龐桂芝，臧文正，陳 青，張趁利，婁白敏

(1.新鄉(xiāng)市中心血站血型參比室，河南 新鄉(xiāng) 453000；2.信陽師范學院生命科學學院，河南 信陽 464000；3.江蘇省血液中心血型研究室，江蘇 南京 210042)

Rh血型系統(tǒng)是人類紅細胞血型中最復雜的血型系統(tǒng)[1]，主要包括D、E、c、C、e 5種抗原，其中D抗原的免疫原性最強，因其在紅細胞上質或量的變化，可導致弱D、部分D和DEL型等D變異型[2]。部分D主要是由于RHD基因和RHCE基因發(fā)生重組交換，產生融合基因，編碼產生缺乏1個或多個抗原表位的D多肽[3]。由于血清學檢測方法的局限性，鑒別不同類型的弱D或部分D難度較大；而基因分型技術可彌補血清學技術方面的不足，是準確判定血型的重要手段。Rh血型系統(tǒng)抗體與相應抗原發(fā)生免疫反應，可引起遲發(fā)型溶血性輸血反應和新生兒溶血病等。因此，準確進行RhD血型鑒定對制定安全有效的臨床輸血策略和對育齡婦女采取恰當措施以預防新生兒溶血病意義重大。本文結合RhD變異型的血清學檢測結果，通過分子生物學試驗綜合判定RhD變異型的特征。

1 資料與方法

1.1研究對象選擇新鄉(xiāng)市中心血站2018年1～2月300例無償獻血者中進行Rh血型鑒定時初篩RhD陰性，需要進一步進行RhD陰性確認者血樣為研究對象。

1.2主要試劑與儀器抗球蛋白試劑(批號：20165002)、免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)G單克隆抗-D(批號：20170227)、譜細胞(批號：20170720)購自上海血液生物醫(yī)藥公司，抗-D(IgM+IgG)(批號：V171981)購自珠海貝索生物技術有限公司，抗-D(IgM+IgG)(批號：517060)購自南京欣迪生物藥業(yè)工程有限責任公司，抗-D(IgM+IgG)(批號：517091)購自加拿大Dominion Biologicals Limited公司，Rh血型分型卡(批號：20170605)、不規(guī)則抗體篩檢卡(批號：20170605)、抗體篩檢細胞(批號：20170802)購自長春博迅生物醫(yī)藥公司，基因組提取試劑盒購自北京原平皓公司，脫氧核糖核苷三磷酸、Taq DNA酶、MgCl2、5×聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR) Buffer、GoldView核酸染色劑購自北京艾德萊生物科技有限公司，瓊脂糖購自美國Promega公司，特異性引物及內參引物參照文獻[4]設計，由上海生工生物工程股份有限公司合成；KA-2200離心機購自日本久保田株式會社，血清學專用離心機、免疫微柱孵育器購自長春博迅生物技術有限責任公司，PCR擴增儀購自美國Applied Biosystem公司，NanoDrop-2000DNA濃度測定儀購自美國Thermo公司，電泳儀購自美國BIO-RAD公司，熒光可見光凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Alpha Innotech公司。

1.3血清學檢測采用全自動微量板法初篩300例RhD血型，對于RhD初篩陰性、弱陽性的標本，再通過多個不同廠家(或不同批號)的抗-D試劑進行確認試驗；對于不規(guī)則抗體篩查陽性樣本，抗體特異性鑒定采用譜細胞進行檢測。

1.4分子生物學檢測從全血中提取DNA，通過聚合酶鏈反應序列特異引物(polymerase chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP)擴增RHD基因。通過凝膠電泳成像系統(tǒng)觀察PCR產物，并對實驗結果進行分析。實驗中均設立陰性、陽性及空白對照。(1)多重PCR擴增RHD基因外顯子7和內含子4：PCR反應總體積10 μL，含模板DNA 1 μL、內參引物0.1 μmol·L-1，dNTPs 0.25 mmol·L-1，特異性引物0.15 μmol·L-1，TaqDNA酶0.4 U，MgCl21.5 mmol·L-1，5×PCR Buffer 2 μL；PCR擴增條件為94 ℃預變性2 min，94 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，共10個循環(huán)；94 ℃ 30 s，61 ℃ 60 s，72 ℃ 30 s，共22個循環(huán)。(2)PCR-SSP擴增RHD基因啟動子和外顯子3、4、5、6、9、10：PCR反應總體積10 μL，含模板DNA 1 μL、內參引物0.15 μmol·L-1、dNTPs 0.25 mmol·L-1，特異性引物0.2 μmol·L-1，MgCl21.5 mmol·L-1、Taq DNA酶0.4 U，5×PCR Buffer 2 μL；擴增條件為94 ℃預變性2 min，94 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，共10個循環(huán)；94 ℃ 30 s，61 ℃ 60 s，72 ℃ 30 s，共22個循環(huán)。

