李金，陳蓮芙，金恩惠，李博，屠幼英

（浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院茶學(xué)系，杭州310058）

黃酮類化合物是茶葉中除兒茶素外最重要的一類化合物，主要以黃酮苷的形式存在于茶樹(shù)的各個(gè)器官中。由于黃酮苷具有多種生物學(xué)活性[1-2]，且對(duì)茶葉湯色和滋味具有一定的貢獻(xiàn)[3-5]，所以一直受到學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。20世紀(jì)50年代，人們通過(guò)雙向薄層層析色譜技術(shù)，首次在茶葉中檢測(cè)到了黃酮苷。隨著高效液相色譜-質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry, HPLC-MS）、超高效液相色譜-質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry, UHPLC-MS）及核磁共振波譜法（nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR）技術(shù)的成熟，茶葉中越來(lái)越多的黃酮類化合物被檢測(cè)出來(lái)。王智聰?shù)萚6]采用UHPLC-MS測(cè)定了紅茶與綠茶中15種不同的黃酮苷化合物。FANG 等[7]建立了UHPLC-DAD-MS/MS 方法，可以同時(shí)檢測(cè)出茶葉中21 種不同的黃酮苷化合物。與茶葉相比，對(duì)茶樹(shù)花中黃酮類化合物的研究則較少。YANG 等[8]的研究表明，在茶樹(shù)花的乙醇提取物中，8種兒茶素和5種黃酮苷對(duì)茶樹(shù)花抗氧化活性起到重要作用。

本文采用UHPLC-MS 方法對(duì)5 個(gè)不同茶樹(shù)品種的茶樹(shù)花黃酮苷進(jìn)行檢測(cè)，以楊梅素、槲皮素、山柰酚3 種黃酮醇作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行黃酮苷等量分析，并對(duì)不同品種茶樹(shù)花中的黃酮苷進(jìn)行比較，研究其在種類與含量上的差異性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料為梅占、水古、黃葉早、政和大白、福建水仙5個(gè)茶樹(shù)品種，采花時(shí)期為全開(kāi)期（種植于浙江大學(xué)茶學(xué)系實(shí)驗(yàn)基地）。將采摘的茶樹(shù)花置于60 ℃烘箱中烘4～6 h，備用。

1.2 儀器設(shè)備

Waters 超高效液相色譜儀（Waters Corp 公司，美國(guó)），AB Triple TOF 5600 plus LC/MS 系統(tǒng)（AB SCIEX 公司，美國(guó)），艾科浦高端超純水機(jī)（ACD0-0005-1，重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司），電子分析天平［AL104，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］，恒溫水浴鍋，冷凝管，Welch Ultimate XP C18 柱（100 mm×2.1 mm，直徑1.8 μm）。

1.3 樣品的制備

準(zhǔn)確稱取1 g（0.000 1 g）茶樹(shù)花樣品，以1∶54的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為78%的預(yù)熱乙醇，于75 ℃的水浴鍋中回流提取1.86 h，而后進(jìn)行抽濾，濾液冷卻后將其作為供試液，每個(gè)樣品均進(jìn)行3次重復(fù)。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

準(zhǔn)確稱取5 mg 的標(biāo)準(zhǔn)品，分別溶于5 mL 甲醇中，即得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品母液，分別取0.1 mL 的標(biāo)準(zhǔn)品母液于10 mL 的容量瓶中，并用甲醇定容，得到0.01 mg/mL 的黃酮混合標(biāo)準(zhǔn)品：楊梅素、槲皮素、山柰酚。

1.5 黃酮苷的UHPLC-MS 定性分析

液相條件：流動(dòng)相A（99.9%超純水，0.1%甲酸），流動(dòng)相B（99.9%乙腈，0.1%甲酸）。梯度洗脫條件：0～10 min，B 相10%～18%；10～15 min，B 相18%～20%；15～20 min，B 相20%～25%；20～30 min，B 相25%～50%；進(jìn)樣量為10 μL，流速為0.3 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm，柱溫為25 ℃。

質(zhì)譜條件：m/z掃描范圍為100～1 000；電離模式為正、負(fù)離子模式。正離子模式：離子源電壓+5.5 kV，離子源溫度600 ℃。負(fù)離子模式：離子源電壓－4.5 kV，離子源溫度550 ℃?？諝?和空氣2壓力為50 Pa，氮?dú)鈮毫?5 Pa。最大誤差：±5 mmol/L；碰撞能量范圍：20～40 V。

