童匯慧，張威迪，胡惠文，程 逵

(1.浙江工商大學(xué)，浙江 杭州 310027；2.浙江大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，浙江 杭州 310027)

1 前 言

醫(yī)用縫合線是外科手術(shù)中必不可少的醫(yī)療耗材，其性能的優(yōu)劣對(duì)術(shù)后恢復(fù)等具有很大影響。人體術(shù)后縫合部位由于細(xì)菌殘留等原因可能會(huì)產(chǎn)生細(xì)菌感染[1-2]，而細(xì)菌感染的過程常為細(xì)菌先期附著于植入材料表面，進(jìn)而形成一層“生物膜”保護(hù)細(xì)菌，之后細(xì)菌繁殖、遷移感染周圍組織。在這種情況下，注射或口服抗生素藥物，不僅抗菌效果有限，而且全身性的藥物使用會(huì)產(chǎn)生一定的副作用，有可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性等[3]。

因此，對(duì)于醫(yī)用縫合線而言，采用縫合線表面載抗菌藥，將有可能使藥物直接作用于細(xì)菌，提升殺菌和抑菌的效果，并通過抑制“生物膜”的形成抑制細(xì)菌感染的進(jìn)一步發(fā)展，是一種直接而高效地抑制細(xì)菌染的方式[2，4-6]。

采用簡單的表面吸附方式可以在手術(shù)縫合線負(fù)載一層抗菌藥物，但藥物大多在與體液接觸初期爆發(fā)性釋放，初始濃度過大、持續(xù)釋放性能差。這既不利于傷口恢復(fù)，也不利于縫合線表面抗菌作用的持續(xù)[7]。Hammond教授研究組[8]利用噴涂層層組裝技術(shù)，以抗生素萬古霉素、生物多糖等作為構(gòu)筑基元在醫(yī)用繃帶表面沉積了負(fù)載有萬古霉素的聚合物膜。而且，表面沉積的藥物膜使得醫(yī)用繃帶表面更光滑，萬古霉素藥物分子可以隨著聚β胺酯的降解而釋放出來，保持良好的藥物活性，對(duì)引起傷口感染的病菌有著顯著的抑制效果。因此，抗菌時(shí)效與縫合線作用相吻合的抗菌表面的構(gòu)建對(duì)醫(yī)用縫合線具有重要的意義。

近年來，貽貝等生物的粘附性引起廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，此類粘附特性主要來源于3，4-二羥基-1-苯丙氨酸和富含賴氨酸的蛋白質(zhì)[9]。而與3，4-二羥基-1-苯丙氨酸結(jié)構(gòu)相似的多巴胺同樣可以在各種無機(jī)和聚合物表面形成聚多巴胺(PDA)薄膜[10]。一般認(rèn)為，單體多巴胺在堿性溶液中(p H＞7.5)被氧化而自發(fā)自聚合是其主要原因：多巴胺的鄰苯二酚基團(tuán)被氧化形成醌鍵，生成多巴胺醌化物；之后多巴胺醌化物和多巴胺之間產(chǎn)生歧化反應(yīng)，生成半醌自由基，然后偶合形成交聯(lián)鍵，進(jìn)一步增加了它的內(nèi)聚力，從而形成了緊密的交聯(lián)復(fù)合層[11]。這種機(jī)制可以方便地將PDA 粘附到多種不同種類材料表面[12]，且反應(yīng)條件非常溫和，適用條件也非常廣泛。

