張 希, 邢曉俠, 崔杰峰

張希, 邢曉俠, 崔杰峰, 復旦大學附屬中山醫(yī)院肝癌研究所 上海市200032

核心提要： 本文從侵襲性偽足(invadopodia)結構與功能、侵襲性偽足形成及誘導因素、基質硬度參與侵襲性偽足形成的調控機制等方面進行綜述, 探討侵襲性偽足在基質硬度調控腫瘤侵襲轉移病理進程中所扮演的重要角色.

0 引言

腫瘤微環(huán)境參與腫瘤侵襲轉移調控逐漸成為腫瘤領域的研究熱點.對腫瘤微環(huán)境調控信號的認識已不再局限于基質細胞、浸潤免疫細胞、細胞因子、外泌體等生化信號, 一些物化信號包括缺氧、酸堿pH、溫度、基質硬度等研究也取得明顯進展.其中, 基質硬度作為實體腫瘤顯著物理力學特征, 調控腫瘤侵襲轉移機制報道近年逐漸增多, 基質硬度增加通過影響腫瘤細胞上皮間質轉化[1,2]、遷移模式改變[3,4]、侵襲轉移關聯基因表達[5-7]、腫瘤細胞干性維持[8]、預轉移龕形成[9]等惡性特征改變,促進腫瘤侵襲轉移.高遷移、侵襲能力是轉移性腫瘤細胞的標志性特征, 而侵襲性偽足(invadopodia)形成則是維持腫瘤細胞高遷移、侵襲能力的關鍵, 也是決定腫瘤侵襲轉移進程的重要分子事件之一.在侵襲轉移早期階段, 從原發(fā)瘤脫落的腫瘤細胞必須降解胞外基質, 穿越基底膜、基質層、血管壁等物理屏障[10], 才能進入血管實現遠端轉移, 侵襲性偽足在實現上述基質降解及突破的侵襲轉移病理進程中扮演重要角色.已有研究顯示,生長因子、細胞外基質(extracellular matrix, ECM)、細胞間接觸、缺氧、外泌體等因素可誘導侵襲性偽足形成.而胞外基質硬度增加可顯著改變腫瘤細胞形態(tài)結構[11]、增強腫瘤細胞運動[4]、上調腫瘤細胞基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)表達分泌[12], 提示基質硬度與腫瘤細胞侵襲性偽足形成可能存在較強的關聯.零星報道也顯示[3,13], 基質硬度改變可影響腫瘤細胞侵襲性偽足形成及活性.但是, 針對硬度力學信號誘導腫瘤細胞偽足膜突起結構形成的機制目前依然知之甚少.本文將從侵襲性偽足結構功能、侵襲性偽足形成誘導因素、以及基質硬度調控侵襲性偽足形成機制等方面進行綜述, 以探討侵襲性偽足在基質硬度調控腫瘤侵襲轉移過程中發(fā)揮的重要作用.

1 侵襲性偽足結構與功能

依據形態(tài)、結構及功能特征的不同, 細胞膜突起結構被分為絲狀偽足、片狀偽足、侵襲性偽足和足體.片狀偽足在細胞遷移運動中起主導作用, 絲狀偽足則感受胞外趨化因子, 控制運動方向, 在腫瘤侵襲起始階段, 絲狀偽足與片狀偽足也發(fā)揮黏附作用[14-16].侵襲性偽足多見于高侵襲性腫瘤細胞, 為富含絲狀肌動蛋白(F-actin)的胞膜突起結構[17], 電鏡下呈細長突起狀, 長約0.5-2 μm, 直徑約50 nm[18-21].除肌動蛋白外, 侵襲性偽足中還聚集許多肌動蛋白調控蛋白, 包括cortactin、神經源性Wiskott-Aldrich綜合征蛋白(neural Wiskott-Aldrich syndrome protein, N-WASP)、Arp2/3復合體、cofilin、Mena、fascin和formin等[18,22-27].此外, 侵襲性偽足可募集分泌多種蛋白酶, 如MT1-MMP(也稱MMP14)、MMP2、MMP9、seprase、cathepsin B、ADAM12和uPAR等[28-35], 促進ECM降解, 部分蛋白酶還能激活釋放ECM中貯存的生長因子[10,36-40].侵襲性偽足組分及其調控因子參與細胞黏附[28,41]、ECM降解[42]、膜運輸[43-45]、信號轉導[22,46,47]等病理生理過程.足體(podosome)存在于樹突狀細胞、巨噬細胞、內皮細胞、血管平滑肌細胞、破骨細胞等正常細胞中, 為富含肌動蛋白且具有基質重塑功能的亞細胞結構[48-56].一般將侵襲性偽足、足體和Src誘導的侵襲性偽足樣結構統(tǒng)稱為侵襲體(invadosome)[57].盡管結構形態(tài)相似, 侵襲性偽足與足體之間依然存在差異, 如侵襲性偽足以長突起狀結構為主, 存在時間長達數小時; 而足體結構更為短平, 僅存在數分鐘時間[48]; 其次, 兩種膜突起結構中表達的關鍵性調控蛋白不同, 如Nck1和Mena在侵襲性偽足中表達, 在足體中不表達; WASP和Grb2在足體中表達, 在侵襲性偽足中則不表達[58-60].

