）物特征碎片離子的離子豐度比的最大允許偏差，以期為質譜定性判斷提供科學可靠的實驗數據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

GCMS-TQ8030三重四極桿氣質聯用儀（日本島津公司），7890A-5875C氣相色譜-質譜聯用儀（美國Agilent公司），3-30K高速冷凍離心機（德國Sigma公司），PL2002-IC電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］，10-XC-88L醫(yī)用低溫箱（合肥市齊美電器有限公司）。

敵敵畏、甲拌磷、地西泮和艾司唑侖標準品（1 mg/mL）均購于中國計量科學研究院，磷酸三丁酯（99.8%）和鹽酸雙苯戊二氨酯（SKF525A，99.8%）均購于美國Sigma公司，甲醇、乙醇及乙酸乙酯為分析純。

1.2 GC-MS條件

GC-MS條件1和GC-MS條件2在實驗室1（Lab1）進行，GC-MS條件3在實驗室2（Lab2）進行。

1.2.1 GC-MS條件1

GCMS-TQ8030三重四極桿氣質聯用儀，色譜柱為Rxi-5MS毛細管柱（30m×0.25mm，0.25μm）；柱溫：初始溫度100℃，保持1 min，升溫速率為10℃/min，至280℃保持5 min；載氣為He，流速1 mL/min；分流進樣，分流比10∶1，進樣體積1μL。

質譜條件：電子轟擊（electron impact，EI）離子源，電子束能量70 eV，離子源溫度250℃，接口溫度270℃，溶劑延遲時間為2min；掃描方式為全掃描，掃描范圍m/z50～450。

1.2.2 GC-MS條件2

GCMS-TQ8030三重四極桿氣質聯用儀，色譜柱為DB-5MS毛細管柱（30m×0.32mm，0.25μm）；柱溫：初始溫度80℃，保持2 min，升溫速率為10℃/min，至280℃保持5 min；載氣為He，流速1 mL/min；分流進樣，分流比10∶1，進樣體積1μL。

質譜條件同1.2.1節(jié)所述質譜條件。

1.2.3 GC-MS條件3

7890A-5875C氣相色譜-質譜聯用儀，色譜柱為DB-5MS毛細管柱（30m×0.25mm，0.25μm）；柱溫：初始溫度100℃，保持1 min，升溫速率為10℃/min，至230℃保持5 min；載氣為He，流速1 mL/min；分流進樣，分流比10∶1，進樣體積1μL。

質譜條件同1.2.1節(jié)所述質譜條件。

1.3 標準溶液的配制

用甲醇配制質量濃度為100 μg/mL的甲拌磷和敵敵畏混合標準儲備液A，用乙醇配制質量濃度為100 μg/mL的地西泮和艾司唑侖混合標準儲備液B，分別置于-20℃冰箱冷凍保存。使用時按需稀釋成不同質量濃度的標準工作液。

用乙醇配制質量濃度均為1 mg/mL的磷酸三丁酯、SKF525A內標儲備液，分別置于-20℃冰箱冷凍保存。使用時稀釋成10μg/mL的內標標準工作液。

分別取適量混合標準儲備液A，逐級稀釋成質量濃度為 0.5、1.0、2.0、5.0和10.0 μg/mL 的混合標準工作液，每個工作液中均含有2μg/mL的內標磷酸三丁酯，同一質量濃度制備12個。

分別取適量混合標準儲備液B，逐級稀釋成質量濃度為 0.5、1.0、2.0、5.0和10.0 μg/mL 的混合標準工作液，每個工作液中均含有1μg/mL的內標SKF525A，同一質量濃度制備12個。

1.4 樣品前處理

樣品前處理程序：移取血液0.5mL，加1mL乙酸乙酯，超聲10 min混勻，-4℃下以10 397×g離心5 min，移取上清液600 μL，添加200 μL不同質量濃度的標準工作液和200μL內標工作液，搖勻后，取1μL進樣。

抽取編號為1～20的20個來源的空白血樣，配制成質量濃度為0、1.0、2.0、5.0 μg/mL的甲拌磷和敵敵畏混合加標血樣，同一質量濃度的加標血樣在每個來源的血樣中均制備3個。抽取編號為21的空白血樣，按照上述前處理過程配制成質量濃度為0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0μg/mL的甲拌磷和敵敵畏混合加標血樣，同一質量濃度的加標血樣制備11個。上述樣本以Lab1的GC-MS條件1進樣。共71個空白血樣，235個加標血樣。

