曾一冰，蔣立強(qiáng)，李國(guó)華，劉蕊，李紅葉*

（1.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)研究所，杭州310058；2.廣東省梅州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，廣東 梅州514071）

柑橘屬于蕓香科柑橘屬（Citrus），是世界性重要水果之一，主要種植在熱帶和亞熱帶地區(qū)。中國(guó)是世界上第一大柑橘生產(chǎn)國(guó)，2016 年產(chǎn)量達(dá)3 764萬(wàn)t。在中國(guó)種植的柑橘主要包括寬皮柑橘、橙、柚、檸檬和各類雜柑（2016 年中國(guó)農(nóng)業(yè)統(tǒng)計(jì)資料）。柑橘黑斑?。╟itrus black spot, CBS）也稱黑星病，其病原為柑橘葉點(diǎn)霉菌[Phyllosticta citricarpa(McAlpine) van der Aa][1]，主要分布在非洲、澳大利亞[2]、東南亞、南美洲[3-5]和美國(guó)佛羅里達(dá)等地區(qū)。在我國(guó)，廣東[6]、浙江[7]、江西[8]、福建[9]、云南、四川、重慶[10]等地區(qū)的果園內(nèi)均有柑橘黑斑病發(fā)生的報(bào)道，并造成不同程度的危害。柑橘黑斑病病菌主要為害柑橘的果實(shí)[11]，在柑橘果實(shí)上產(chǎn)生黑星型、毒性型和黑斑型病斑[12]，導(dǎo)致其商品價(jià)值降低，嚴(yán)重時(shí)可引起果實(shí)脫落、減產(chǎn)。目前，歐盟與美國(guó)[3-4,13]將柑橘葉點(diǎn)霉菌列入禁止入境的有害生物名單，致使我國(guó)出口的柑橘多次由于檢測(cè)出柑橘黑斑病菌而遭到進(jìn)口國(guó)退貨，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。隨著我國(guó)柑橘種植規(guī)模的不斷擴(kuò)大，加強(qiáng)柑橘黑斑病的防治和促進(jìn)出口已成為提升我國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)效益的途徑之一。

柚黑斑?。╬ummelo black spot,PBS），也稱柚棕褐斑病（pummelo tan spot），主要發(fā)生在柚（C.maxima）類柑橘上，其病原為亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌（Phyllosticta citriasianaWulandari, Crous Gruyter）[14]，在廣東、福建和廣西等重要柚產(chǎn)區(qū)均有不同程度的發(fā)生。由于柚黑斑病病原與柑橘黑斑病病原（P. citricarpa）的形態(tài)相似性很高，加上相關(guān)研究的缺乏，過(guò)去一直被認(rèn)為是由與柑橘黑斑病同一個(gè)病原種所引起的[6,15]，直至2009年WULANDARI等[14]才將其區(qū)分開來(lái)。此后，WANG等[16]證實(shí)P.citriasiana僅能從柚類柑橘品種中分離到，由此歐盟解除了對(duì)我國(guó)進(jìn)口柚果的檢疫。柚黑斑病可導(dǎo)致田間落果而影響產(chǎn)量，成熟果實(shí)因果面病斑而難以鮮銷，因此亟待提出合理有效的化學(xué)防治方法來(lái)控制柚黑斑病的發(fā)生。

