張?zhí)旌?，張仙紅

(山西農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，山西 太谷 030801)

熱激蛋白(Heat shock protein, Hsps)又稱熱休克蛋白，是細胞或生物體在一定時間內(nèi)遭受高于其正常生長溫度8～12 ℃(一般稱為亞致死溫度sub-lethal temperature)以上的溫度時，新合成或含量增加的一類蛋白質(zhì)[1]。近幾年，大量研究表明熱激蛋白不僅能被高溫所誘導，還能被低溫、缺氧、高鹽、pH、紫外線、水分脅迫、營養(yǎng)饑餓等其它許多損傷因素和應急刺激所誘導，因此有時也被稱為脅迫蛋白(stress proteins)[1]。

對熱激蛋白的研究始于1962年，Ritossa[2]在對果蠅進行熱激時發(fā)現(xiàn)，短暫的熱激能誘導黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)唾腺組織產(chǎn)生一類新的蛋白質(zhì)，即熱激蛋白(Hsps)。此后又陸續(xù)從原核生物(細菌)、高等動物鳥類和哺乳動物的組織或培養(yǎng)細胞中發(fā)現(xiàn)了熱激蛋白。1982年Adems等證實了一切生物細胞(包括原核生物和真核生物)在受到高溫誘導時均可合成熱激蛋白。我國對Hsps的研究始于上世紀80年代中期，研究對象以哺乳動物和高等植物為主。盡管Hsps最初在昆蟲中被發(fā)現(xiàn)，但很長一段時間內(nèi)對昆蟲Hsps的報道卻很有限。近年來，隨著生物科學技術的快速發(fā)展，測序效率及精確率的提升，Hsps的研究取得了很大的進展。本文就昆蟲Hsps的分類、生物學特性、Hsp與昆蟲抗逆性及Hsps在害蟲治理中的作用進行綜述。

1 Hsps的分類

1.1 按照分子量進行分類

按照分子量進行分類的方式眾多，孫濤等[3]將Hsps分為Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40、Hsp20、Hsp10七個家族。而多數(shù)研究者更傾向于將分子量介于15～50 kD的Hsp分子歸為一類，統(tǒng)稱為小分子熱激蛋白(sHsps)，如Carper等[4]將Hsps分為Hsps110、Hsps90、Hsps70、Hsps60、小分子Hsps和泛素等6個家族。此外，還有學者認為可以按照分子量大于80 kD，30～70 kD和小于30 kD將Hsps分為3大類[5,6]。由Morimoto等[7]提出的分類方式目前得到大多數(shù)研究者的認可，他們將Hsps分為Hsp90、Hsp70、Hsp60和小分子Hsp 4個家族，并認為許多大分子Hsps來源不同，不具有相似的生物學功能，因此不能成為一個家族。

1.2 按照誘導表達情況進行分類

按照Hsps在生物體內(nèi)的存在情況及脅迫條件下的表達情況，可將Hsps分為組成型和誘導型兩種。

組成型熱激蛋白(Constitutive forms heat shock protein cognates, Hscs)在正常條件下即可大量表達，而對外界刺激的響應不明顯，具有持家基因的功能，在生物體生命活動中起重要作用。如赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)的Hsp90蛋白與復眼發(fā)育有關[8]；家蠶(Bombyxmori)熱激蛋白BmTrap1在5齡幼蟲精巢中的信號值為雌性卵巢中的6倍，說明該基因可能與精巢發(fā)育與精子發(fā)生相關[9]。

誘導型Hsps在生物體內(nèi)正常條件下不表達或表達量很少，但當機體處于逆境中時會大量表達，如蘋果蠹蛾(Cydiapomonella)CpHsp90在高溫脅迫下的表達量是正常溫度下的12倍以上[10]；沙蔥螢葉甲(Galerucadaurica)2齡幼蟲GdHsp70在0 ℃以下低溫時的表達量顯著高于5 ℃時的表達量[11]。誘導型Hsps可修復損傷蛋白，并幫助蛋白質(zhì)正確折疊，起分子伴侶的作用。