抽取編號為1～20的20個來源的空白血樣，配制成質量濃度為0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL的地西泮和艾司唑侖混合加標血樣，同一質量濃度的加標血樣在每個來源的血樣中均制備6個。上述樣本以Lab1的GC-MS條件2進樣。共120個空白血樣，600個加標血樣。

抽取編號為1～20的20個來源的空白血樣，配制成質量濃度為0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL的甲拌磷和敵敵畏混合加標血樣，同一質量濃度的加標血樣在每個來源的血樣中均制備3個。上述樣本以Lab2的GC-MS條件3進樣。共60個空白血樣，300個加標血樣。

根據預實驗結果，血樣添加甲拌磷和敵敵畏的檢出限（limit of detection，LOD，信噪比大于3）和2倍檢出限（2LOD）分別為0.05μg/mL和0.10μg/mL，血樣添加甲拌磷和敵敵畏的定量限（limit of quantitation，LOQ，信噪比大于10）和2倍定量限（2LOQ）分別為0.15 μg/mL和0.30 μg/mL；血樣添加地西泮和艾司唑侖的LOD和2LOD分別為0.03 μg/mL和0.06 μg/mL，血樣添加地西泮和艾司唑侖的LOQ和2LOQ分別為0.10μg/mL和0.20μg/mL。配制相應質量濃度的血液添加樣本，每個質量濃度制備12個，共96個加標血樣，按照上述前處理方法進行前處理。分別以Lab1的GC-MS條件1和GC-MS條件2進樣。同時按照1.3節(jié)標準溶液的配制，制備相應質量濃度的混合標準溶液，每個質量濃度制備12個。

1.5 進樣順序

按照空白乙醇試劑、不同質量濃度混合標準工作液、不同濃度加標血樣的順序循環(huán)進樣，進樣過程中均按照0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0μg/mL的順序進樣，在10.0 μg/mL質量濃度后添加洗針步驟。Lab1共有835個加標血樣進樣，Lab2共有300個加標血樣進樣。

按照空白乙醇試劑、不同質量濃度檢出限混合標準工作液、不同濃度檢出限加標血樣的順序循環(huán)進樣。Lab1共有96個不同質量濃度的加標血樣進樣。

1.6 數據處理

本研究選擇的特征碎片離子如表1所示。由于標準品的離子豐度比與濃度和信噪比均相關，本研究為了更好地反映離子豐度比參考值（reference ion ratios，R-I-R）[21]，在分析標準品的離子豐度比與濃度關系時，選擇相對標準偏差（relative standard devia?tion，RSD）＜10%的離子豐度比，計算其平均值。在分析標準品的離子豐度比與信噪比關系時，選擇信噪比大于100的離子豐度比，計算其平均值。

表1 常見藥（毒）物的特征碎片離子

加標血樣的離子豐度比與R-I-R的差值即為絕對偏差（deviation，D）1，以百分比形式表示。加標血樣的離子豐度比的相對偏差（relative deviation，RD）1為D1與R-I-R的比值。由于離子豐度比具有濃度依賴性[14]，離子豐度比的絕對偏差D2是1～21號加標血樣所測得的離子豐度比與前一次進樣的同一濃度混合標準品的離子豐度比相減所得。離子豐度比的D2與其相同濃度標準品溶液中離子豐度比的比值為加標血樣離子豐度比的相對偏差RD2。

在2個實驗室、3種色譜條件下，離子豐度比的D1、D2、RD1、RD2經SPSS 20.0軟件的兩樣本t檢驗，發(fā)現2個實驗室離子豐度比D1、D2、RD1、RD2的差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。因此將2個實驗室加標血樣的離子豐度比數據合在一起分析。

假陰性率是指加標血樣中各物質滿足相應的絕對保留時間為±0.05 min或相對保留時間為±0.5%范圍內，同時離子豐度比的信噪比≥3，依據MOL等[21]對信噪比進行分段，各分段中不滿足離子豐度比假設的各個范圍的最大允許偏差的概率。