苯并咪唑類殺菌劑最早在20世紀(jì)60年代末到70年代初面世，并逐步投入到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用，主要品種包括1968 年面世的苯菌靈（benomyl）、1971 年面世的硫菌靈（thiophanate）和甲基硫菌靈（thiophanate-methyl）、1973 年面世的多菌靈（carbendazim）等[17]。苯并咪唑類殺菌劑是一種含有苯并咪唑分子結(jié)構(gòu)的高效低毒、廣譜內(nèi)吸性殺菌劑，該類殺菌劑基本上能防治除卵菌引起的其他所有真菌性病害，在許多國(guó)家和地區(qū)的大田作物、果樹、蔬菜等眾多作物上登記使用[18-19]。苯并咪唑類殺菌劑的作用機(jī)制是藥劑特異性地與病原真菌的β-微管蛋白（β-tubulin）結(jié)合，干擾微管裝配，抑制細(xì)胞有絲分裂[20-21]。許多研究表明，苯并咪唑類殺菌劑抗性的產(chǎn)生與β-微管蛋白基因的6、198、200等位置上的氨基酸點(diǎn)突變有關(guān)，其中尤以198位和200位氨基酸點(diǎn)突變最為常見。通常，敏感菌株的β-微管蛋白基因198位氨基酸為谷氨酸（Glu），而抗性菌株則為丙氨酸（Ala）或纈氨酸（Val）或甘氨酸（Gly），該位點(diǎn)的點(diǎn)突變往往使得病原菌表現(xiàn)出高度抗性；敏感菌株β-微管蛋白基因200位氨基酸通常為苯丙氨酸（Phe），而抗性菌株則為酪氨酸（Tyr），該位點(diǎn)的點(diǎn)突變通常使得病原菌表現(xiàn)出中度抗性[22-23]。

在國(guó)外，苯并咪唑類殺菌劑被廣泛登記用于柑橘黑斑病的防治[23]，而在我國(guó)尚未有殺菌劑登記用于柑橘或柚黑斑病的防治（http://www.icama.org.cn），但據(jù)筆者調(diào)研和查閱文獻(xiàn)了解到苯并咪唑類殺菌劑——多菌靈和甲基硫菌靈早已普遍應(yīng)用在柑橘真菌病害的防治上[24]。此外，我國(guó)的柑橘黑斑病種群與柚黑斑病種群的遺傳多樣性高[25]，自然界可能存在少量抗性菌株，這些抗性菌株在受到殺菌劑使用的選擇壓后群體將得以擴(kuò)大，從而影響這類藥劑的防治效果。POSSIEDE 等[23]發(fā)現(xiàn)，在連續(xù)10 年使用高劑量的苯并咪唑類殺菌劑的情況下，南非的柑橘黑斑病菌種群出現(xiàn)了抗性菌系，這些菌株能在含100μg/mL苯并咪唑類殺菌劑培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。因此，了解我國(guó)柑橘黑斑病菌與柚黑斑病菌種群對(duì)這類殺菌劑的抗性現(xiàn)狀，可為我國(guó)是否繼續(xù)使用該類藥劑作為防控柑橘黑斑病與柚黑斑病提供依據(jù)；同時(shí)，掌握柑橘黑斑病菌種群與柚黑斑病菌種群對(duì)上述藥劑的抗性機(jī)制，可為建立抗性菌株的快速分子檢測(cè)方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及藥劑

2009—2017 年從浙江、江西、四川和重慶隨機(jī)采集具有柑橘黑斑病典型癥狀的病葉與病果，參照CHOI 等[26]的方法分離培養(yǎng)并單孢純化，分別獲得23、114、32 和3 株菌株。2009—2017 年從廣西宜州市、廣東梅州市與福建漳州市平和縣采集帶有柚黑斑病菌典型癥狀的病葉與病果，并分離培養(yǎng)，單孢純化，最后分別獲得34、54和34株純培養(yǎng)菌株。為保證菌株的獨(dú)立性，從單果、單葉上分離的菌株只保留1 株，所有菌株于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar,PDA）斜面培養(yǎng)基上4 ℃保存，備用。

98%多菌靈（carbendazim）原藥（上海生農(nóng)生化制品有限公司）；98%嘧菌酯（azoxystrobin）原藥（江蘇如東眾意化工有限公司）；70%甲基硫菌靈（thiophanate-methyl）可濕性粉劑[允發(fā)化工（上海）有限公司]；99%水楊肟酸（salicyl hydroximic acid,SHAM）（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）。

