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        微陣列比較基因組雜交技術(shù)在出生缺陷新生兒中的應(yīng)用研究

        2019-02-10 10:48:24林薔楊秀芳鄭鎧軍
        關(guān)鍵詞:拷貝數(shù)核型染色體

        林薔,楊秀芳,鄭鎧軍

        (中山大學(xué)附屬中山市人民醫(yī)院新生兒科,廣東 中山 528400)

        據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示,我國(guó)出生缺陷發(fā)生率約為5.6%,每年新增出生缺陷患兒將近90萬(wàn)例[1],而在出生缺陷患兒中有近30%在5歲前死亡,40%則終生殘疾[2]。生長(zhǎng)發(fā)育遲緩(developmental delay,DD)是較為常見(jiàn)的出生缺陷疾病,而導(dǎo)致DD發(fā)生的病因復(fù)雜,不明原因的情況占30%~60%[3]。染色體核型分析現(xiàn)已廣泛應(yīng)用染色體異常的檢測(cè)中,但對(duì)于5 Mb以下的染色體異常無(wú)法準(zhǔn)確識(shí)別。多重鏈接探針擴(kuò)增技術(shù)可檢測(cè)出5%~10%的基因拷貝數(shù)變異情況,但無(wú)法檢測(cè)基因中的點(diǎn)突變和染色體平衡易位。微陣列比較基因組雜交技術(shù)(array-based comparative genomic hybridization,array-CGH)相比傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)方法,具有高通量、高分辨率、高敏感性、高準(zhǔn)確率等優(yōu)點(diǎn)[4]。本研究采用微陣列比較基因組雜交技術(shù)評(píng)估DD發(fā)生的遺傳病因,望為其臨床診治和遺傳咨詢提供參考。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料

        選取2016年3月至2018年10月中山大學(xué)附屬中山市人民醫(yī)院收治的不明原因的DD患兒20例為研究對(duì)象,所有患兒均符合DD診斷和篩選標(biāo)準(zhǔn)[5-6]?;純耗挲g1~25 d,平均(9.2±6.1)d;男性12例,女性8例。排除已知明確病因者,如遺傳代謝性疾病、顱內(nèi)腫瘤、缺血缺氧性腦病等。所有患兒采用自身對(duì)照法,先經(jīng)常規(guī)G顯帶染色體核型分析,設(shè)為對(duì)照組;再采用微陣列比較基因組雜交技術(shù)進(jìn)一步分析(array-CGH組)。

        1.2 方法

        1.2.1 DNA提取 采集患兒外周血2 mL,加入乙二胺四乙酸抗凝劑,采用Blood Genome DNA Extraction Kit (takara 公司)提取基因組DNA,總量50 μL以上,濃度100~150 ng/μL,-20 ℃保存待檢。

        1.2.2 基因檢測(cè) 采用Affymetrix公司配套檢測(cè)試劑盒及優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)操作流程,使用CytoScanHD/CytoScan750K進(jìn)行全基因組范圍掃描。檢測(cè)儀器:AffymetrixGeneChip System 3000Dx v.2芯片系統(tǒng); 檢測(cè)芯片:CytoScan HD,包括270萬(wàn)個(gè)探針(195萬(wàn)個(gè)拷貝數(shù)探針和75萬(wàn)個(gè)SNP 探針),除加密覆蓋拷貝數(shù)多變區(qū)、遺傳疾病關(guān)聯(lián)區(qū)、基因分布區(qū)等,還均勻分布人類(lèi)基因組整個(gè)范圍。分析軟件:Affymetrix Chromosome Analysis Suite Software;version3.0。質(zhì)量控制:所有實(shí)驗(yàn)在質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)的情況下,用Affymetrix Chromosome Analysis Suite Software進(jìn)行分析,以Affymetrix提供的正常人DNA作為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        2 結(jié)果

        2.1 患兒臨床特征

        20例患兒中,有5例(25%)存在特殊面容(包括頭型窄長(zhǎng),耳朵突出,尖下巴,眼瞼下垂,顱骨畸形,眼距寬,寬鼻梁,v型嘴,小耳等);6例(30%)出現(xiàn)矮小、小陰莖、皮膚缺失、天性心臟病、趾畸形、陰道閉鎖等。見(jiàn)表1。