1.6 黃酮苷的UHPLC-MS 定量分析

楊梅素苷、槲皮素苷、山柰酚苷根據(jù)相應(yīng)的黃酮醇標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行等量分析。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 23.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮醇標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)

對(duì)3 種黃酮醇標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行UHPLC-MS 分析，所得色譜與質(zhì)譜信息如表1 所示。分析可知，1號(hào)峰代表?xiàng)蠲匪兀? 號(hào)峰代表槲皮素，3 號(hào)峰代表山柰酚。

我國(guó)林業(yè)資源豐富，但是由于人為的破壞，使得林業(yè)資源大規(guī)模的減少。人們?cè)诎l(fā)展的過(guò)程中只注重經(jīng)濟(jì)效益，忽視了破壞森林資源所帶來(lái)的生態(tài)后果。他們認(rèn)為保護(hù)森林資源的做法是無(wú)關(guān)緊要的，從而做出一些加劇我國(guó)森林資源減少的行為，就會(huì)造成水土流失、生態(tài)環(huán)境破壞的問(wèn)題，這樣對(duì)于我國(guó)的發(fā)展是非常不利的。會(huì)對(duì)我國(guó)的森林保護(hù)工作造成非常大的阻礙。

表1 黃酮醇標(biāo)準(zhǔn)品的色譜和質(zhì)譜信息Table 1 Chromatography data and mass spectrometry data of flavonol standards

2.2 茶樹(shù)花樣品中黃酮苷的UHPLC-MS 分析

以福建水仙品種的茶樹(shù)花樣品為例，采用UHPLC-MS進(jìn)行測(cè)定和分析，結(jié)合質(zhì)譜信息及參考相關(guān)文獻(xiàn)[8-13]，可推斷圖1中的峰1～12均為黃酮苷物質(zhì)，各相應(yīng)峰的保留時(shí)間、質(zhì)譜碎片信息及質(zhì)譜鑒定結(jié)果如表2所示。

圖1 茶樹(shù)花中黃酮苷的UHPLC色譜圖（λ=360 nm）Fig.1 UHPLC chromatogram of flavonoid glycosides of tea flowers(λ=360 nm)

如圖2所示，1號(hào)化合物的分子離子峰[M-H]－為m/z=625，通過(guò)與茶樹(shù)花中已檢測(cè)出的黃酮苷化合物的相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行比對(duì)，初步推斷是楊梅素-3-O-蕓香糖苷，當(dāng)它失去1分子蕓香糖基（－m/z=308）后，可形成m/z=316的楊梅素苷元，因此可以推斷化合物1是楊梅素-3-O-蕓香糖苷。該黃酮苷已在茶葉中被檢測(cè)出來(lái)[9]，但在茶樹(shù)花中卻少有報(bào)道。

表2 茶樹(shù)花中黃酮苷類物質(zhì)的質(zhì)譜信息Table 2 Mass spectrometry data of flavonoid glycosides of tea flowers

圖2 各峰化合物的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectra from peak 1 to 12

2和3號(hào)化合物的分子離子峰[M-H]－一致，均為m/z=479，初步推斷為楊梅素-3-O-半乳糖苷、楊梅素-3-O-葡萄糖苷，當(dāng)它們分別失去1分子半乳糖基（－m/z=162）和1 分子葡萄糖基（－m/z=162）時(shí)，可以形成m/z=316 的楊梅素苷元。已有研究證明，半乳糖苷類化合物的出峰時(shí)間相對(duì)于葡萄糖苷類化合物早[10-12]，因此可以推斷化合物2是楊梅素-3-O-半乳糖苷、化合物3是楊梅素-3-O-葡萄糖苷。

4和5號(hào)化合物的分子離子峰[M-H]－均為m/z=771。碎片離子m/z=609 為丟失了1 分子半乳糖基或葡萄糖基的槲皮素-3-O-蕓香糖苷片段；碎片離子m/z=463 為丟失了1 分子半乳糖基或葡萄糖基和1分子鼠李糖基（－m/z=146）的槲皮素-3-O-葡萄糖苷片段；當(dāng)它們失去所有的糖基時(shí)，可形成－m/z=301的槲皮素苷元。因此，推斷化合物4是槲皮素-3-O-蕓香糖半乳糖苷，化合物5 是槲皮素-3-O-蕓香糖葡萄糖苷。

6和9號(hào)化合物的分子離子峰[M-H]－均為m/z=755，碎片離子m/z=285 為丟失了1 分子半乳糖基或葡萄糖基和1分子蕓香糖基的山柰酚苷元，推斷峰6是山柰酚-3-O-蕓香糖半乳糖苷，峰9是山柰酚-3-O-蕓香糖葡萄糖苷。這2 種山柰酚苷已在茶樹(shù)干花中被檢測(cè)出，而且含量較高[13]。