培養(yǎng)基為常規(guī)的PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL。

1.2 柑橘黑斑病菌與柚黑斑病菌抗性測(cè)定方法

1.2.1 對(duì)多菌靈的抗性測(cè)定

參考馮丹等[24]的最低抑制質(zhì)量濃度（minimum inhibitory concentration, MIC）方法，以不能在1.0 μg/mL 多菌靈的PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的柑橘黑斑病菌與柚黑斑病菌菌株定義為敏感菌株（carbendazimsensitive,Cab-S），以能在10.0 μg/mL多菌靈的PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的柑橘黑斑病菌與柚黑斑病菌菌株定義為抗性菌株（carbendazim-resistant, Cab-R）。根據(jù)所得的Cab-R菌株與所測(cè)總菌株數(shù)的比值，計(jì)算得出Cab-R菌株的百分率，即抗性頻率。根據(jù)篩選得到的抗多菌靈的柑橘黑斑病菌株數(shù)與柚黑斑病菌株數(shù)，挑選相應(yīng)數(shù)量的敏感菌株數(shù)，測(cè)定以上所有挑選的菌株的有效中濃度（median effective concentration, EC50）值。抗性系數(shù)用抗性菌株EC50均值與敏感菌株EC50均值的比值來(lái)表示?？剐韵禂?shù)小于5，認(rèn)為沒(méi)有抗性，為敏感型菌株（sensitive isolates,S）；抗性系數(shù)在5～20 之間，為低抗型菌株（low-resistant isolates, RL）；抗性系數(shù)在20～100 之間，為中抗型菌株（middle-resistant isolates, RM）；抗性系數(shù)大于100，為高抗型菌株（high-resistant isolates, RH）[27]。EC50值的測(cè)定采用菌絲生長(zhǎng)速率法[28]：取98%多菌靈原藥0.01 g 溶于990μL 無(wú)菌水和10μL 11.74 mol/L濃鹽酸中，制得0.01 g/mL多菌靈母液，再用無(wú)菌水稀釋成梯度濃度藥液，將其加入到50 ℃左右的150 mL PDA 培養(yǎng)基中，制成一系列不同濃度的含藥培養(yǎng)基。其中，測(cè)定敏感菌株EC50值所用的多菌靈質(zhì)量濃度梯度為0（對(duì)照組）、0.005、0.01、0.03、0.09、0.27 μg/mL；測(cè)定抗性菌株EC50值所用的多菌靈質(zhì)量濃度梯度為0（對(duì)照組）、50、100、200、300、400μg/mL和0（對(duì)照組）、1、2、4、8、15μg/mL。在含有硫酸鏈霉素（streptomycin sulfate）的PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)15 d 的柑橘黑斑病菌與柚黑斑病菌菌落的邊緣打取直徑為5 mm 的菌碟，接種在含上述系列濃度多菌靈的PDA培養(yǎng)基的中央，在25 ℃條件下12 h/12 h光暗交替培養(yǎng)15 d，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。每處理重復(fù)3 次，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。

1.2.2 與甲基硫菌靈的交互抗性測(cè)定

由于甲基硫菌靈與多菌靈同為苯并咪唑類殺菌劑，因此以相同質(zhì)量濃度10.0 μg/mL 作為甲基硫菌靈的最低抑制質(zhì)量濃度，以能在含10.0 μg/mL 甲基硫菌靈的PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株視為抗性菌株。將篩選得到的相應(yīng)敏感菌株與抗性菌株移入含0.1、1.0 和10.0 μg/mL 甲基硫菌靈的PDA 培養(yǎng)基上，觀察其生長(zhǎng)情況，每個(gè)菌株重復(fù)3次。若Cab-R菌株在10.0 μg/mL 甲基硫菌靈PDA 培養(yǎng)基上能生長(zhǎng)，而Cab-S在10.0 μg/mL甲基硫菌靈PDA培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，則表明Cab-R與甲基硫菌靈存在交互抗性；反之亦然。

