王書云，袁王俊，劉亞芳，李書敏，劉麗君，李夢(mèng)煥，李欽*

1.河南大學(xué) 藥學(xué)院/河南省高校杜仲工程研究中心，河南 開(kāi)封 475004；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué) 藥化教研室/省部共建生物醫(yī)藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150081

忍冬LonicerajaponicaThunb.是忍冬科Caprifoliaceae忍冬屬多年生藤本植物[1]，其干燥花蕾或初開(kāi)的花入藥為金銀花，有“中藥中的抗生素”之稱，廣泛用于治療各種疾病，包括關(guān)節(jié)炎、糖尿病、發(fā)熱、感染、疼痛和腫脹等，主要化學(xué)成分有：有機(jī)酸、黃酮、氨基酸、核苷酸和醇類等[2-4]。除藥用外，金銀花也被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品及保健品等行業(yè)。

金銀花為我國(guó)40種常用大宗藥材品種之一，種質(zhì)資源豐富，河南、河北、山東等地均有大量栽培，但習(xí)慣認(rèn)為山東產(chǎn)量最大，而河南品質(zhì)最佳[5]。金銀花一年開(kāi)3～4茬花，合理的栽培技術(shù)對(duì)金銀花產(chǎn)量有較大影響。目前，金銀花種植主要以莖枝扦插為主，扦插繁殖可縮短進(jìn)入豐產(chǎn)期的年限，但長(zhǎng)期使用易致種質(zhì)退化，而用種子繁育幼苗適應(yīng)性強(qiáng)、易馴化，對(duì)長(zhǎng)距離引種及良種選育具有重要應(yīng)用價(jià)值[6]。研究發(fā)現(xiàn)金銀花種子有較強(qiáng)的休眠特性，自然條件下不經(jīng)處理發(fā)芽率極低[7]，限制了種子繁育的生產(chǎn)和規(guī)?；瘧?yīng)用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)金銀花種子的休眠機(jī)制，并找到快速解除休眠的方法，為種子繁育技術(shù)在金銀花種植及品種培育中的廣泛應(yīng)用提供可靠依據(jù)。

良好的種質(zhì)資源是種苗繁育的基本保障，但不同來(lái)源的金銀花種子質(zhì)量差異懸殊，對(duì)金銀花種子育苗的廣泛應(yīng)用有很大程度的影響。目前對(duì)金銀花種子的研究主要集中在種子特性、休眠機(jī)制及提高萌發(fā)率等方面[7-10]，未見(jiàn)種子質(zhì)量等級(jí)研究的相關(guān)報(bào)道，本課題組收集了全國(guó)主產(chǎn)區(qū)的20份金銀花種子，開(kāi)展了金銀花種子質(zhì)量檢測(cè)方法和質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)研究，初步制訂了金銀花種子的質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和等級(jí)評(píng)定方法，為行業(yè)或國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

1 材料

1.1 樣品

用于質(zhì)量檢驗(yàn)方法研究的種子，于2017年10月底采自新鄉(xiāng)市封丘縣東仲宮村金銀花GAP種植基地。用于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的種子，于2017年10月采自金銀花主產(chǎn)區(qū)(河南、山東、河北三省8個(gè)縣)，共20份，樣品具體信息見(jiàn)表1。所用種子均為采集的全成熟金銀花果實(shí)經(jīng)反復(fù)揉搓果肉，用水沖洗，紗布過(guò)濾，水沉去除漂浮在水面上的種子，剩余種子取出、陰涼處晾干，經(jīng)河南大學(xué)藥學(xué)院袁王俊副教授鑒定為金銀花L.japonicaThunb.的種子。

1.2 儀器

SMZ-161-BLED體式顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)，BSA224S電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，BPH-9082恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，粉碎機(jī)(GR150A，合肥榮事達(dá)小家電有限公司)。

1.3 種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法研究

1.3.1 種子真實(shí)性鑒定 隨機(jī)取適量健康飽滿的金銀花種子，先肉眼觀察種子顏色、形態(tài)、大小及表面特征，再用體式顯微鏡仔細(xì)觀察其性狀特征并拍照記錄，并用鏡臺(tái)測(cè)微尺測(cè)量種子的長(zhǎng)、寬、厚度，記錄并計(jì)算平均值和范圍[11]。