2 侵襲性偽足的形成及其誘導因素

2.1 侵襲性偽足的形成 侵襲性偽足形成是腫瘤細胞侵襲轉移進程中早期形態(tài)改變.侵襲性偽足形成一般分三個階段： 侵襲性偽足前體核心形成, 侵襲性偽足前體的穩(wěn)定和侵襲性偽足成熟[61].侵襲性偽足前體核心由N-WASP、Arp2/3復合體和cofilin募集至actin-cortactin復合體周圍而形成, 前體核心在數秒內即可形成, 但并不穩(wěn)定, 前體核心形成約20 s后, Tks5結合于前體核心上[62].Tks5介導前體復合物與位于細胞膜上的PI(3, 4)P2結合, 穩(wěn)定前體結構[62-64].而lamellipodin蛋白使Mena-Arg-SHIP2復合體募集至前體[63,64].SHIP2促進PI(3, 4)P2生成, 利于前體固定于細胞膜上, 增強前體穩(wěn)定性, cofilin和Arp2/3復合體分別介導兩條不同的肌動蛋白聚合通路, 兩條通路協(xié)同作用, 大大增強肌動蛋白進一步的聚合[65].最終, 肌動蛋白聚合使侵襲性偽足延長并形成突起, 募集MMPs并降解ECM, 完成侵襲性偽足成熟[61,62,66].侵襲性偽足形成三階段模型來源于人、大鼠和小鼠腺癌細胞研究, 該模型是否適用于其它腫瘤細胞類型目前仍不清楚[67].

2.2 誘導侵襲性偽足形成的因素及其分子機制 以往認為, 侵襲性偽足形成在一定程度上受腫瘤驅動基因突變(driver mutations)的調控.如： Src和Ras基因異常激活可使正常細胞發(fā)生惡性轉化并誘導侵襲性偽足前體形成[68,69].而近來證據表明, 腫瘤驅動基因突變并不足以決定體內腫瘤表型或腫瘤細胞行為, 來自腫瘤微環(huán)境刺激信號同樣可決定腫瘤表型改變[70].目前, 腫瘤微環(huán)境信號生長因子、ECM、細胞間接觸、腫瘤缺氧、外泌體均已顯示可誘導、促進侵襲性偽足形成.

2.2.1 生長因子： 多種生長因子如轉化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)[71]、表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)[46]、肝素結合-表皮生長因子(heparin-binding EGF-like growth factor, HB-EGF)[35]、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)[72]、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor, PDGF)[73]、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)[74]和基質細胞衍生因子1α(stromal-derived factor1-α, SDF1α)[75]等被發(fā)現可誘導促進腫瘤細胞侵襲性偽足形成和(或)活性.雖然不同生長因子誘導侵襲性偽足形成的機制各異, 但生長因子通路常匯聚至胞內共同的信號樞紐, 如Src激酶、磷酸肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinases, PI3Ks)等, 來調控肌動蛋白聚合及侵襲性偽足形成, 從而左右腫瘤細胞侵襲與轉移[66,76].Ke等[71]研究顯示, TGF-β1誘導肝細胞癌HepG2細胞侵襲性偽足形成及活性增強, TGF-β1降低膜相關鳥苷酸激酶家族成員Dlg5(discs large homolog 5)表達,Dlg5能抑制Girdin與Tks5結合, 進而降低侵襲性偽足形成及活性, 進一步機制探討發(fā)現, Dlg5下調可經Girdin依賴性FAK/Src活性介導增強Tks5磷酸化, 說明TGF-β1通過Dlg5/Girdin/Tks5通路調節(jié)增強侵襲性偽足形成及活性.Mader等[46]發(fā)現, EGF與EGFR結合可激活乳腺癌細胞非受體酪氨酸激酶Arg使cortactin磷酸化, 引發(fā)侵襲性偽足肌動蛋白聚合和成熟, 侵襲性偽足中Src和Arg共存, 敲除Src后, 過表達Arg可部分恢復EGF誘導的侵襲性偽足肌動蛋白聚合, 而敲除Arg后, 過表達Src并無補償作用, 說明Arg為Src激活的下游分子, EGFR-Src-Argcortactin通路可參與調控乳腺癌細胞侵襲性偽足形成及活性.Malek等[77]研究乳腺癌發(fā)現, 生長因子EGF激活Ⅰ類PI3K(Class Ⅰ PI3K), Ⅰ類PI3K催化底物PI(4, 5)P2生成PI(3, 4, 5)P3, 后者在5-磷酸酶作用下發(fā)生去磷酸化從而產生PI(3, 4)P2, PI(3, 4)P2激活其下游效應因子Tks5, 從而促進Tks5依賴性侵襲性偽足形成.