1.3 柑橘黑斑病菌與柚黑斑病菌抗性分子機(jī)制研究

1.3.1 基因組DNA 的提取

刮取在PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)15 d 的柑橘黑斑病菌與柚黑斑病菌菌絲體，放入2 mL 的離心管中，加入液氮研磨，用十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide,CTAB）法提取真菌的基因組DNA，于－20 ℃條件下保存，備用。

1.3.2 柑橘黑斑病菌與柚黑斑病菌的抗性機(jī)制研究

利用浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所李紅葉教授實(shí)驗(yàn)室已測(cè)序完成的柑橘黑斑病菌基因組與柚黑斑病菌基因組，將近似種柑橘綠霉病菌（Penicillium digitatum）的β-微管蛋白基因（PdRUB2，GenBank 登錄號(hào)：D78154）作為參考序列，進(jìn)行本地比對(duì)（local blast）后得到柚黑斑病菌的β-微管蛋白基因全長(zhǎng)。利用在線網(wǎng)站（http://www.ebi.ac.uk/interpro）對(duì)β-微管蛋白基因進(jìn)行注釋，找到第198 與200 位氨基酸的位置，取該位置上游400 bp和下游400 bp的基因序列，利用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）在線設(shè)計(jì)引物網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）設(shè)計(jì)涵蓋第198/200 位密碼子的引物PA-bT-F/R（表1）。鑒于柚黑斑病菌與柑橘黑斑病菌的β-微管蛋白基因的相似度極高，故柚黑斑病菌β-微管蛋白基因也采用同樣的引物進(jìn)行擴(kuò)增。引物在杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成，并根據(jù)說(shuō)明書稀釋至10μmol/L 后于－20 ℃條件下保存，備用。將引物存儲(chǔ)液稀釋10 倍后用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）擴(kuò)增。

表1 擴(kuò)增柑橘黑斑病菌β-tubulin基因部分序列的引物信息Table 1 Primer information for amplifying partial sequences of the β-tubulin gene in P.citricarpa

1.3.3β-微管蛋白基因測(cè)序

用PA-bt-F/R 引物，對(duì)篩選的抗性菌株和敏感菌株的β-微管蛋白基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；92 ℃變性45 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；最后，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)得到目的條帶后，送至杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)定的基因序列先用NCBI 在線翻譯網(wǎng)頁(yè)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）翻譯成氨基酸，再進(jìn)行比對(duì)分析，檢查抗性菌株是否發(fā)生了有意義的突變。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘黑斑病菌對(duì)多菌靈的抗性及其分子機(jī)制

2.1.1 對(duì)多菌靈的抗性

分別以1.0 與10.0 μg/mL 為多菌靈抗性篩選的最低抑制質(zhì)量濃度，測(cè)定了收集自浙江、江西、四川、重慶4 個(gè)地區(qū)共172 個(gè)柑橘黑斑病菌菌株對(duì)多菌靈殺菌劑的抗性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在江西114 個(gè)菌株中出現(xiàn)了2 個(gè)多菌靈抗性菌株，抗性頻率為1.75%；在四川32個(gè)菌株中出現(xiàn)了1個(gè)多菌靈抗性菌株，抗性頻率為3.13%；在浙江和重慶沒(méi)有出現(xiàn)抗性菌株（表2）。隨機(jī)挑選3 株敏感的柑橘黑斑病菌株WZMG-2、JXNFMJ-231、HYMJ-204，測(cè)定其EC50值分別為0.034、0.039、0.055 μg/mL，均值為0.043 μg/mL；抗性菌株SCNM-122、NFMJ-A-3、NFMJA-6A 的EC50值 分 別 為13.043、229.346 和16.304 μg/mL，均值為86.231 μg/mL。將每一個(gè)抗性菌株EC50值與敏感菌株EC50值的均值進(jìn)行比較，得到抗性菌株SCNM-122、NFMJ-A-3、NFMJ-A-6A 的抗性系數(shù)分別為303.3、5 333.6、379.2，均為高抗菌株。

