唐森，農(nóng)佳慧，趙海燕，吳國(guó)勇，張鵬*

1.廣西科技師范學(xué)院 食品與生化工程學(xué)院，廣西 來(lái)賓 546119；2.廣西科技師范學(xué)院 特色瑤藥資源研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 來(lái)賓 546119

莪術(shù)，姜科姜黃屬多年生宿根草本，別名烏姜、姜七、黑心姜、藍(lán)心姜等，主產(chǎn)于四川、廣西、浙江。莪術(shù)的根莖性溫，具有苦味和辛味，在醫(yī)藥行業(yè)中，常用于化瘀行氣、消積止痛等，其主要成分莪術(shù)油在臨床上用于治療腫瘤、病毒和預(yù)防早孕等。莪術(shù)多糖具有降血脂、降血糖、增強(qiáng)免疫力等功能[1-3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，莪術(shù)具有抗癌、抗炎、抗血栓、保肝、降血脂等作用[4-9]。研究證明，植物多糖是藥用植物水煎劑的主要成分，具有復(fù)雜的生物活性和功能，被認(rèn)為是中藥發(fā)揮傳統(tǒng)治療作用的主要藥效物質(zhì)之一。近年來(lái)，由于不同植物來(lái)源的多糖結(jié)構(gòu)組成復(fù)雜多變、功能活性多種多樣，關(guān)于多糖提取、分離等研究受到學(xué)者們的重視。

目前常用的植物多糖提取方法有溶劑提取法、超聲波輔助溶劑提取法、微波輔助溶劑提取法、超聲-微波協(xié)同提取法、酶解法、超臨界流體萃取法等[10-13]。熱水提取法是目前最常用的植物多糖提取方法，其具有操作簡(jiǎn)單、設(shè)備要求低、提取產(chǎn)物綠色無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)是一種回歸試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)采集數(shù)據(jù)，采取多元二次回歸方程進(jìn)行擬合自變量(試驗(yàn)因素)和響應(yīng)值(試驗(yàn)指標(biāo))之間的函數(shù)關(guān)系，建立相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型，對(duì)二次多項(xiàng)式回歸方程的計(jì)算分析來(lái)尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，是解決多變量問(wèn)題的一種統(tǒng)計(jì)方法，其預(yù)測(cè)結(jié)果可信度高，能夠快速確定多因素系統(tǒng)的最佳實(shí)驗(yàn)條件[14-15]。本實(shí)驗(yàn)擬以莪術(shù)為原料，采用熱水提取法對(duì)莪術(shù)多糖進(jìn)行提取，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)莪術(shù)多糖的熱水提取條件進(jìn)行優(yōu)化，以確定莪術(shù)多糖的最佳提取工藝條件，為以莪術(shù)為原料的植物多糖在中醫(yī)藥領(lǐng)域的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

循環(huán)水多用真空泵[SHZ-D(III)型，鞏義市科瑞儀器有限責(zé)任公司]；恒溫水浴鍋(HH-S4型，金壇市醫(yī)療儀器廠)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ-300DB型，昆山市超聲儀器有限公司)；紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)[UV-9600型，北京北分瑞利分析儀器(集團(tuán))公司]；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(H3-20KR型，湖南可成儀器設(shè)備有限公司)；電子分析天平(FA-2004B型，上海越平科學(xué)儀器有限公司)；玻璃儀器氣流烘干器(C-20型，上海貝侖儀器設(shè)備有限公司)；中草藥粉碎機(jī)(FW-135型，天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試藥

葡萄糖、濃硫酸、石油醚(沸程30～60 ℃)苯酚、乙醇、正丁醇、三氯甲烷均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?，蒸餾水。

莪術(shù)采購(gòu)于亳州市眾益堂中藥材銷售有限公司，經(jīng)廣西科技師范學(xué)院特色瑤藥資源研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室張鵬博士鑒定為莪術(shù)正品。