2.2.2 ECM： ECM不僅是結構性基質, 其組分、硬度、排列及拓撲結構等信息也可經細胞-ECM接觸表面?zhèn)鬟f至細胞中.ECM通過特異性細胞表面黏附受體可調控侵襲性偽足形成及活性[78].侵襲性偽足成熟需要整合素介導的ECM黏附.多種特異性整合素受體如α2β1、α3β1、α5β1和α6β1等, 存在于侵襲性偽足中[61,79-81].ECM中的基質蛋白如纖維連接蛋白(fibronectin), Ⅰ型膠原蛋白(type Ⅰ collagen)和層黏連蛋白(laminin)等能激活侵襲性偽足整合素受體[61,66,81,82].Fibronectin與整合素α5β1結合與腫瘤侵襲性增強和患者預后不良相關[61,82-84].Laminin的分泌可抑制侵襲性偽足形成, 而抑制laminin受體α3β1則能促進侵襲性偽足形成[66].整合素β1對促進侵襲性偽足成熟起重要作用.整合素β1激活Arg激酶, 使cortactin 421和466位點酪氨酸磷酸化, 從而誘導侵襲性偽足成熟[65,82,85,86].整合素β1將talin和moesin募集至侵襲性偽足核心, 使Na+-H+反向轉運蛋白NHE1貼附于侵襲性偽足[83].NHE1使侵襲性偽足核心處PH值升高, 激活cofilin依賴的肌動蛋白聚合[83,87]; 同時降低細胞外PH值,使可溶性MMP2和MMP9及不溶性MT1-MMP蛋白酶向侵襲性偽足運輸[88].另外, ECM交聯程度變化通過整合素β1-ECM結合位點介導, 非線性調控侵襲性偽足活性[89].侵襲性偽足相關MMPs降解ECM過程可釋放許多生物活性蛋白片段, 如laminin-111衍生肽AG73和C16, 可增強整合素β1依賴性侵襲性偽足形成[90].CD44可介導腫瘤細胞黏附于透明質酸、Ⅰ型及Ⅳ型膠原蛋白、laminin和fibronectin[91,92].CD44在fibronectin作用下可增強整合素α5β1活性, 促進侵襲性偽足成熟[82].在淋巴瘤細胞中,CD44參與募集MMP9至細胞腹側面過程[93].

2.2.3 細胞間接觸： 從原發(fā)灶向外播散過程中, 腫瘤細胞與基質細胞間存在持續(xù)較久的直接接觸.單個腫瘤細胞、促血管生成巨噬細胞和血管內皮細胞之間直接接觸形成的細胞復合體稱為TMEM(tumor microenvironment of metastasis)[94-96].TMEM通過巨噬細胞誘導的腫瘤細胞侵襲性偽足來破壞內皮細胞間黏附,從而增強血管通透性和跨內皮遷移, 促使腫瘤細胞侵入血管[60,97-99].乳腺癌組織標本中TMEM數目是轉移性復發(fā)獨立預后指標[94,98,99].TMEM中巨噬細胞-腫瘤細胞接觸誘導Notch1信號通路, 促使RhoA和Mena依賴性侵襲性偽足形成[59,97].