7和8號(hào)化合物的分子離子峰[M-H]－均為m/z=463，碎片離子m/z=301 分別為丟失1 分子半乳糖基和1 分子葡萄糖基時(shí)的槲皮素苷元，推斷化合物7為槲皮素-3-O-半乳糖苷，化合物8 為槲皮素-3-O-葡萄糖苷。

11號(hào)化合物的分子離子峰[M-H]－為m/z=593，碎片離子m/z=285 為丟失1 分子蕓香糖基的山柰酚苷元，推斷化合物11 為山柰酚-3-O-蕓香糖苷，目前已有相關(guān)研究證實(shí)該物質(zhì)存在于茶樹(shù)干花中[8]。

10和12號(hào)化合物的分子離子峰[M-H]－為m/z=447，丟失1 分子半乳糖基和1 分子葡萄糖基時(shí)，可以形成m/z=285 的山柰酚苷元，推斷化合物10 為山柰酚-3-O-半乳糖苷，化合物12 為山柰酚-3-O-葡萄糖苷。

表3 不同品種的茶樹(shù)花黃酮苷含量Table 3 Content of flavonoid glycosides of tea flower in different tea plant cultivars mg/g

2.3 不同品種茶樹(shù)花中黃酮苷組分和含量

從表3 可見(jiàn)，不同品種茶樹(shù)花中的黃酮苷組分和含量存在較大差異。其中，福建水仙茶樹(shù)花中楊梅素-3-O-葡萄糖苷的含量在5 個(gè)品種中最高，為0.436 mg/g。黃葉早茶樹(shù)花中山柰酚-3-O-蕓香糖半乳糖苷的含量顯著高于其他幾個(gè)品種，達(dá)到0.962 mg/g。梅占品種中山柰酚-3-O-蕓香糖葡萄糖苷的含量最高，為1.208 mg/g，顯著高于另外4 個(gè)品種。政和大白、黃葉早和水古茶樹(shù)花中槲皮素-3-O-蕓香糖半乳糖苷的含量顯著高于其他2 個(gè)品種。在5 個(gè)茶樹(shù)花品種中，福建水仙茶樹(shù)花中槲皮素-3-O-蕓香糖葡萄糖苷的含量最高，且顯著高于政和大白、梅占和黃葉早?？v觀各黃酮苷組分在不同品種茶樹(shù)花中的分布情況，福建水仙品種中，除了楊梅素-3-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-蕓香糖葡萄糖苷的含量顯著高于其他品種，有8 種黃酮苷組分在所有品種中均低于平均水平。

如表4所示，不同品種茶樹(shù)花中的總楊梅素苷、總槲皮素苷、總山柰酚苷含量存在顯著差異。政和大白茶樹(shù)花中的總楊梅素苷含量顯著低于其他品種。福建水仙茶樹(shù)花中的總槲皮素苷含量最低，而黃葉早與水古茶樹(shù)花中的含量則明顯較高。政和大白、福建水仙和水古茶樹(shù)花中總山柰酚苷的含量顯著低于其他2 個(gè)品種，黃葉早中總山柰酚苷的含量最高，占到黃酮苷總量的一半以上。

由表5 可知，三糖基黃酮苷為茶樹(shù)花中最主要的黃酮苷，占其黃酮苷總量的一半以上，而二糖基黃酮苷在茶樹(shù)花中的含量最低。楊梅素苷主要以單糖基黃酮苷和二糖基黃酮苷的形式存在，如楊梅素-3-O-半乳糖苷和楊梅素-3-O-蕓香糖苷；槲皮素苷主要以單糖基黃酮苷和三糖基黃酮苷的形式存在，如槲皮素-3-O-半乳糖苷和槲皮素-3-O-蕓香糖半乳糖苷；而山柰酚苷的糖基化形式最為豐富，既有單糖基黃酮苷如山柰酚-3-O-半乳糖苷，也有二糖基黃酮苷和三糖基黃酮苷，如山柰酚-3-O-蕓香糖苷和山柰酚-3-O-蕓香糖葡萄糖苷。在5個(gè)不同品種的茶樹(shù)花中，黃葉早中的單糖基黃酮苷顯著高于其他品種，梅占和水古品種次之；二糖基黃酮苷在黃葉早茶樹(shù)花中的含量最高，其次是在水古茶樹(shù)花中，在政和大白茶樹(shù)花中的含量最低，且黃葉早茶樹(shù)花中的三糖基黃酮苷含量也顯著高于其他茶樹(shù)花品種。