PDA 同時(shí)具有良好的生物相容性、可降解性及細(xì)胞響應(yīng)性[13]，非常適用于固載抗菌物質(zhì)形成具有抗菌性能的表面。Mao等[14]在棉織物表面利用PDA 的還原性沉積生成了銀納米顆粒，制造出抗菌棉織物，在大腸桿菌抗菌測試中幾乎可以殺死所有細(xì)菌，并且洗滌30次后，仍能持續(xù)殺死99.9%的大腸桿菌。Sileika等[15]通過在聚碳酸酯基板沉積PDA 厚薄膜，隨后嫁接聚乙二醇支鏈并在硝酸銀溶液中反應(yīng)使銀納米粒子沉積PDA 涂覆的基材上，所得到的涂層不僅具備殺菌性還能抑制細(xì)菌的附著。然而，考慮到醫(yī)用縫合線需植入人體，采用納米顆粒進(jìn)行抗菌還需進(jìn)一步研究。

鑒于此，本研究利用PDA 的特性，將三氯生(TCS，二氯苯氧氯酚，C12H7Cl3O2，)固載于醫(yī)用縫合線表面形成了抗菌涂層，并對(duì)其固載特性和抗菌特性進(jìn)行研究和討論。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 表面涂層制備與表征

涂層制備所需的原料試劑均為市售，TCS，純度為97%；鹽酸多巴胺，純度為98%，無水甲醇、Tris均為分析純，醫(yī)用縫合線為聚乙醇酸(PGA)。

首先，量取150m L去離子水，加入182.1mg三羥甲基氨基甲烷(Tris)到水溶液中調(diào)節(jié)溶液p H 值至弱堿性，待Tris攪拌溶解后，按設(shè)定比例加入鹽酸多巴胺，形成PDA 溶液；之后將適量TCS溶解于乙醇中，形成TCS乙醇溶液；將兩種溶液混合形成混合溶液，封口并留下氣孔，并不斷攪拌。24h后，將醫(yī)用縫合線截取適當(dāng)長度后，放入前述混合溶液中，37℃烘箱靜置24h。取出后用去離子水沖洗后烘干，即獲得具有PDA-TCS涂層的縫合線?？p合線表面形貌采用掃描電子顯微鏡(SU-70，SEM)觀察，并利用電子能譜儀(EDS)分析表面成分的變化。

2.2 TCS的體外釋放實(shí)驗(yàn)

將具有PDA-TCS涂層的縫合線精確稱取質(zhì)量后放入20m L混合磷酸鹽緩沖液(PBS)中，置于37℃烘箱中。分別在浸泡4h、8h、1d和2d后將對(duì)應(yīng)的醫(yī)用縫合線取出，用去離子水沖洗去除表面殘余PBS緩沖液后放入烘箱中烘干。之后，通過甲醇溶液超聲處理50min提取縫合線表面的殘余TCS，并利用紫外-可見吸收光譜(Shimadzu UV1800，UV-Vis)測定其吸光度，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TCS含量并換算成縫合線表面浸泡后剩余的TCS 量。標(biāo)準(zhǔn)曲線采用已知濃度的TCS甲醇溶液在UV-Vis光譜中280nm 左右處的吸收峰強(qiáng)度進(jìn)行繪制，如圖1所示。

圖1 TCS濃度測量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of concentration determination

2.3 體外抗菌實(shí)驗(yàn)

采用體外抗菌實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)表面PDA-TCS涂層的抗菌效果。先用無菌棉拭子蘸取1.5×106個(gè)/m L 菌液，用棉拭子均勻涂抹整個(gè)瓊脂培養(yǎng)基表面，反復(fù)3次，每次將平板旋轉(zhuǎn)60°，最后沿周邊旋轉(zhuǎn)2圈，待平面上的水分被瓊脂完全吸收后，再用無菌鑷子將滅菌后的縫合線放在固體培養(yǎng)基平板上，每個(gè)樣品間距不少于24mm，樣品中心距邊緣不少于15mm，在細(xì)菌接種后15min內(nèi)貼完。然后置于37℃保溫箱中分別培養(yǎng)1、3和7d，觀察抑菌圈的范圍，以評(píng)價(jià)具有涂層的縫合線的抗菌性能。