        表1 患兒臨床特征

        2.2 兩種檢測(cè)結(jié)果比較

        20例患兒經(jīng)常規(guī)G顯帶染色體核型分析表明,有2例存在染色體拷貝數(shù)變異,array-CGH檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有5例存在染色體拷貝數(shù)變異,兩組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);但兩組病因確診率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

        表2 兩種檢測(cè)結(jié)果比較

        2.3 array-CGH檢測(cè)結(jié)果

        20例患兒中,有5例(25%)存在染色體拷貝數(shù)變異,根據(jù)現(xiàn)有的文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)資料結(jié)合array-CGH檢測(cè)報(bào)告,4例患兒明確病因,其中1號(hào)患兒在chr22q13.31q13.33區(qū)域發(fā)生3.8 Mb片段缺失,為22q13.3缺失綜合征,又被稱(chēng)為Phelan-McDermid綜合征;2號(hào)患兒在chr15q11.2q13.1區(qū)域發(fā)生約6.2 Mb片段缺失,與Prader-Willi綜合征相關(guān);3號(hào)患兒在chr11q24.2q25區(qū)域發(fā)生10.3 Mb片段缺失,為Jacobsen綜合征;4號(hào)患兒在chr5q32處存在約311 Kb缺失片段,該片段缺失可致Treacher Collins綜合征 ;5號(hào)患兒多條染色體發(fā)生了大片段純合子(>3 Mb)現(xiàn)象,片段長(zhǎng)度總和大約為171.0 Mb,占常染色體基因組片段總長(zhǎng)度的6.0%,臨床意義尚不明確。 其余患兒染色體拷貝數(shù)為正常多態(tài)性改變。見(jiàn)表3、圖1、圖2、圖3、圖4和圖5。

        表3 20例患兒array-CGH檢測(cè)結(jié)果

        2.4 染色體拷貝數(shù)變異情況

        5例患兒存在染色體拷貝數(shù)變異,其中1號(hào)患兒基因組突變位點(diǎn)及涉及基因?yàn)閍rr[hg19] 22q13.31q13.33(47,270,321-51,115,526)x1/SHANK3(606230);2號(hào)患兒為arr[hg19] 15q11.2q13.1(22,770,421-28,928,730)x1/UBE3A;3號(hào)患兒為arr[hg19] 11q24.2q25(124,630,054-134,938,470) x1;4號(hào)患兒為arr[hg19] 5q32(149,477,431-149,788,137) x1/CSF1R (164770),PDGFRB (173410),CAMK2A(114078),TCOF1(606847);5號(hào)患兒在多條染色體上發(fā)生大片段純合子(hg19)。見(jiàn)表4。

        表4 5例患兒基因拷貝數(shù)變異情況

        3 討論

        染色體拷貝數(shù)變異在神經(jīng)性發(fā)育障礙,如智力低下、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、精神分裂癥、孤獨(dú)癥等發(fā)病機(jī)制中起重要作用[7]。傳統(tǒng)的G顯帶核型分析技術(shù)對(duì)染色體不平衡畸變引起的出生缺陷具有較廣泛的應(yīng)用,但對(duì)于5 Mb以下的染色體異常往往無(wú)法準(zhǔn)確識(shí)別[8]。微陣列比較基因組雜交技術(shù)通過(guò)對(duì)全基因組的掃描,突破了傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)方法的諸多限制,可檢測(cè)出染色體亞顯微缺失和重復(fù)突變,具有高通量、高分辨率等優(yōu)點(diǎn)[9-10]。研究[11]指出,在智力低下、多發(fā)性先天性畸形等患者的產(chǎn)后遺傳診斷中,array-CGH檢出率為7%~11%,可檢測(cè)出8%的常規(guī)技術(shù)無(wú)法檢測(cè)到染色體失衡。何璽玉等[12]通過(guò)array-CGH技術(shù)對(duì)不明原因ID/DD患兒進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)38%的患兒存在染色體拷貝數(shù)異常,為19%的患兒明確了病因。歐明林等[13]通過(guò)探討array-CGH技術(shù)在染色體異常細(xì)胞遺傳學(xué)分析中的作用時(shí)指出,array-CGH技術(shù)有利于篩查病理性染色體拷貝數(shù)異常,可明確染色體易位類(lèi)型。本研究發(fā)現(xiàn),20例患兒中,有5例(25%)存在染色體拷貝數(shù)變異,根據(jù)現(xiàn)有的文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)資料結(jié)合array-CGH檢測(cè)報(bào)告,4例(20%)患兒明確了病因,與傳統(tǒng)的G顯帶核型分析技術(shù)檢測(cè)結(jié)果存在顯著差異。說(shuō)明array-CGH技術(shù)在檢測(cè)染色體亞顯微缺失和明確病因方面具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