2 方法

2.1 莪術(shù)多糖的提取

干燥莪術(shù)經(jīng)中草藥粉碎機(jī)粉碎。稱取粉碎過(guò)篩(80目)的莪術(shù)粉末40 g置圓底燒瓶中，采用索氏提取器用石油醚提取2.0 h脫脂后，過(guò)濾，濾渣揮干溶媒備用。精確稱取1.00 g 莪術(shù)固體粉末，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案所需提取溫度、提取時(shí)間、液料比進(jìn)行提取操作，所得提取液經(jīng)抽濾，離心，減壓濃縮回收溶劑至一定體積，即得莪術(shù)粗多糖提取液。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取0.010 0 g葡萄糖對(duì)照品置于100 mL容量瓶中，加入適量蒸餾水定容，充分搖勻，得到100 μg mL-1葡萄糖對(duì)照品溶液。放置于4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 分別吸取 100 μg mL-1葡萄糖對(duì)照液0、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL分置于具塞試管中，各加蒸餾水至2.0 mL，再加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 6%的苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0 mL(與液面垂直加入，勿接觸試管壁，便于反應(yīng)液充分混合)，搖勻后室溫放置5 min，然后將具塞試管放置于40 ℃水浴中反應(yīng)20 min，取出冷卻至室溫。另以蒸餾水同上操做作，此為空白對(duì)照，在最大吸收波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光值[16-17]。以葡萄糖質(zhì)量濃度(μg mL-1)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：Y=0.083 2X-0.017 04，r=0.999，線性范圍為3.75～11.25 μg mL-1。

圖1 葡萄糖和莪術(shù)多糖顯色后400～800 nm全波長(zhǎng)掃描圖

2.3 莪術(shù)多糖提取率的測(cè)定

吸取2 mL莪術(shù)粗多糖提取液于容量瓶中，加入適量蒸餾水進(jìn)行稀釋，精密吸取2 mL莪術(shù)粗多糖稀釋液于具塞試管中，加入Savage試劑(V三氯甲烷∶V正丁醇=4∶1)，混勻，2000 r min-1離心20 min，將上清液轉(zhuǎn)至刻度試管中，得到供試品溶液[18-19]。按照項(xiàng)2.2項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，按公式(1)計(jì)算莪術(shù)粗多糖溶液中多糖的含量。

莪術(shù)多糖提取率=(C×D×V)/M×100%

(1)

式中：C為供試液多糖質(zhì)量濃度(μg mL-1)，D為稀釋倍數(shù)，M為樣品質(zhì)量(μg)。V為最初樣品定容體積(mL)。

2.4 莪術(shù)多糖提取的單因素試驗(yàn)

以液料比、提取溫度、提取時(shí)間為單因素進(jìn)行試驗(yàn)，篩選出各因素的最適條件。

2.4.1 液料比對(duì)莪術(shù)多糖提取率的影響 固定提取時(shí)間為60 min，提取溫度為80 ℃的條件下，考察不同的液料比100∶1、120∶1、140∶1、160∶1、180∶1對(duì)莪術(shù)多糖提取率的影響。

2.4.2 提取溫度對(duì)莪術(shù)多糖提取率的影響 固定料液比為140∶1，提取時(shí)間為60 min，考察不同提取溫度50、60、70、80、90 ℃對(duì)莪術(shù)多糖提取率的影響。

2.4.3 提取時(shí)間對(duì)莪術(shù)多糖提取率的影響 固定液料比為140∶1，提取溫度為80 ℃，考察不同提取時(shí)間30、60、90、120、150、180 min對(duì)莪術(shù)多糖提取率的影響。

2.5 BBD響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，使用軟件Design-Expert(版本8.0.6)中Box-Behnken Design(BBD)進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取液料比(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C)3個(gè)對(duì)莪術(shù)多糖提取效果有影響的試驗(yàn)因素為自變量，分別以1、0、-1對(duì)每個(gè)自變量的高、中、低實(shí)驗(yàn)水平進(jìn)行編碼。以莪術(shù)多糖提取率(Y)為響應(yīng)值，建立三因素三水平BBD響應(yīng)面試驗(yàn)研究，利用D-E軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，各實(shí)驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 BBD響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