3 結(jié)果與討論

3.1 PDA-TCS涂層表面形貌及TCS含量

縫合線表面初始為淺藍(lán)色，經(jīng)溶液浸泡后表面轉(zhuǎn)變?yōu)樯钭厣?，如圖2所示。EDS分析顯示，涂層中有較高含量的Cl元素。由于縫合線本身不含Cl，能譜結(jié)果證明縫合線表面已有TCS的存在。進(jìn)一步對(duì)典型形貌(5g/L的溶液浸泡)的觀察顯示(圖3)，組成縫合線的纖維表面變得較為粗糙，且在高放大倍數(shù)下，可以進(jìn)一步觀察到其表面形成了較多的顆粒析出。綜合考慮涂層制備過程、多巴胺的自聚合過程、縫合線表面轉(zhuǎn)變?yōu)樽厣约癟CS不溶于水等特性，縫合線表面形成了PDA-TCS涂層。

圖2 縫合線及表面化學(xué)成分Fig.2 Appearance and surface chemical composition of the suture

圖3 PDA-TCS涂層的表面形貌照片F(xiàn)ig.3 Typical surface morphology of coated suture

圖4為不同濃度的TCS 對(duì)PDA-TCS 涂層表面形貌的影響。從圖可見，縫合線的表面形貌隨著溶液中TCS含量的變化而產(chǎn)生顯著變化。隨著溶液中TCS含量的增加，縫合線紡織纖維的表面逐漸變的更為粗糙，表面覆蓋膜層及顆粒量顯著增加。利用EDS計(jì)算而來的Cl元素原子百分含量結(jié)果顯示，隨著浸泡溶液中TCS含量的增加，表面Cl元素含量從1.0%逐漸增加到1.2%、1.6%和1.7%。這與SEM 的觀察結(jié)果完全一致。這顯示，縫合線表面的TCS含量可以通過浸泡溶液中的TCS含量進(jìn)行調(diào)控。

圖4 TCS濃度對(duì)PDA-TCS涂層表面形貌的影響照片(a)3g/L；(b)4g/L；(c)5g/L；(d)6g/LFig.4 Effect of TCS concentration on surface morphology of the coated suture (a)3g/L；(b)4g/L；(c)5g/L；(d)6g/L

3.2 PDA-TCS涂層的穩(wěn)定性及TCS的釋放行為

為了進(jìn)一步研究縫合線表面的TCS在體液中的穩(wěn)定性和釋放特性，采用模擬體液浸泡的方案，將具有PDA-TCS涂層的縫線放入PBS緩沖液中，并保持在37℃烘箱中，分別研究在浸泡4h、8h、1d和2d后的表面氯含量，并觀察其表面形貌的變化。

根據(jù)圖1的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以獲得縫合線表面經(jīng)不同浸泡時(shí)間TCS釋放量。對(duì)檢測模擬生理?xiàng)l件下(PBS，p H=7.4)涂層的體外累計(jì)釋放特性分析如圖5所示。從圖可見，TCS的釋放與涂層負(fù)載的TCS含量相關(guān)，相對(duì)TCS含量較高的涂層在浸泡初期即釋放出負(fù)載量近60%以上的TCS。而TCS含量相對(duì)較低的涂層僅釋放出約40%。但隨著浸泡時(shí)間的延長，涂層所釋放出的TCS相對(duì)量趨于一致。究其原因，可能是第一階段為接近PDA涂層表層的TCS的釋放，然后隨著時(shí)間的延長，由于鍵合作用吸附在PDA 上面的TCS，隨著PDA的逐漸降解隨之釋放，而這個(gè)過程進(jìn)行得較為緩慢。這種釋放行為顯示，部分與PDA 結(jié)合的TCS可以較為穩(wěn)定地存在于涂層之中，而涂層降解較為緩慢，這對(duì)于縫合線具有長效地有抗菌作用是十分有益的。