        此外,array-CGH技術(shù)也存在相應(yīng)的局限性,例如對(duì)染色體平衡倒位、易位等染色體結(jié)構(gòu)異常無(wú)法準(zhǔn)確識(shí)別,僅可對(duì)特定分辨率的染色體拷貝數(shù)的缺失和增加進(jìn)行篩選,無(wú)法對(duì)更小的染色體異常及基因點(diǎn)突變做出準(zhǔn)確的準(zhǔn)斷。另外,目前基因芯片價(jià)格相對(duì)較貴,還未得到更廣泛的應(yīng)用。但正如上文所述,array-CGH技術(shù)相比傳統(tǒng)的G顯帶核型分析技術(shù)存在諸多優(yōu)點(diǎn),如在本研究中,傳統(tǒng)的G顯帶核型分析技術(shù)無(wú)法確診的患兒,經(jīng)array-CGH檢測(cè)明確了病因。如1號(hào)患兒經(jīng)array-CGH檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在chr22q13.31q13.33區(qū)域發(fā)生3.8 Mb片段缺失,涉及SHANK3重要功能基因,為Phelan-McDermid綜合征[14]。該綜合征臨床表現(xiàn)為發(fā)育遲緩、中到重度智力低下、有特殊面容等[15]。1號(hào)患兒臨床特征與上述癥狀基本相符,可進(jìn)一步判斷為Phelan-McDermid綜合征。2號(hào)患兒在chr15q11.2q13.1區(qū)域發(fā)生約6.2 Mb片段缺失,與Prader-Willi綜合征相關(guān),該綜合征是一種復(fù)雜的遺傳性疾病,嬰兒期主要臨床表現(xiàn)為發(fā)育遲緩,特殊面容等,與患兒臨床特征相符,其發(fā)病率為1/30 000~1/10 000[16]。3號(hào)患兒在chr11q24.2q25區(qū)域發(fā)生10.3 Mb片段缺失,為Jacobsen 綜合征[17]。常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)包括產(chǎn)前/產(chǎn)后物理性生長(zhǎng)遲緩,顯著的面容畸形等,與患兒臨床特征相符。該綜合征15%的病例因家族性平衡易位導(dǎo)致的不平衡分配或其他染色體重排引起[18]。4號(hào)患兒在chr5q32處存在約311.0 Kb缺失片段,包含CSF1R,PDGFRB,CAMK2A,TCOF1等功能基因,該片段缺失可致Treacher Collins綜合征。常伴發(fā)育遲緩,顱面發(fā)育異常等,與患兒臨床特征相符。TCOF1功能基因缺失可導(dǎo)致先心病的發(fā)生[19-21]。此外,5號(hào)患兒經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)多條染色體發(fā)生大片段純合子(>3 Mb)現(xiàn)象,片段長(zhǎng)度總和大約為171.0 Mb,占常染色體基因組片段總長(zhǎng)度的6.0%,臨床意義尚不明確,但可能增加了相應(yīng)區(qū)域內(nèi)一些隱性遺傳病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

        綜上,array-CGH技術(shù)在檢測(cè)染色體亞顯微缺失和明確病因方面具有顯著的診斷價(jià)值,值得推廣應(yīng)用。

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