2.2.4 腫瘤缺氧： 腫瘤快速生長與血液供應不足導致腫瘤微環(huán)境缺氧.在多種類型腫瘤細胞中, 缺氧誘導的侵襲性偽足形成受轉錄因子缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor 1α, HIF-1α)調控[100].Diaz等[35]對頭頸部鱗狀細胞癌、肺癌和胰腺癌細胞研究發(fā)現, 在缺氧條件下HIF-1α可激活Notch信號通路上調金屬蛋白酶ADAM12表達及活性, 促進EGFR配體HB-EGF胞外結構域脫落, HB-EGF的釋放誘導腫瘤細胞侵襲性偽足形成.此外, 缺氧促進NADPH氧化酶系統(tǒng)產生活性氧(reactive oxygen species, ROS), 誘導侵襲性偽足形成[85].

2.2.5 外泌體： 外泌體促進非生長因子依賴性侵襲性偽足形成, 延長其存在時間, 誘導侵襲性偽足MT1-MMP胞外分泌, 不同于EGF對侵襲性偽足的快速誘導, 外源性外泌體誘導侵襲性偽足形成長達一小時, 提示兩種誘導因素引發(fā)侵襲性偽足形成過程可能不同[29].Mallawaaratchy等[101]對六種膠質母細胞瘤細胞系分泌的囊泡(extracellular vesicles, EVs, 主要為外泌體)進行蛋白質組學分析, 共鑒定公共蛋白145個, 通過侵襲性偽足實驗及高、低侵襲性腫瘤細胞表達比對分析, 發(fā)現14種EV差異候選蛋白與侵襲性偽足形成呈顯著正相關, 其中某些蛋白如整合素β1、肌動蛋白相關蛋白3等, 可能參與調控肌動蛋白聚合及侵襲性偽足形成.外泌體也可促進足體形成[102], 對外泌體調控侵襲性偽足形成研究有一定的借鑒作用.

3 基質硬度參與侵襲性偽足形成的調控機制

除前述基質蛋白自身生化信號誘導侵襲性偽足形成及活性外, 由基質蛋白沉積交聯形成的基質硬度力學信號也參與侵襲性偽足形成及活性調控.由于理想基質硬度實驗平臺缺乏及偽足檢測手段局限, 目前對于硬度力學信號誘導腫瘤細胞侵襲性偽足形成的相關調控機制依然知之甚少.

報道顯示, 基質硬度增加可誘導多種腫瘤細胞侵襲性偽足數目增多、活性增強.Parekh等[13]發(fā)現基質硬度在一個寬硬度彈性范圍內可調控乳腺癌細胞侵襲性偽足數量及活性, 硬度彈性系數為30 kPa時, 乳腺癌細胞侵襲性偽足相關ECM降解及侵襲性偽足數目均達峰值, 該硬度彈性系數位于腫瘤基質硬度范圍內; 當硬度彈性系數達到2 GPa時, 侵襲性偽足數目再次達到峰值, 出現基因表達改變, 說明細胞可識別基質硬度上限高達GPa級.Alexander等[3]在乳腺癌研究中發(fā)現, 抑制非肌性肌球蛋白Ⅱ、肌球蛋白輕鏈激酶和Rho相關激酶(rho-associated kinase, ROCK)活性均可降低侵襲性偽足相關ECM降解, 表明基質硬度信號傳導依賴于細胞收縮裝置, 盡管非肌性肌球蛋白ⅡA、ⅡB及磷酸化肌球蛋白輕鏈均不定位于侵襲性偽足中, 但力學傳感蛋白p130Cas(Cas)和黏著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)活性磷酸化形式卻均存在于活躍降解ECM的侵襲性偽足中, 且其磷酸化水平受肌球蛋白抑制劑影響, Cas或FAK過表達可增強高硬度基底表面生長的腫瘤細胞侵襲性偽足活性, 說明基質硬度增加可通過活化非肌性肌球蛋白Ⅱ-FAK/Cas通路促使乳腺癌細胞侵襲性偽足數目增多、活性增強.Jerrell等[103]對頭頸部鱗狀細胞癌和乳腺癌研究發(fā)現, 基質硬度增加可激活Rho/ROCK信號通路從而增強侵襲性偽足活性, 但ROCK1和ROCK2在基質硬度調控侵襲性偽足活性的過程中發(fā)揮不同作用,ROCK1通過激活非肌性肌球蛋白Ⅱ調控肌動球蛋白收縮, 而ROCK2通過激活LIM激酶(LIM kinase, LIMK)直接調控cofilin磷酸化, 二者以收縮性和非收縮性機制調控侵襲性偽足活性.Sedgwick等[11]在黑色素瘤、結腸癌和前列腺癌研究中發(fā)現, 不同基質硬度表面生長的腫瘤細胞可顯示兩種不同的侵襲模式, 在硬基質表面, 腫瘤細胞形成侵襲性偽足, 以間質細胞樣表型發(fā)生侵襲,Rac1激活及其下游信號促進侵襲性偽足形成; 但在軟基質表面, 腫瘤細胞釋放微囊泡而不形成侵襲性偽足, 以阿米巴樣表型發(fā)生侵襲, 抑制Rac1可激活RhoA/ROCK信號通路, 從而促進微囊泡形成分泌并抑制侵襲性偽足形成, 該研究說明, 基質硬度增加可激活Rac1, 通過抑制RhoA/ROCK信號通路促進侵襲性偽足形成.Zhao等[12]報道, 在涎腺腺樣囊性癌中, 基質硬度增加導致腫瘤細胞侵襲性偽足數量增多, MMP2、MMP9和MMP14表達增多, MMP組織抑制劑TIMP1、TIMP2和TIMP4表達減少, 與Sedgwick[11]報道的調控機制不同, 本研究發(fā)現基質硬度增加可上調RhoA、Rac1、ROCK1和ROCK2表達, 提示基質硬度增加可能激活RhoA/ROCK信號通路促進侵襲性偽足形成及MMPs活性, 而影響腫瘤細胞侵襲遷移能力.Chakraborty等[104]發(fā)現, 與正常肝細胞相比,肝癌細胞可過表達和分泌蛋白多糖Agrin, 促進Arp2/3復合物依賴性侵襲性偽足形成.進一步研究顯示[105], 基質硬度增加促進Agrin表達, Agrin經整合素-Lrp4/MuSK受體通路激活轉錄因子YAP, 從而增強肝癌惡性表型.由此推測基質硬度可能通過影響Agrin-YAP途徑調控肝癌細胞侵襲性偽足形成.