表2 柑橘黑斑病菌種群對(duì)多菌靈抗性水平評(píng)價(jià)Table 2 Evaluation of carbendazim resistance of P.citricarpa

2.1.2 對(duì)多菌靈的抗性機(jī)制

用特異性引物PA-bT-F/R 擴(kuò)增3 個(gè)Cab-S（HYMJ-204、WZMG-2、JXNFMJ-231）和3 個(gè)Cab-R（SCNM-122、NFMJ-A-3、NFMJ-A-6A）柑橘黑斑病菌株β-微管蛋白基因的部分序列后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增的目標(biāo)條帶大小與預(yù)測(cè)的大小一致（圖1）。對(duì)3 個(gè)Cab-S 與3 個(gè)Cab-R 的擴(kuò)增條帶進(jìn)行測(cè)序，所得到的序列用NCBI 進(jìn)行序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，不同程度的抗性菌株發(fā)生了不同類型的點(diǎn)突變。其中，抗性系數(shù)較小的菌株SCNM-122、NFMJ-A-6A（分別為303.3和379.2）的β-微管蛋白基因的第200 位氨基酸發(fā)生了由苯丙氨酸（Phe）突變?yōu)槔野彼幔═yr）的點(diǎn)突變（圖2）。從核苷酸序列上看，這是由于第992 bp 位點(diǎn)的核苷酸由T 突變成了A（圖3）。另一種點(diǎn)突變發(fā)生在第198 氨基酸位點(diǎn)，由谷氨酸（Glu）突變?yōu)橘嚢彼幔↙ys），該類型抗性菌株表現(xiàn)出對(duì)多菌靈高度的抗性（抗性系數(shù)為5 333.6）（圖2）。從基因核苷酸序列上看，這是由于β-微管蛋白基因上第985位核苷酸位點(diǎn)由G突變成了A（圖3）。由此可見，β-微管蛋白基因第198位氨基酸位點(diǎn)和第200位氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變會(huì)導(dǎo)致菌株表現(xiàn)為對(duì)多菌靈殺菌劑的抗性，其中第198 位氨基酸位點(diǎn)突變導(dǎo)致菌株呈現(xiàn)對(duì)多菌靈更高的抗性，第200位氨基酸位點(diǎn)突變導(dǎo)致菌株對(duì)多菌靈的抗性較198位突變的要低。

圖1 柑橘和柚黑斑病菌部分β-微管蛋白基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification result of the partial sequences of the βtubulin genes in P.citricarpa and P.citriasiana

圖2 柑橘黑斑病菌β-微管蛋白基因部分氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Alignment of partial amino acid sequences of the βtubulin gene in P.citricarpa

圖3 柑橘黑斑病菌β-微管蛋白基因部分核苷酸序列比對(duì)Fig.3 Alignment of partial nucleotide sequences of the βtubulin gene in P.citricarpa

2.2 柚黑斑病菌對(duì)多菌靈的抗性及其分子機(jī)制

2.2.1 對(duì)多菌靈的抗性

分別以1.0 與10.0 μg/mL 為多菌靈抗性篩選的最低抑制質(zhì)量濃度，測(cè)定了收集自廣西、廣東、福建3個(gè)地區(qū)的122個(gè)柚黑斑病菌菌株對(duì)多菌靈殺菌劑的敏感性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：只有在廣東柚黑斑病菌群體中出現(xiàn)了1 個(gè)抗性菌株，抗性頻率為1.85%；在廣西和福建收集的菌株中均未發(fā)現(xiàn)多菌靈抗性菌株（表3）。隨機(jī)挑選1株敏感的柚黑斑病菌株GXMY-29，測(cè)定其EC50值為0.032 μg/mL；抗性菌株GDMZ-STY-1的EC50值為439.025 μg/mL。將抗性菌株EC50值與敏感菌株EC50值的均值進(jìn)行比較，得到抗性菌株GDMZ-STY-1 的抗性水平為13 719.5，說(shuō)明該抗性菌株為高抗菌株。