3 結(jié)果與分析

3.1 莪術(shù)多糖提取的單因素試驗(yàn)

3.1.1 液料比對(duì)莪術(shù)多糖提取率的影響 見(jiàn)圖2，液料比為140∶1時(shí)多糖提取率達(dá)到峰值，為1.11%。料液比達(dá)到140∶1以后多糖提取率緩慢下降，這是因?yàn)樵龃笕軇┯昧浚惯^(guò)多無(wú)用的雜質(zhì)溶入到了溶液中，同時(shí)也為后續(xù)回收溶劑的操作帶來(lái)不便。因此確定最佳液料比為140∶1 。

圖2 液料比對(duì)多糖提取率影響

3.1.2提取溫度對(duì)莪術(shù)多糖提取率的影響 見(jiàn)圖3，當(dāng)提取溫度為80 ℃時(shí)，多糖提取率達(dá)到峰值，為1.35%。當(dāng)繼續(xù)升高提取溫度后，多糖提取率呈下降趨勢(shì)。當(dāng)溫度高于80 ℃后，由于高溫使熱穩(wěn)定性差的多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生降解從而造成多糖提取率降低。因此確定最佳提取溫度為80 ℃。

圖3 提取溫度對(duì)多糖提取率影響

3.1.3提取時(shí)間對(duì)莪術(shù)多糖提取率的影響 見(jiàn)圖4，提取時(shí)間為150 min時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大值，為1.57%。當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到150 min后多糖提取率下降，由于時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，一方面雜質(zhì)成分也隨著提取出來(lái)，另一方面長(zhǎng)時(shí)間煎煮會(huì)導(dǎo)致多糖穩(wěn)定性下降。因此確定最佳提取時(shí)間為150 min。

圖4 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率影響

3.2 BBD響應(yīng)面試驗(yàn)

3.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)響應(yīng)面法設(shè)計(jì)三因素試驗(yàn)考察，本次實(shí)驗(yàn)共有分為兩種類型的17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，第一類為析因點(diǎn)，是自變量取值在A、B、C所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，析因點(diǎn)共有12個(gè)。第二類為位于區(qū)域中心的各自變量均為零水平的重復(fù)試驗(yàn)點(diǎn)，用來(lái)檢驗(yàn)回歸方程與中心試驗(yàn)點(diǎn)的擬合情況，同時(shí)可以提供剩余自由度，以提高試驗(yàn)的精度，本次試驗(yàn)設(shè)計(jì)的零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。對(duì)軟件設(shè)計(jì)出的試驗(yàn)方案見(jiàn)表2，按2.1項(xiàng)進(jìn)行多糖提取試驗(yàn)，按公式(1)求得相應(yīng)條件下的多糖提取率。應(yīng)用Design expert 8.0.6.1軟件對(duì)所得試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，所得結(jié)果見(jiàn)表 3。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 響應(yīng)面方差分析結(jié)果

注：*P<0.05，**P<0.01；r=0.985 8。

以 A、B、C(提取時(shí)間)為自變量，Y(多糖提取率)為響應(yīng)值，建立莪術(shù)多糖提取率與提取條件的二次多項(xiàng)式回歸方程：Y=1.57-0.047A+0.11B-0.006 25C+0.012AB+0.012AC-0.015BC-0.1A2-0.14B2-0.11C2。

由表3回歸模型方差分析結(jié)果可知：選用模型P<0.000 1，F(xiàn)=53.88，說(shuō)明該二次回歸模型極顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。失擬項(xiàng)不顯著(P=0.276 8>0.05)，試驗(yàn)誤差較小，不存在失擬因素。模型r=0.985 8，說(shuō)明有約98.58%的莪術(shù)多糖提取率的變化可以用該模型來(lái)解釋。綜上所述，該模型擬合程度較好，可以用來(lái)優(yōu)化和預(yù)測(cè)莪術(shù)多糖最佳提取工藝條件。由二次回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)可知，A、B對(duì)莪術(shù)多糖提取率的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)提取率的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。試驗(yàn)因數(shù)A、B、C對(duì)莪術(shù)多糖提取率的影響大小依次為：B>A>C。