假陽性率是指空白血樣中各物質滿足相應的絕對保留時間為±0.05 min或相對保留時間為±0.5%范圍內，且相應離子豐度比的相對偏差在±50%范圍內的樣本個數所占比例。Lab1中共檢測191個空白血樣，用來分析假陽性率。

本實驗中一共有1231個加標血樣，總計7386個特征碎片離子的離子豐度比。實驗中將不符合要求的數據（信噪比小于3或因人為及儀器因素所致不正常的數據）剔除，共6453個有效數據。其中有質量濃度為2LOQ的24個混合加標血樣（48個單標血樣），總計144個離子豐度比，去除不符合要求的數據，滿足實驗條件的離子豐度比數據有132個。

2 結 果

2.1 標準品的離子豐度比

2.1.1 標準品的離子豐度比與濃度和信噪比的關系

從表2～3可以看出，各標準品的離子豐度比在質量濃度為2.0 μg/mL及其以上時，RSD均小于10%。從圖1～2可以看出，當信噪比小于100時，離子豐度比分布散亂，當信噪比大于100時，分布均一。

表2 Lab1標準品的離子豐度比在不同質量濃度的平均值和相對標準偏差 （n=12）

表3 Lab2標準品的離子豐度比在不同質量濃度的平均值和相對標準偏差 （n=12）

圖1 Lab1標準品的離子豐度比與信噪比的關系

圖2 Lab2標準品的離子豐度比與信噪比的關系

2.1.2 離子豐度比的參考值

標準品的離子豐度比按濃度和信噪比兩種方式計算，由于兩種計算方式的離子豐度比差異無統(tǒng)計學意義，故以濃度方式計算的離子豐度比作為R-I-R，具體見表4。

表4 標準品的離子豐度比參考值

2.2 加標血樣離子豐度比的偏差

2.2.1 加標血樣離子豐度比的偏差與R-I-R的關系

圖3中離子豐度比的D1有99.97%（6 451/6 453）在±20%范圍內，98.76%（6 373/6 453）在±10%范圍內。圖4中離子豐度比的RD1有93.47%（6031/6453）在±20%范圍內，96.02%（6196/6453）在±25%范圍內。

2.2.2 加標血樣離子豐度比的偏差與質量濃度的關系

從圖5～6可以看出，D2和RD2隨質量濃度的增加均呈減小趨勢。低質量濃度（LOD、2LOD、LOQ）時，95.04%（6 133/6 453）的D2≤10%。經統(tǒng)計分析，離子豐度比D2的95%置信區(qū)間為（-12.24%，10.26%）。在低質量濃度時，RD2較大甚至超過±70%。當質量濃度為2LOQ時，95.45%（126/132）的RD2≤50%。但是在質量濃度≥2.0 μg/mL時，95%的RD2≤25%。不考慮質量濃度的情況下，95.31%（6 152/6 453）的RD2≤35%。經統(tǒng)計分析，離子豐度比RD2的95%置信區(qū)間為（-32.26%，37.53%）。

圖3 加標血樣離子豐度比的D1與R-I-R的關系

圖4 加標血樣離子豐度比的RD1與R-I-R的關系

圖5 加標血樣離子豐度比的D2與質量濃度的關系

圖6 加標血樣離子豐度比的RD2與質量濃度的關系

2.2.3 加標血樣離子豐度比的RD1與信噪比的關系

從圖7可以看出，隨著信噪比的增加，RD1分布在±25%范圍內。

圖7 加標血樣離子豐度比的RD1與信噪比的關系

2.2.4 加標血樣離子豐度比RD1的分布

經統(tǒng)計分析加標血樣離子豐度比的RD1，發(fā)現其呈現近似正態(tài)分布，平均值為0.02%，標準差（standard deviation，SD）為10.46%，95%置信區(qū)間為（-20.57%，23.55%），詳見圖8。

2.3 假陰性率

在同一最大允許偏差范圍時，隨著信噪比的增加，假陰性率減小。在同一信噪比范圍內，隨著最大允許偏差范圍的增加，假陰性率減小。在信噪比（3～15）范圍內，共有33個數據，最大允許偏差為50%時，假陰性率為3.0%（1/33）。當信噪比≥3時，最大允許偏差為25%時，假陰性率為3.4%（219/6453）。具體見表5。