2 Hsp的生物學特性

2.1 Hsp90的生物學特性

Hsp90s是一種廣泛存在于原核生物和真核生物細胞中含量豐富的蛋白質(zhì)[12]。根據(jù)物種和細胞器的分布特征，Hsp90s可分為5大類：Hsp90A、Hsp90B、Hsp90C、TRAP和HTPG。其中Hsp90 A、Hsp90B和TRAP分別分布于細胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體中，Hsp90C特異性分布于葉綠體中，HTPG則僅存在于真菌中[9]，且分布于不同位置的Hsp90相互之間相似性很低。

Hsp90最重要的作用之一是能夠與酪氨酸激酶、絲氨酸-酪氨酸激酶、類固醇激素受體等信號傳導蛋白相互作用并形成復合體，使其具有生物學活性[9]。此外，不論是否受到逆境脅迫，Hsp90在各種類型的細胞中均有存在，作為分子伴侶與變性蛋白結合，維持其正常折疊狀態(tài)[13]。所以，即使是在無脅迫條件下，Hsp90對真核生物必不可少[14]。

Hsp90s在進化上高度保守，具有5條特征序列：YSNKEIFLRE、LGTIAKSGT、TGQFGVGFYSAYLVAD、IKLYVRRVFI、GVVDSEDLPLNISR[15]。其N-端均含有保守的ATPase結構域，是ATP/ADP結合位點[9]；C-末端通常會發(fā)生二聚化，以二聚體的形式存在[1]。不同昆蟲之間相應的Hsp90相似性較高。如蘋果蠹蛾(C.pomonella)CpHsp90與亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)、甘藍夜蛾(Mamestrabrassicae)、綠豹蛺蝶(Argynnispaphia)、二化螟(Chilosuppressalis)、斜紋夜蛾(Spodopteralitura)等的氨基酸序列一致性均高達96%[10]。

2.2 Hsp70的生物學特性

Hsp70s是一類存在于原核細胞與真核細胞中功能重要、含量豐富的細胞保護蛋白。按照誘導表達情況，Hsp70s分為組成型(Hsc)和誘導型(Hsp)2類。組成型Hsc在未受到脅迫的細胞中就可表達，而Hsp則由應激誘導產(chǎn)生。在受到環(huán)境因子誘導時，Hsp70s普遍上調(diào)表達，且比Hsp90s上調(diào)更加強烈，有時上調(diào)幅度能夠達到正常狀態(tài)下的幾百倍，小胸鱉甲(Microderapunctipennis)5齡幼蟲Hsp70在熱激條件下甚至能夠達到對照組的5 290.7倍[8]。

Hsp70s的主要作用為幫助蛋白正確折疊、水解不穩(wěn)定蛋白、引導蛋白的跨膜運輸、協(xié)助蛋白定位等，還可調(diào)控諸如轉錄因子類的調(diào)控蛋白的生物學功能[15,16]。

Hsp70s具有3條特征序列：IDLGTTYS、IFDLGGGTFDVSVL、VVLVGGSTRIPKIQQ[17]。所有Hsp70均含有1個高度保守的44 kD ATPase功能域，能夠特異結合ATP；1個較為保守的15 kD多肽結合功能域；1個靠近C-端的10 kD不保守可變區(qū)和C-末端基序。由于其保守區(qū)域占總序列的比例較大，致使Hsp70s成為Hsps超家族中最為保守的一類，即使分類地位屬不同門下，其相應Hsp70有時也具有較高的同源性。沙蔥螢葉甲(Galerucadaurica)熱激蛋白GdHsp70的3D結構與牛的相應蛋白同源性可達72.5%，氨基酸序列與馬鈴薯葉甲(Leptinotarsadecemlineata)LdHsp70的一致性達到了89.1%[11]；蓮草直胸跳甲(Agasicleshygrophila)AhHsp70核苷酸序列與馬鈴薯葉甲(L.decemlineata)的相似性達到79%，氨基酸序列相似性達到94%[18]。

2.3 Hsp60的生物學特性

Hsp60s是一類主要存在于線粒體中的核編碼蛋白質(zhì)，負責保護機體免受不良環(huán)境條件的影響和蛋白質(zhì)的再折疊[3]，參與核基因編碼的蛋白質(zhì)進入線粒體后的折疊與組裝，還參與線粒體本身編碼蛋白質(zhì)的折疊與組裝[1]。