表3 柚黑斑病菌種群對(duì)多菌靈抗性水平評(píng)價(jià)Table 3 Evaluation of carbendazim resistance of P.citriasiana

2.2.2 對(duì)多菌靈的抗性機(jī)制

用特異性引物PA-bT-F/R 擴(kuò)增1 個(gè)Cab-S（GXMY-29）、1個(gè)Cab-R（GDMZ-STY-1）柚黑斑病菌株部分β-微管蛋白基因后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增條帶與目標(biāo)條帶大小一致（圖1）。對(duì)這2個(gè)菌株測(cè)序后在NCBI中進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第198 位氨基酸位點(diǎn)發(fā)生了點(diǎn)突變，由敏感菌株的谷氨酸（Glu）突變?yōu)楸彼幔ˋla）（圖4）。從基因序列上看，這是由于第986 位核苷酸位點(diǎn)由敏感菌株的A 變成了抗性菌株的C（圖5）。抗性菌株其他位點(diǎn)也發(fā)生了點(diǎn)突變，但是都為同義突變，不改變氨基酸的種類。由此可見，β-微管蛋白基因第198 位氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變使得菌株表現(xiàn)為對(duì)多菌靈的高度抗性。

圖4 柚黑斑病菌β-微管蛋白基因部分氨基酸序列比對(duì)Fig.4 Alignment of partial amino acid sequences of the βtubulin gene in P.citriasiana

圖5 柚黑斑病菌β-微管蛋白基因部分核苷酸序列比對(duì)Fig.5 Alignment of partial nucleotide sequences of the βtubulin gene in P.citriasiana

2.3 交互抗性

在質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL 的甲基硫菌靈培養(yǎng)基 上，4 個(gè)Cab-R 菌 株SCNM-122、NFMJ-A-3、NFMJ-A-6A、GDMZ-STY-1均能夠正常生長(zhǎng)，4個(gè)Cab-S 菌株WZMG-2、JXNFMJ-231、HYMJ-204、GXMY-29 均不能生長(zhǎng)。因此，認(rèn)為甲基硫菌靈與多菌靈存在正交互抗性。在質(zhì)量濃度為10.0μg/mL的嘧菌酯培養(yǎng)基上，4 株多菌靈抗性菌株（Cab-R）和4 株敏感菌株（Cab-S）都能夠生長(zhǎng)。因此，認(rèn)為嘧菌酯與多菌靈無(wú)交互抗性。

3 討論

早在20 世紀(jì)90 年代中期，苯并咪唑類殺菌劑已引入中國(guó)柑橘產(chǎn)區(qū)使用[24]，加上苯并咪唑類殺菌劑的作用位點(diǎn)單一，預(yù)期產(chǎn)生的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)比較高。浙江省衢州市的柑橘主產(chǎn)區(qū)中出現(xiàn)了比例較高的抗苯并咪唑類的柑橘綠霉病菌株[24]。除此之外，由于苯并咪唑類殺菌劑具有廣譜的殺菌活性，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得以廣泛應(yīng)用，使得農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中形成了較高的選擇壓力。