表4 不同品種茶樹(shù)花中不同苷元的黃酮苷含量Table 4 Content of flavonoid glycosides with different aglycones in tea flower of different tea plant cultivars mg/g

3 討論

通過(guò)比較不同品種茶樹(shù)花中的黃酮苷組分含量，發(fā)現(xiàn)在三糖基山柰酚苷中，5個(gè)品種的山柰酚-3-O-蕓香糖葡萄糖苷的含量最高，其次是山柰酚-3-O-蕓香糖半乳糖苷。而山柰酚-3-O-葡萄糖苷在5個(gè)品種中的含量都很低；梅占茶樹(shù)花中楊梅素-3-O-半乳糖苷含量是福建水仙茶樹(shù)花中的5 倍，而楊梅素-3-O-葡萄糖苷卻只有福建水仙茶樹(shù)花中的1/5。

此前，吳春燕等[9]用HPLC-MS測(cè)定了上述5個(gè)品種茶樹(shù)葉片中黃酮苷的組分含量，發(fā)現(xiàn)茶葉中含量最高的為槲皮素苷，而本文結(jié)果表明，在茶樹(shù)花中不同苷元黃酮苷含量最高的為山柰酚苷，槲皮素苷、楊梅素苷次之。而茶樹(shù)花和葉片中的黃酮苷糖基化程度也有所不同，茶樹(shù)花中黃酮苷的存在形式主要是三糖基黃酮苷，其含量占總黃酮苷含量的一半以上；而茶葉中其主要存在形式為單糖基黃酮苷與二糖基黃酮苷。茶樹(shù)花中的總山柰酚苷和三糖基山柰酚的含量普遍高于它們?cè)诓枞~中的含量。相關(guān)研究表明，山柰酚苷具有重要的生物學(xué)活性，包括較強(qiáng)的氧化性，能抑制人白血病細(xì)胞活性，保護(hù)腦部組織細(xì)胞，緩解應(yīng)激反應(yīng)等[9,14-16]。

此外，茶樹(shù)花中含量較高的黃酮苷為槲皮素-3-O-蕓香糖半乳糖苷、槲皮素-3-O-蕓香糖葡萄糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖半乳糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖葡萄糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷，其中山柰酚-3-O-蕓香糖半乳糖苷在5 個(gè)茶樹(shù)品種的茶葉里均未能檢測(cè)到，而它在黃葉早茶樹(shù)花中的含量接近1.000 mg/g；另外，福建水仙茶樹(shù)花中山柰酚-3-O-蕓香糖葡萄糖苷的含量是茶葉中的2 倍，槲皮素-3-O-蕓香糖半乳糖苷和槲皮素-3-O-蕓香糖葡萄糖苷在水古和福建水仙茶樹(shù)花中的含量也高于茶葉中的含量，槲皮素-3-O-蕓香糖半乳糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷在黃葉早茶樹(shù)花中的含量高于葉片。綜上表明，在不同的茶樹(shù)品種中，各黃酮苷組分在其花與葉中的分布具有一定的品種差異性。

4 結(jié)論

在政和大白、福建水仙、梅占、黃葉早、水古茶樹(shù)花中，檢測(cè)出了12 種不同的黃酮苷，分別為楊梅素-3-O-蕓香糖苷、楊梅素-3-O-半乳糖苷、楊梅素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-蕓香糖半乳糖苷、槲皮素-3-O-蕓香糖葡萄糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖半乳糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖葡萄糖苷、山柰酚-3-O-半乳糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷。

通過(guò)對(duì)不同品種茶樹(shù)花中各黃酮苷組分的含量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)黃酮苷組分的分布呈現(xiàn)明顯的品種特異性：福建水仙茶樹(shù)花中楊梅素-3-O-葡萄糖苷的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他品種；黃葉早中山柰酚-3-O-蕓香糖半乳糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷、山柰酚-3-O-半乳糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷的含量顯著高于其他幾個(gè)品種；山柰酚-3-O-蕓香糖葡萄糖苷含量在所有品種的茶樹(shù)花中均為最高，在梅占中更是高達(dá)1.208 mg/g。盡管不同品種茶樹(shù)花的黃酮苷含量具有一定的差異性，但不同苷元的黃酮苷含量均表現(xiàn)為楊梅素苷＜槲皮素苷＜山柰酚苷，并且以三糖基黃酮苷為主。