Hsp60s的特征序列為：AAVEEGIVPGGG[17]，具有ATP結合位點，C-末端含有(GGM)n序列[12]。在線粒體基質(zhì)內(nèi)，7個Hsp60亞基構成一個環(huán)狀寡居結構[19,20]，這樣2個環(huán)狀結構疊加在一起形成桶狀結構[21]。在脅迫條件下，Hsp60先與ATP結合，使其本身發(fā)生構象改變，從而能夠結合蛋白進行維持和修復[12]。目前有關昆蟲Hsp60 s的研究較為匱乏，可能與其抗逆能力稍差，作用時間較遲緩有關。

2.4 sHsp的生物學特性

sHsp是一個非常多樣的群體，其種類繁多。不同物種體內(nèi)所含sHsp的種類數(shù)往往不同，如啤酒酵母只含有1種sHsp，而高等植物所含sHsps的種類可達30余種[22]。根據(jù)它們在細胞內(nèi)的不同定位以及DNA序列，又可將其分成5類：class I和class II存在于細胞質(zhì)中，線粒體sHsp、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)sHsp和葉綠體sHsp則位于細胞器中[23,24]。

sHsp在細胞內(nèi)能夠根據(jù)行使功能的不同形成高度有序的寡聚體(200～800 kD)，主要功能包括維持谷胱甘肽水平、細胞間活性氧化物的調(diào)節(jié)，而行使分子伴侶功能時則需要解聚。還有研究表明，異色瓢蟲(Harmoniaaxyrides)體內(nèi)的3種sHsps，表達量分別在4齡末期、成蟲期和蛹末期達到最高，說明sHsp在生物體生長發(fā)育和分化及對抗細胞凋亡過程中也發(fā)揮著重要作用[25]。

在Hsp超家族中，sHsp的保守性相對較差，種屬特異性較強[17]。但所有sHsp的C-端均含有一段約100個氨基酸殘基組成的保守區(qū)域，由于與α-晶體蛋白同源性很高，故稱為α-晶體結構域，是鑒定sHsps家族的重要特征[17]。不過，盡管結構相似且擁有共祖接點，二者在進化樹中仍然各自聚為一大類，說明α-晶體蛋白和sHsps是平行進化的兩大類基因[22]。

3 Hsp的作用特性

大量研究表明，誘導型Hsp的積累決定著真核細胞的抗逆性，且Hsp在生物體內(nèi)的積累量與抗逆性呈正相關[26,27]。Hsps誘導的抗逆性與其分子伴侶(molecular chaperones)作用有關[28]。在高溫或其他逆境脅迫下，蛋白質(zhì)的空間構象會發(fā)生改變，尤其是處于折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)更容易受到損傷，但在分子伴侶的作用下，熱敏蛋白的損害減少，從而使生物獲得抗逆性。

但Hsp的作用并不是一成不變的，大量文獻表明其表達具有以下特點：

3.1 Hsp作用的速效性和非長效性

熱激蛋白的轉錄調(diào)控發(fā)生迅速，由Hsp誘導的耐熱性在較短時間內(nèi)就能獲得，熱激后1～2 min內(nèi)就能檢測到轉錄[10]。如灰飛虱(Laodelphaxstriatellus)4齡幼蟲熱激蛋白LsHsp90在40 ℃熱激下0.5 h后達到最大值，并且顯著高于處理2 h時的表達水平[29]。說明若長時間熱激，則昆蟲體內(nèi)的熱激蛋白呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。這一現(xiàn)象可能是由于熱激蛋白長時間的大量表達對機體不利，故熱適應后便會迅速下調(diào)[10]。

3.2 Hsp指導的耐熱性具有溫度上下限

在熱激處理棉花粉蚧(Phenacoccussolenopsis)的試驗中，3種Hsp雖然表達量有所差異，但均在43 ℃或45 ℃時達到最高[26]；沙蔥螢葉甲(G.daurica)在-10 ℃處理后GdHsp70的表達量大量增加，但在-14 ℃處理后卻與對照組無顯著差異[11]?？赡苁怯捎跇O端溫度超出Hsps對機體的調(diào)節(jié)范圍，致使昆蟲快速死亡。