盡管多數報道認為基質硬度增加促進侵襲性偽足數量增多、活性增強, 但也有研究提出不同觀點.Gu等[106]對人成纖維細胞、臍靜脈內皮細胞、乳腺癌細胞和纖維肉瘤細胞的研究發(fā)現, 排除細胞因子、趨化因子和ECM蛋白類型等的影響, 柔軟ECM(低硬度)可抑制細胞間穩(wěn)定黏附連接形成、促進MMP分泌及ECM降解、以及誘導侵襲體樣突起(invadosome-like protrusion, ILP)形成, 在兩維和三維定向侵襲實驗中, 柔軟基質均更易促進ILP形成, 成纖維細胞僅在很窄基質硬度范圍內(0.1-0.4 kPa)自發(fā)形成ILP, 該過程受Src家族激酶調控; 而乳腺癌細胞和纖維肉瘤細胞可在很寬的基質硬度范圍內自發(fā)形成ILP, 但同樣發(fā)現低硬度基質更易促進ILP形成的現象,說明柔軟ECM促進細胞侵襲.腫瘤細胞異質性、硬度體外培養(yǎng)平臺標準化、以及模擬實體瘤硬度區(qū)間范圍的不統(tǒng)一可能部分地解釋上述研究結果間的差異.

此外, 基質硬度與細胞收縮性在調控侵襲性偽足形成過程中關系密切.細胞通過肌動球蛋白收縮產生的細胞內張力識別ECM力學特性, 這些收縮力傳遞至基質表面形成牽引應力, 介導細胞與ECM間力學相互作用[107].Jerrell等[108]利用不同硬度基底培養(yǎng)頭頸部鱗狀細胞癌并檢測細胞侵襲和收縮特性, 發(fā)現ECM降解和細胞牽引應力均與基質硬度呈線性正相關, 且牽引應力可預測ECM降解情況, 說明細胞力學在基質硬度參與侵襲性偽足形成及活性的調控作用中發(fā)揮重要作用.

4 結論

從基質硬度角度解析侵襲性偽足形成及活性的相關研究尚處起步階段, 許多問題目前依然無法解決, 如硬度及其它誘導因素在調控侵襲性偽足形成與活性時是否存在協(xié)同作用? 不同誘導因素在侵襲性偽足形成中所占權重及各自調控靶點及途徑？動物體內不同組織硬度模擬困難及侵襲性偽足示蹤檢測手段有限, 體外類組織硬度模型缺乏等.未來隨著高分辨率活體內顯微成像、高分辨率熒光原位雜交、體內硬度相關腫瘤模型和體外硬度實驗技術平臺等的發(fā)展和完善, 相信基質硬度調控侵襲性偽足形成機制的研究將會獲得更多進展,從而為腫瘤侵襲轉移新型診療手段的出現提供重要幫助.