3.2.2等高線圖和3D響應(yīng)面圖分析 為直觀地考察各個(gè)因素之間的交互作用對(duì)提取率的影響，以莪術(shù)多糖提取率(Y)為響應(yīng)值運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到由響應(yīng)值與自變量A、B、C 所構(gòu)成的3D響應(yīng)面圖及其二維平面上投影所得的等高線圖。分析結(jié)果見(jiàn)圖5～7。

從圖5可知：當(dāng)液料比增大時(shí)，多糖提取率的變化趨勢(shì)為先增大后減小。但是當(dāng)提取溶劑使用過(guò)量時(shí)，擴(kuò)散達(dá)到平衡，增大提取溶劑量不會(huì)促進(jìn)多糖的溶出，反而影響溶劑的回收效率。當(dāng)液料比一定時(shí)，隨提取溫度的增加，多糖的提取率變化趨勢(shì)為先增加后降低。從圖中可明顯看出液料比的曲線比提取溫度的曲線更陡峭，表明提取溫度和液料比交互時(shí)，液料比影響響應(yīng)面值變化程度更為敏感，即料液比的交互作用對(duì)莪術(shù)多糖的提取率影響較大。

圖5 多糖提取率隨溫度和料液比變化的響應(yīng)面與等高線

由圖6可知：等高線近似橢圓形，表明提取時(shí)間和料液比交互關(guān)系顯著。當(dāng)提取時(shí)間固定時(shí)，莪術(shù)多糖提取率隨液料比的增大呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。在液料比較少的情況下，提取溶液容易達(dá)到飽和。增大溶劑用量，使過(guò)多無(wú)用的雜質(zhì)溶入到了溶液中，同時(shí)也為后續(xù)回收溶劑的操作帶來(lái)不便。料液比和提取時(shí)間的曲線陡峭程度相近，說(shuō)明兩因素對(duì)多糖提取率的影響程度相差不大。

從圖7可知，在溫度固定時(shí)，莪術(shù)多糖的提取率隨著提取時(shí)間增長(zhǎng)呈現(xiàn)出也先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)提取時(shí)間固定，隨著溫度增加時(shí)，多糖提取率先升高后降低。觀察其陡峭程度，可看出時(shí)間的曲線比溫度的曲線更陡峭，則時(shí)間對(duì)響應(yīng)面值的影響程度比提取溫度的影響程度高。

圖6 多糖提取率隨時(shí)間和液料比變化的響應(yīng)面與等高線

圖7 多糖提取率隨時(shí)間和溫度變化的響應(yīng)面與等高線

3.2.3 響應(yīng)面模型驗(yàn)證 經(jīng)過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化分析后，最終得出優(yōu)化后莪術(shù)多糖的提取工藝條件為：液料比135.67∶1，提取溫度83.63 ℃，提取時(shí)間148.02 min，預(yù)測(cè)得到莪術(shù)多糖提取率的理論值為1.592 6%。為驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用上述優(yōu)化參數(shù)提取莪術(shù)多糖，考慮到試驗(yàn)條件的實(shí)際可操作性，將工藝參數(shù)修正為液料比136∶1，提取時(shí)間148 min，提取溫度84 ℃。該工藝合理、可行。

4 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)之上，選取提取溫度、提取時(shí)間、液料比為考察因素，利用Box-Behnken方法進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化莪術(shù)多糖的提取工藝。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，建立的二元多項(xiàng)式回歸方程的擬合情況較好，由其預(yù)測(cè)并根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行修正后的莪術(shù)多糖提取最佳工藝為：液料比136∶1，提取時(shí)間148 min，提取溫度84 ℃。在該提取條件下多糖實(shí)際提取率(1.593±0.005)%?？梢?jiàn)，運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化莪術(shù)多糖提取工藝參數(shù)合理可靠，為后續(xù)莪術(shù)多糖進(jìn)一步研究提供相應(yīng)依據(jù)，為擴(kuò)大傳統(tǒng)中藥莪術(shù)的應(yīng)用范圍提供幫助。