3.3 預處理能夠增強機體抗逆性

研究發(fā)現(xiàn)，在致死高溫處理前如果進行溫熱預處理，則能夠明顯增加昆蟲的耐熱性，延長致死時間或降低死亡率[11]。申建茹等[10]在研究蘋果蠹蛾(C.pomonella)熱激蛋白CpHsp90時發(fā)現(xiàn)，將蘋果蠹蛾直接熱激，在40 ℃時會達到最高表達量，溫度超過40 ℃之后就會呈現(xiàn)下降趨勢；而如果熱激前先進行35 ℃預處理，則CpHsp90表達量在45 ℃時達到最高。汪慧娟等[25]對異色瓢蟲(H.axyrides)冷馴化過程中也得到了相似的結論。

3.4 不同種類Hsp響應不同的逆境刺激

不同種類的Hsp會對不同種類的刺激做出反應，一些種類的Hsp僅響應高溫刺激，如小胸鱉甲(M.punctipennis)MpHsp70對高溫響應強烈，但對低溫的響應顯著性不強，甚至受到抑制[8]；有些則僅對低溫做出反應，如沙蔥螢葉甲(G.daurica)2齡幼蟲中GdHsp70在-10 ℃時響應強烈，而對高溫的響應不明顯[11]；也有應對高低溫均能響應的Hsp，如灰飛虱(L.striatellus)LsHsp90[29]；還有一些能夠對化學刺激等逆境做出反應，如果蠅(Drosophilasp.)經(jīng)敵敵畏處理后，精巢中的Hsp70被顯著誘導[30]。

3.5 同種Hsp在同一個體不同組織中的差異表達

Hsps在不同組織中的表達量往往差異很大。有研究表明，同種sHsp在異色瓢蟲(H.axyrides)不同色型中的表達情況也不盡相同[25]。正常狀態(tài)下，蘋果蠹蛾(C.pomonella)中腸和脂肪體中的CpHsp90表達量顯著高于表皮和淋巴，說明同一個體不同組織中Hsp含量不同。經(jīng)熱激處理后，表皮和淋巴中的CpHsp90顯著上調(diào)，而原先表達量較高的中腸和脂肪體內(nèi)的CpHsp90含量則明顯下降，說明表皮可能是對熱激響應最活躍的組織[10]，而中腸和脂肪體中CpHsp90含量的下降可能是由于高溫抑制了表達。同時，Hsp的本底水平越低，對熱激的響應程度就越高[8,10]。

3.6 Hsp功能的作用具有交互性

Hsps的合成與對其它類型的脅迫產(chǎn)生耐受力也有關，包括低氧、局部缺血、酸中毒、能量缺乏、低溫、紫外輻射等。有試驗表明，Hsp的導入可使原本對高溫敏感的果蠅初生精子細胞具備耐熱性[6]，這說明外界導入的Hsp同樣具有提高生物體抗逆性的能力；此外，通過化學誘導產(chǎn)生的Hsps，同樣也有提高耐熱性的作用[6]，同時，高低溫誘導的Hsps在功能上也具有交互作用，即預冷刺激能夠提高昆蟲在高溫下的存活率[31,32]，這也說明同一種Hsps可誘導不同的抗逆性。

4 Hsp的研究意義

4.1 Hsps在系統(tǒng)發(fā)育分析中的作用

由于Hsp90s、Hsp70s、Hsp60s和sHsps具有保守性，在物種間具有特異性[11,17,18]。因此對Hsps序列的測定和分析，可以得到許多具有指導性意義的信息，如可作為遺傳學特征進行分類，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過對比某些基因在物種之間的相似性來確定它們的親緣關系。