從本研究結(jié)果來(lái)看，在浙江、江西、四川、重慶4個(gè)地區(qū)取樣的172個(gè)柑橘黑斑病菌株中，僅在江西菌株中出現(xiàn)了2 個(gè)多菌靈抗性菌株，抗性頻率為1.75%；在四川32個(gè)菌株中出現(xiàn)了1個(gè)多菌靈抗性菌株，抗性頻率為3.13%；浙江和重慶甚至沒(méi)有出現(xiàn)抗性菌株。說(shuō)明這4個(gè)地區(qū)絕大部分柑橘黑斑病菌株對(duì)多菌靈表現(xiàn)敏感。收集自廣西、廣東、福建地區(qū)的122 個(gè)柚黑斑病菌株中，只有在廣東省54 個(gè)菌株中出現(xiàn)了1 個(gè)抗性菌株，抗性頻率為1.85%，在廣西和福建兩省收集的菌株中均未發(fā)現(xiàn)多菌靈抗性菌株?？梢?，絕大部分柚黑斑病菌株對(duì)多菌靈表現(xiàn)敏感。因此，從總體上看，抗性菌株的比例較低。劉波等[29]報(bào)道，大棚蔬菜與草莓灰霉病菌（Botrytis cinerea）對(duì)多菌靈的抗性頻率高達(dá)67%，且多為高抗。柑橘和柚黑斑病菌同屬子囊菌門（Ascomycota），盤菌亞門（Pezizomycotina），座囊菌綱（Dothideomycetes），葡萄座腔菌目（Botryosphaeriales），葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae），葉點(diǎn)霉屬（Phyllosticta），其無(wú)性孢子（分生孢子）是從分生孢子器中產(chǎn)生，相對(duì)于灰葡萄孢菌，其周期長(zhǎng)，繁殖量低。此外，柑橘果園的年用藥次數(shù)也較葡萄、草莓和蔬菜地少，相應(yīng)的選擇壓也小，菌株抗性頻率低可能與這些因素相關(guān)。

KOENRAADT[30]在研究蘋果黑星菌（Venturia inaequalis）對(duì)苯并咪唑類殺菌劑的抗性分子機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，β-微管蛋白基因第198 位氨基酸位點(diǎn)由谷氨酸突變?yōu)楸彼峄虻?00位氨基酸位點(diǎn)由苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼幔鶗?huì)使野生菌株獲得對(duì)苯并咪唑類殺菌劑的抗性。李紅霞等[31]在研究油菜菌核病菌對(duì)多菌靈的抗性分子機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，野生菌株獲得對(duì)苯并咪唑類殺菌劑抗性的主要原因是β-微管蛋白基因第198 位氨基酸位點(diǎn)由谷氨酸突變成了丙氨酸。本研究結(jié)果表明：柑橘或柚黑斑病菌β-微管蛋白基因第198位氨基酸位點(diǎn)由谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼峄虮彼崾沟靡吧戢@得了對(duì)苯并咪唑類殺菌劑的高度抗性；第200 位氨基酸由苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼嵋彩沟靡吧戢@得了較高程度的抗性，但抗性水平較198位突變要低。這一結(jié)果與在其他植物病原真菌中的表現(xiàn)[21-22,30-31]一致。

本研究表明，抗多菌靈的柑橘和柚黑斑病菌抗性頻率很低，基于該結(jié)果，認(rèn)為在浙江、江西、四川、重慶的柑橘產(chǎn)區(qū)和廣西、廣東、福建的柚產(chǎn)區(qū)可以繼續(xù)使用多菌靈來(lái)防治黑斑病。但值得重視的是，已發(fā)現(xiàn)的抗性菌株均屬于高抗，連續(xù)使用苯并咪唑類殺菌劑無(wú)疑會(huì)有利抗性菌系的種群比例逐漸上升，從而導(dǎo)致苯并咪唑類殺菌劑的防治效果下降，甚至失效。此外，已知中國(guó)柚黑斑病種群與柑橘黑斑病種群的遺傳多樣性很高，變異潛力大[25]，推測(cè)極易產(chǎn)生克服殺菌劑抗性的突變。為了更好地控制柑橘黑斑病與柚黑斑病，延長(zhǎng)苯并咪唑類殺菌劑在柑橘黑斑病防治上的使用期限，建議在選擇柑橘黑斑病防治藥劑時(shí)注意苯并咪唑類殺菌劑與其他作用機(jī)制的殺菌劑，如甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑交替使用。