1.3.2 扦樣 參照《中國(guó)農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》(GB/T 3543.2-1995)“農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程——扦樣”，用“四分法”扦取樣品。凈度分析樣品取樣量應(yīng)≥2500粒種子，送檢樣品量為凈度分析樣品量的10倍。

1.3.3 凈度分析 扦取的樣品過(guò)18目篩，去除小顆粒雜質(zhì)及果皮，然后放在凈度工作臺(tái)上，分開(kāi)凈種子、廢種子、果皮和果柄、泥沙以及其他雜質(zhì)，分別稱質(zhì)量，平行重復(fù)3次，計(jì)算凈度，公式如下：

種子凈度=凈種子/(凈種子+廢種子+果皮與果柄+泥沙及其他)×100%

(1)

1.3.4 千粒質(zhì)量測(cè)定 按照百粒法、五百粒法和千粒法3種方法來(lái)測(cè)定種子的質(zhì)量。Ⅰ百粒法：隨機(jī)取100粒凈種子，稱質(zhì)量，平行重復(fù)6次；Ⅱ五百粒法：隨機(jī)取500粒凈種子，稱質(zhì)量，平行重復(fù)6次；Ⅲ千粒法：隨機(jī)取1000粒凈種子，稱質(zhì)量，平行重復(fù)3次。根據(jù)稱量結(jié)果，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)，測(cè)定值的重復(fù)間變異系數(shù)<4.0%有效。

1.3.5 水分測(cè)定 用低溫恒溫烘干法和高溫恒溫烘干法2種方法測(cè)定種子。隨機(jī)取4份凈種子，每份約2 g，其中2份直接放入潔凈干燥的稱量瓶中，剩余2份分別粉碎后放入潔凈干燥的稱量瓶中。分別將稱量瓶放置在(105±2)℃(低溫恒溫烘干法)、(130±2)℃(高溫恒溫烘干法)恒溫烘箱，間隔1 h取出，真空干燥器中冷卻至室溫后稱質(zhì)量，直至連續(xù)2次稱質(zhì)量差不超過(guò)0.02 g。測(cè)定時(shí)樣品暴露在空氣中的時(shí)間應(yīng)<2 min，稱量并記錄質(zhì)量變化，重復(fù)3次，含水量計(jì)算公式如下：

種子含水量=(烘干前供試樣質(zhì)量-烘干后供試樣質(zhì)量)/烘干前供試樣質(zhì)量×100%

(2)

1.3.6 胚率測(cè)定 隨機(jī)取凈種子100粒，于水中浸泡12 h，用解剖刀沿種子脊部?jī)蓚?cè)的凹溝切開(kāi)，觀察其胚，重復(fù)3次，按公式(3)計(jì)算。

胚率=有胚種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

(3)

1.3.7 生活力測(cè)定 隨機(jī)取凈種子50粒，于25 ℃浸泡種子6 h，沿胚的中軸線將種子切成兩半，用不同濃度的TTC溶液35 ℃避光染色，TTC濃度：0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、0.7%，染色后1、2、3、4、5、6、12、24 h，分別記錄生活力，以沸水煮過(guò)之后種子為空白對(duì)照，重復(fù)3次，按公式(4)計(jì)算。

生活力=有生活力總胚數(shù)/供試種子數(shù)×100%

(4)

1.3.8 相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定 隨機(jī)稱取凈種子0.5、1.0、1.5 g，分別用蒸餾水和雙蒸水沖洗3遍，浸泡在50 mL雙蒸水中，于25 ℃恒溫箱中，分別測(cè)定初始電導(dǎo)率記為：a1，浸泡2、4、8、12、24、32 h時(shí)的電導(dǎo)率記為：a2，將種子和浸泡液煮沸30 min后冷卻至室溫的電導(dǎo)率記為：a3，重復(fù)3次，按公式(5)計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率。

相對(duì)電導(dǎo)率=(a2-a1)/(a3-a1)×100%

(5)

1.3.9 發(fā)芽試驗(yàn) 隨機(jī)取凈種子100粒，室外沙藏75 d后取出，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率，種子以種皮開(kāi)裂，胚根凸出為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)。