進化樹分析表明棉花粉蚧(P.solenopsis)、赤擬谷盜(T.castaneum)、家蠶(B.mori)、黑腹果蠅(D.melanogaster)大分子量Hsps與sHsps各自獨立成族，Hsp70s和Hsp90s在4個種間交叉成族，說明大分子量Hsps和sHsps分別屬于獨立的基因家族，而Hsp70s和Hsp90s則是在物種分化之后才分別演化的，同時棉花粉蚧ep-Hsp60與ep-Hsp90均與半翅目聚為一支[3]，這為傳統(tǒng)分類學上將同翅目與半翅目合并的提議提供了依據(jù)。家蠶(B.mori)、詩神袖蝶(Heliconiusmelpomene)、帝王蝶(Danausplexippus)、黑腹果蠅(D.melanogaster)、西方蜜蜂(Apismellifera)的Hsp90A、Hsp90B和TRAP分別聚為一支，說明這些熱激蛋白在物種分化前就已經(jīng)產(chǎn)生且保持著較低的進化速率，這可能是由于功能約束導致的[9]。詩神袖蝶和果蠅的誘導型Hsp70s各自聚為一支，而組成型Hsc70s則存在1∶1直系同源關系，這說明Hsp70s是在物種形成后發(fā)生特異性擴增產(chǎn)生的，而Hsc70s則在物種分化前就已經(jīng)發(fā)生基因擴增[30]。

賈棟等[18]對昆蟲綱5個目60種昆蟲進行Hsp70s系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結果表明Hsp70可以把各目昆蟲單獨聚類，同時反應目以下昆蟲之間的親緣關系，說明Hsp70s可以作為系統(tǒng)進化分析的標志基因。申建茹等[10]對昆蟲綱6個目61種昆蟲的Hsp90s進行系統(tǒng)發(fā)育分析，系統(tǒng)發(fā)育樹結果與傳統(tǒng)分類學基本吻合，但鱗翅目下蝶類和蛾類交叉成族，沒有各自聚成一支，暗示鱗翅目的傳統(tǒng)分類方式可能存在缺陷。

4.2 Hsps在環(huán)境監(jiān)測中的作用

由于生物體Hsps具有在受到逆境刺激后能夠快速顯著上調(diào)這一特點，使其在環(huán)境監(jiān)測工作中具有重要作用[11]。傳統(tǒng)的環(huán)境監(jiān)測依賴于某些特定的環(huán)境指示昆蟲，如石蛾、步甲、蜉蝣等[33]；而利用熱激蛋白表達水平對環(huán)境進行監(jiān)測則可不受物種的限制，任何種類的昆蟲都能作為監(jiān)測對象。目前已有研究表明，昆蟲體內(nèi)某些熱激蛋白會對化學藥劑產(chǎn)生響應，如煙粉虱地中海隱種(BemisiatabaciMediterranean)熱激蛋白BtHsp70在不同濃度烯啶蟲胺、毒死蜱、高效氯氰菊酯等化學藥劑的刺激下均顯著上調(diào)[34]；另有研究表明，一些土壤污染物可以誘發(fā)土壤昆蟲某些熱激蛋白的表達，通過測定土壤昆蟲體內(nèi)對應熱激蛋白的含量即可診斷土壤的污染狀況[32]。

4.3 Hsps在害蟲治理中的應用

昆蟲對逆境的抗性在很大程度上決定于Hsp的表達。許多種類的Hsp決定昆蟲對環(huán)境逆境的耐受性，而抑制這些Hsp的表達則會對昆蟲的抗逆性產(chǎn)生影響。通過分子手段對昆蟲的個別Hsp基因進行干擾，可使昆蟲因抗逆性降低而死亡。

Lv等[35]、Busby等[36]對雌性B型煙粉虱(bemisiatabacibiotype B)和肩突硬蜱(Ixodesscapularis)的Hsp23/Hsp20和Hsp70基因進行了RNA干擾，影響了其對高溫脅迫的響應，降低了在高溫下的存活率；而抑制紅尾肉蠅(Sarcophagacrassipalpis)Hsp23或Hsp70的表達則會使其非滯育蛹的耐熱性降低[37]。

此外，賈棟等[18]通過對蓮草直胸跳甲(A.hygrophila)Hsp70s的研究發(fā)現(xiàn)，誘導最高溫度(Tmax)和生物體開始大量死亡的溫度相吻合，說明某些Hsps的Tmax能夠很好地代表昆蟲的耐受極限溫度，是揭示物種耐受性的重要指標。若是將其應用于化學殺蟲劑領域，通過測定某些Hsps的誘導最高濃度Cmax，就能快速確定能夠大量殺死害蟲的最低濃度。