在質量濃度為LOD、2LOD、LOQ、2LOQ時，Lab1中4種藥（毒）物的假陰性率見表6。當質量濃度≥2LOQ時，選擇離子豐度比的相對偏差進行判定，假陰性率低于5%。

圖8 加標血樣離子豐度比RD1的分布

表5 加標血樣中離子豐度比的最大允許偏差范圍對假陰性率的影響 （%）

表6 低質量濃度時加標血樣離子豐度比的假陰性率

2.4 假陽性率

本實驗Lab1中191個空白血樣均不滿足保留時間判定的要求，故本實驗的假陽性率為0。

3 討 論

在國外的指南性文件中，離子豐度比的偏差是指待檢樣本特征離子的離子豐度比與同一批處理中標準物質[1-2，10-13]或空白添加標準物質[3-4，9]離子豐度比之間的差值，國內標準則定義為其與添加標準物質之間的差值[7-8，19]。本實驗中，考慮到已知質量濃度的實際樣本較少，同時實際樣本的質量濃度是不可控的，不能滿足整個實驗所需的多個質量濃度點，而且如果采用添加樣本，必須考慮回收率問題，質量濃度的控制就會出現一定的偏差，因此選擇對血樣提取后添加樣本的離子豐度比與標準對照品的偏差來進行定性的最大允許偏差范圍研究。

3.1 加標血樣的離子豐度比偏差的判定

在法醫(yī)毒物分析領域，最具有權威性的指南性文件有兩個：一是《法庭毒物分析質量控制指南》[4]，在此文件中對于相對偏差的判定就是采用典型的四段法，即離子豐度比越小，相對偏差越大；二是《法庭毒物分析實驗室指南》[14]，在這個文件中規(guī)定特征碎片的離子豐度比的相對判定指標為±20%，說明離子豐度比的相對偏差是相對獨立的，與離子豐度比的大小無關。

3.2 加標血樣的離子豐度比絕對偏差的判定

實際應用中很少有指南或者文件采用離子豐度比的絕對偏差來作為判定指標[9-10，13]。就本實驗結果而言，當4種常見藥（毒）物離子豐度比的相對偏差的判定范圍從±10%增加到±20%時，陽性率并沒有明顯的改善。低質量濃度（質量濃度小于2LOQ）的D2較大，導致RD2的范圍擴大。因此在分析生物樣品中物質時，應盡量改進方法，濃縮物質的含量，否則在低質量濃度情況下易造成假陰性結果。因此，就本實驗的儀器、藥（毒）物而言，4種常見藥（毒）物加標血樣離子豐度比的絕對偏差設定在±10%的范圍更加合理。

3.3 加標血樣的離子豐度比相對偏差的判定

在本實驗中，4種常見藥（毒）物加標血樣離子豐度比的相對偏差無論是相對參考值還是信噪比而言，都是相對獨立的，不符合四段法的判定要求，更符合《法庭毒物分析實驗室指南》[14]的定性判定要求。本實驗結果在±25%內變化，比其規(guī)定稍大。只要特征碎片有足夠的響應，就可以有一個穩(wěn)定的離子豐度比和較小的相對偏差，而與特征離子自身離子豐度比的大小無明顯關系?？紤]在低質量濃度（質量濃度小于2LOQ）或低信噪比（3～15）情況下，只有選擇相對偏差±50%的判定，假陰性率才會小于5%。

綜合分析4種常見藥（毒）物加標血樣離子豐度比的偏差大小，發(fā)現與質量濃度和信噪比均有關系，建議4種常見藥（毒）物加標血樣離子豐度比絕對偏差的判定范圍為±10%，相對偏差的判定范圍為±25%，在低質量濃度（質量濃度小于2LOQ）或低信噪比（3～15）情況下，相對偏差應擴大為±50%。由于不同藥物、不同型號儀器以及不同基質如尿液、毛發(fā)、肝組織等都可能會對實驗結果造成影響，本實驗結果僅針對本實驗所用儀器及藥物，因此，本研究存在一定的局限性，應進一步探討，為法醫(yī)毒物分析領域中物質的定性提供更全面、可靠的依據。