發(fā)芽率=20 d內(nèi)全部發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

(6)

1.4 種子分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)研究

依據(jù)上述金銀花種子質(zhì)量的檢驗(yàn)方法，分別對(duì)種子的凈度、千粒質(zhì)量、含水量、胚率、生命活力、相對(duì)電導(dǎo)率、發(fā)芽率7個(gè)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)測(cè)得數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析、主成分分析和K-均值聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 真實(shí)性鑒定

金銀花種子近橢圓形或三角狀卵形，稍扁，種子長(zhǎng)1.7～4.0 mm，寬1.0～3.0 mm，厚0.5～2.0 mm。頂端稍圓，基部稍尖，表面灰褐色或褐色，種皮革制，種子背面中部有凸起的脊，脊兩側(cè)有2條明顯的凹溝，腹面脊不明顯，種臍位于極軸一端(圖1)。

注：A為種子背面；B為種子腹面。圖1 體視顯微鏡下金銀花種子表面特征圖

2.2 扦樣

采用“四分法”扦取金銀花種子試樣，種子凈度分析試驗(yàn)所需試樣質(zhì)量不少于8.4 g(不少于2500粒種子)，送檢樣品質(zhì)量不少于為84.0 g。

2.3 凈度分析

金銀花種子凈度分析結(jié)果見(jiàn)表2，3次平行重復(fù)金銀花種子的增失差均未偏離原始質(zhì)量的5%，因此，該方法和程序準(zhǔn)確可靠。

表2 金銀花種子凈度分析

表3 金銀花種子千粒質(zhì)量測(cè)定

2.4 千粒質(zhì)量測(cè)定

千粒質(zhì)量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3，百粒法、五百粒法、千粒法變異系數(shù)分別為1.56%、1.18%、0.88%，均未超過(guò)4.0%，所以百粒法、五百粒法、千粒法均可用于金銀花種子的質(zhì)量測(cè)定。為減少實(shí)際工作量，以百粒法作為種子千粒質(zhì)量的測(cè)定方法。

2.5 水分測(cè)定

不同方法測(cè)定的種子水分結(jié)果見(jiàn)表4，單因素方差分析結(jié)果顯示，種子整粒低溫恒溫(105±2)℃、整粒高溫恒溫(130±2)℃均在烘干3 h后水分含量無(wú)顯著變化，粉碎低溫恒溫(105±2)℃烘干2 h后無(wú)顯著變化，粉碎高溫恒溫(130±2)℃烘干1 h后水分含量變化不顯著，并且4種方法測(cè)定的結(jié)果無(wú)顯著性差異，綜合考慮實(shí)驗(yàn)操作的便捷性及穩(wěn)定性，確定以整粒低溫恒溫(105±2)℃烘干3 h作為金銀花種子含水量的測(cè)定方法。

2.6 胚率測(cè)定

沒(méi)有胚或胚發(fā)育不成熟的種子基本不會(huì)萌發(fā)，種子的胚率及成熟胚是保證種子萌發(fā)的基本條件，因此測(cè)定種子胚率對(duì)于評(píng)定種子的質(zhì)量來(lái)說(shuō)十分重要。金銀花種子胚率測(cè)試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胚率達(dá)到91%，基本滿足萌發(fā)需要。

2.7 TTC染色法測(cè)定種子生命活力

2.7.1 生活力鑒定標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)TTC染色法的原理與染色結(jié)果(見(jiàn)圖2)，確定種子有無(wú)生命活力的標(biāo)準(zhǔn)如下：符合下列染色情況之一的列為有生活力的種子：1)種胚全部為紅色，胚頂端顏色偏深的，如圖2A；2)胚軸為淡紅色，胚頂端或胚兩端為深紅色，如圖2B、2C；3)整體染色較淺，如圖2D；符合下列染色情況之一的列為無(wú)生活力的種子：1)胚軸為淺粉色，胚頂和胚兩端為白色，如圖2E；2)胚全部為白色，如圖2F。

表4 不同烘干時(shí)間金銀花種子水分測(cè)定

注：不同大寫字母表示同一列數(shù)據(jù)間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不同小寫字母表示同一行數(shù)據(jù)間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，下同。