圖5 醫(yī)用縫線表面TCS的釋放Fig.5 Release of TCS from suture surface

如圖6的掃描電鏡表面形貌分析所示，在包覆完畢后，縫線表面的PDA 涂層厚且覆蓋廣，可以觀察到縫線纖維本身的結(jié)構(gòu)幾乎都被遮蓋。在釋放4h后，表面的涂層有部分減少，但仍覆蓋了縫線的絕大部分面積，且纖維與纖維之間可以明顯觀察到涂層在縫隙處減少。在釋放1d后，這種情況尤為明顯，已露出了縫合線原有的纖維之間的空隙，這顯示涂層的部分溶解及TCS的釋放。而當(dāng)浸泡2d后，這種情況變得更為明顯。這顯示涂層在與模擬體液接觸的條件下逐漸部分溶解，部分TCS可以釋放到溶液中。表面形貌變化與涂層表面及浸泡液中的TCS含量的變化趨勢相當(dāng)一致。

圖6 TCS釋放不同時(shí)間后表面形貌化照片(a)4h；(b)8h；(c)1d；(d)2dFig.6 Morphology after different time of TCS release(a)4h；(b)8h；(c)1d；(d)2d

3.3 PDA-TCS涂層的抗菌性能

不同含量TCS 的涂層的抗菌效應(yīng)如圖7 所示。棉拭子將金黃色葡萄球菌落均勻涂抹整個(gè)瓊脂培養(yǎng)基，并放置一段具有PDA-TCS涂層的縫合線后，一開始菌落均勻地充滿整個(gè)培養(yǎng)基，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，3d后縫合線周圍的菌落消失。這表明制備得到的涂層具有一定的抗菌效果。而且，從圖可見，隨著TCS負(fù)載量的提高，縫線周圍抑菌區(qū)域的面積有所增大，這表明抗菌性能的提高。涂層對(duì)不同種類的細(xì)菌均具有殺滅效果。

結(jié)合涂層穩(wěn)定性和TCS釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這一結(jié)果顯示初期能夠穩(wěn)定存在于縫合線表面的涂層及其所含的TCS有效地殺滅了細(xì)菌，抑制菌落的形成，從而起到抑制細(xì)菌感染的作用。也就是說，制備所得的PDA-TCS涂層的抗菌性能具有一定長效性。這對(duì)醫(yī)用縫合線所經(jīng)常面臨的術(shù)后初期的細(xì)菌感染是非常有益的。而且，其對(duì)醫(yī)用縫合線表面特性未做過多改變，特別適用于需要較快降解的醫(yī)用縫合線。

圖7 具有不同含量TCS的涂層的抗菌效應(yīng)(a1)～(d1)：金黃葡萄球菌；(a2)～(d2)：大腸桿菌；(a1)～(a2)：3g/L；(b1)～(b2)：4g/L；(c1)～(c2)：5g/L；(d1)～(d2)：6g/LFig.7 Anti-bacterial effects of PDA/TCS coatings(a1)～(d1)：S.A.；(a2)～(d2)：E.coli；(a1)～(a2)：3g/L；(b1)～(b2)：4g/L；(c1)～(c2)：5g/L；(d1)～(d2)：6g/L

4 結(jié) 論

本研究基于采用PDA 作為TCS的載藥涂層來覆蓋在醫(yī)用縫合線上，并對(duì)其進(jìn)行SEM、XPS、體外釋放和抗菌實(shí)驗(yàn)等一系列測試，研究結(jié)果如下：

1.通過多巴胺的自聚合反應(yīng)可在醫(yī)用縫合線表面有效固載TCS形成PDA-TCS復(fù)合薄膜。

2.涂層中TCS的含量可以通過TCS 濃度調(diào)節(jié)，但隨著TCS濃度的增加其含量逐漸飽和。

3.涂層對(duì)大腸桿菌和金黃葡萄球菌具有殺滅性能，且浸泡2d后，仍有約25%的TCS 剩余。這顯示涂層能夠滿足縫合線初期抗菌的需要。