2.7.2 生命活力測(cè)定結(jié)果 不同TTC濃度、染色時(shí)間、(35±1)℃的恒溫培養(yǎng)箱中測(cè)定的種子生命活力結(jié)果見(jiàn)表5。各濃度正常染色5 h后，染色種子數(shù)量均無(wú)顯著增加，用沸水煮過(guò)的種子無(wú)法正常染色。0.1%、0.2%和0.3% TTC濃度之間染色結(jié)果均存在顯著性差異，其中0.3% TTC染色效果最好；而0.3%、0.5%、0.7% TTC濃度之間染色結(jié)果均無(wú)顯著性差異，因此，3種染色濃度均可采用。為節(jié)約成本，故確定金銀花種子生命活力的測(cè)定方法：(35±1)℃恒溫培養(yǎng)箱中0.3% TTC染色5 h。

表5 不同染色時(shí)間TTC染色法測(cè)定金銀花種子生命活力

2.8 相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定

種子相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果顯示，相對(duì)電導(dǎo)率隨浸泡時(shí)間的增加而增大；0.5、1.0、1.5 g種子浸泡24 h后相對(duì)電導(dǎo)率與32 h無(wú)顯著差異；0.5、1.0、1.5 g種子浸泡24 h的相對(duì)電導(dǎo)率變異系數(shù)分別為1.80%、1.30%和2.20%。故確定將1.0 g種子在50 mL雙蒸水中浸泡24 h后測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率。

注：A～D.有生命活力的胚；E～F.無(wú)生命活力的胚。圖2 金銀花種胚TTC染色圖

表6 不同浸泡時(shí)間金銀花種子相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定結(jié)果

2.9 發(fā)芽試驗(yàn)

課題組前期對(duì)金銀花種子休眠機(jī)制和快速解除休眠方法進(jìn)行系統(tǒng)研究，本研究采用將種子于4 ℃條件下低溫層積75 d后，25 ℃光照恒溫培養(yǎng)箱中紙床培養(yǎng)測(cè)定萌發(fā)率，以種皮開(kāi)裂，胚根凸出為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)；首次計(jì)數(shù)為置床后第7天，末次計(jì)數(shù)為第20 d，以20 d內(nèi)全部種子發(fā)芽數(shù)計(jì)算萌發(fā)率。

2.10 種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法

本研究從凈度、千粒質(zhì)量、含水量、胚率、生命活力、相對(duì)電導(dǎo)率、發(fā)芽率試驗(yàn)7個(gè)指標(biāo)對(duì)金銀花種子質(zhì)量進(jìn)行研究，最終確定適用于金銀花種子質(zhì)量的檢驗(yàn)方法，見(jiàn)表7。

表7 金銀花種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法

2.11 種子分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

2.11.1 種子質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果 運(yùn)用表7所示的金銀花種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法，測(cè)定從主產(chǎn)區(qū)收集的20份種子的凈度、千粒質(zhì)量、含水量、胚率、生活力、相對(duì)導(dǎo)電率、發(fā)芽率7個(gè)質(zhì)量指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 20份不同來(lái)源的金銀花種子質(zhì)量分析結(jié)果(n=20)

2.11.2 分級(jí)指標(biāo)的確定

2.11.2.1 相關(guān)性分析 20份種子質(zhì)量指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表9。結(jié)果顯示：胚率與生命活力、相對(duì)電導(dǎo)率、發(fā)芽率顯著相關(guān)，r為0.774、-0.435、0.425；發(fā)芽率與胚率、生命活力、相對(duì)電導(dǎo)率顯著相關(guān)，r為0.425、0.440、-0.610，故胚率、生命活力和相對(duì)電導(dǎo)率均能在一定程度上反應(yīng)種子的活力，表征種子的發(fā)芽潛能，可用于種子質(zhì)量快速檢驗(yàn)。

2.11.2.2 主成分分析 根據(jù)20份種子的質(zhì)量檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行主成分分析，計(jì)算出各主成分的特征向量和貢獻(xiàn)率，并根據(jù)向量的絕對(duì)值將不同質(zhì)量指標(biāo)劃分到不同的主成分之中，結(jié)果見(jiàn)表10。主成分因子1、2、3特征值均大于1，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到78.97%，有很強(qiáng)的代表性，因此采用這3個(gè)主成分因子對(duì)金銀花種子質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。決定第一主成分大小的主要是胚率、生命活力、含水量和發(fā)芽率4個(gè)指標(biāo)，其中胚率的特征向量高達(dá)0.892，是金銀花種子分級(jí)的最主要指標(biāo)。第二主成分大小的決定性因素是相對(duì)電導(dǎo)率和千粒質(zhì)量，其值為0.955。決定第三主成分大小的主要是凈度，其值為0.909。在相關(guān)性分析和主成分分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和檢驗(yàn)的可操作性，擬定凈度、千粒質(zhì)量、含水量、胚率和發(fā)芽率5個(gè)指標(biāo)作為質(zhì)量分級(jí)的指標(biāo)。

表10 各質(zhì)量檢驗(yàn)指標(biāo)的特征值及貢獻(xiàn)率

注：*指標(biāo)在各因子中的最大值；—表示指標(biāo)對(duì)該因子基本無(wú)影響。

2.11.2 質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及評(píng)定方法 采用SPSS 19.0分析軟件對(duì)20批金銀花種子凈度、千粒質(zhì)量、含水量、胚率和發(fā)芽率5個(gè)指標(biāo)進(jìn)行K-均值聚類分析，將種子質(zhì)量分為3個(gè)等級(jí)，其余為不合格。綜合指標(biāo)K聚類分析結(jié)果見(jiàn)表11，最終制定的金銀花種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表12。具體等級(jí)評(píng)定方法如下：根據(jù)表12種子凈度、千粒質(zhì)量、含水量、胚率、發(fā)芽率和性狀特征進(jìn)行單項(xiàng)指標(biāo)的定級(jí)，Ⅲ級(jí)以下定為等外。6項(xiàng)指標(biāo)均在表12同一質(zhì)量級(jí)別時(shí)，直接定級(jí)；6項(xiàng)指標(biāo)有1項(xiàng)在Ⅲ級(jí)以下，定為等外；若不在同一級(jí)別，按低的級(jí)別定級(jí)。

表11 綜合指標(biāo)K聚類分析結(jié)果

表9 20份不同來(lái)源的金銀花種子質(zhì)量檢測(cè)指標(biāo)間的相關(guān)性分析

注：*P<0.05，**P<0.01。

表12 金銀花種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

3 結(jié)論與討論

本課題組開(kāi)展了金銀花種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法的研究，并對(duì)不同來(lái)源的金銀花種子質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行檢驗(yàn)，通過(guò)相關(guān)性分析、主成分分析和K-均值聚類分析，確定以凈度、千粒質(zhì)量、含水量、胚率、發(fā)芽率和性狀特征6項(xiàng)指標(biāo)初步制定金銀花種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和具體等級(jí)評(píng)定方法。

主成分分析篩選出胚率、生命活力、含水量、發(fā)芽率、千粒質(zhì)量、凈度和相對(duì)電導(dǎo)率對(duì)金銀花種子質(zhì)量影響較大，而我們最終選擇了凈度、千粒質(zhì)量、含水量、胚率、發(fā)芽率和性狀特征作為質(zhì)量分級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)。雖然數(shù)據(jù)分析時(shí)未對(duì)種子的性狀特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，但性狀特征是種子交易時(shí)最直觀的重要參考，因此，最終把性狀特征作為種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的依據(jù)之一。發(fā)芽率直接反映種子在田間的出苗率，以其為最重要的質(zhì)量指標(biāo)與生產(chǎn)需求相符合[12]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)芽率也是最重要的指標(biāo)，其特征向量絕對(duì)值為0.662。主成分分析支持生命活力作為金銀花種子質(zhì)量的重要依據(jù)，本文通過(guò)TTC染色法檢測(cè)種子的生命活力，多數(shù)情況下，生命活力與發(fā)芽率有高度相關(guān)性，但檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)有數(shù)份種子生命活力較高，但發(fā)芽率不高。金銀花種子雖有休眠特性，但種子成熟后通過(guò)GA3處理，可解除休眠(課題組前期研究結(jié)果)，20 d內(nèi)發(fā)芽率就可完成檢查，因此，最終選擇了直接檢測(cè)發(fā)芽率而放棄生命活力作為金銀花種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的依據(jù)。