2 結果

2.1血型血清學試驗結果結果見表1。Rh血型鑒定時初篩RhD陰性，需要進一步進行RhD陰性確認者血樣本與3種抗-D(IgM+IgG)間接抗人球蛋白試驗(indirect antiglobulin test，IAT)中反應均為弱陽性，鹽水介質中與其中2種呈陰性反應，1種弱凝集。RhCE表型為ccee。不規(guī)則抗體篩選試驗和直接抗人球蛋白試驗均為陰性，紅細胞表面和血清中均未發(fā)現(xiàn)不規(guī)則抗體。

表1獻血者紅細胞與3種抗-D(IgM+IgG)的反應結果

Tab.1Reactionofredbloodcellsfromblooddonorstothreeanti-D(IgM+IgG)

試劑1抗-D(IgM+IgG)鹽水IAT試劑2抗-D(IgM+IgG)鹽水IAT試劑3抗-D(IgM+IgG)鹽水IAT獻血者0+±+0+

2.2RhD陰性無償獻血者的RHD基因表達情況PCR-SSP檢測結果顯示，RHD基因缺失內含子4(226 bp)，表達外顯子7(123 bp)(圖1)；RHD基因表達啟動子(255 bp)和外顯子10(232 bp)(圖2)，但外顯子3～6表達缺失，表達外顯子9(104 bp)(圖3)。即該RhD變異型個體的基因分型結果為D3～D6外顯子缺失，表現(xiàn)為RHD-CE(3-6)-D，即D Ⅵc型。

1、2、4：陽性對照；3：外顯子7擴增產物；434 bp為內參照的擴增產物。

圖1PCR-SSP檢測RHD基因內含子4和外顯子7的電泳圖

Fig.1Electrophoresisofintron4andexon7ofRHDgenedetectedbymultiplexPCR-SSP

1：RHD基因啟動子(255 bp)；2：外顯子10的擴增產物(232 bp)；434 bp 為內參照的擴增產物。

圖2PCR-SSP分別檢測RHD基因外顯子10和啟動子的電泳圖

Fig.2Electrophoresisofexon10andpromoterofRHDgenedetectedbyPCR-SSP

1：外顯子3的擴增產物；2：外顯子4的擴增產物；3：外顯子5的擴增產物；4：外顯子6的擴增產物；5：外顯子9的擴增產物；6：陽性對照的擴增產物。

圖3PCR-SSP檢測RHD基因外顯子3、4、5、6、9的電泳圖

Fig.3Electrophoresisofexon3，4，5，6，9ofRHDgenedetectedbyPCR-SSP

3 討論

人類Rh血型系統(tǒng)具有多態(tài)性，臨床重要性僅次于ABO血型系統(tǒng)[4]。目前，已發(fā)現(xiàn)的Rh血型抗原數目多達54個，與臨床最密切的抗原有5種，即D、E、C、c、e[5]。RH基因由位于1號染色體34.3～36.1短臂上的RHD基因和RHCE基因組成，分別編碼形成D抗原和Cc/Ee抗原。RHD和RHCE基因緊密連鎖，均有10個外顯子和9個內含子，長度分別為57 295 bp和57 831 bp，基因編碼蛋白均由417個氨基酸組成。RHD和RHCE基因結構相似，差異性較大的是外顯子3、4、5、7、9和內含子4。由于二者相距很近，方向相反，在遺傳過程中容易發(fā)生結構互換。若RhD全部丟失，RhD抗原不表達，為Rh陰性；若RhD部分被RHCE替換，容易形成融合基因，影響RhD抗原的表達。RhD抗原表型除了D陰性和D陽性外，還存在多種D變異型，如弱D、部分D、和DEL型[6]。部分D抗原表達不完全，主要是由于RHD/CE等位基因轉換、多點錯義突變和單點錯義突變[7]等影響D抗原的表達。部分D中的DⅥ分為4種類型，即DⅥa型：RHD-CE(4-5)-D；DⅥb型：RHD-CE(4-6)-D；DⅥc型：RHD-CE(3-6)-D；DⅥd型：RHD-CE(3-5)-D。DⅥ主要由于RHD/CE/D基因雜交形成，造成紅細胞表面D抗原表位減少，與大多數單克隆抗-D抗體弱反應或不反應[3]，影響Rh血型鑒定。中國漢族人群中，最常見的部分D變異型是DⅥ型，以DⅥc型最為常見[8-9]，源于RHD外顯子3～6被RHCE基因e等位基因取代，形成了DⅥCe單倍型[10]。

在臨床上，常常因為RHD/CE等位基因轉換，如單點錯義突變和多點錯義突變等，引起D抗原表達異常，干擾Rh血型的鑒定，給輸血安全帶來隱患。部分D患者若輸入RhD陽性的紅細胞，容易發(fā)生免疫反應產生不規(guī)則抗體，影響后續(xù)輸血治療。本研究中，受檢者為RhD變異型，RHD外顯子3～6和內含子4缺失，但其啟動子、外顯子7、9、10仍存在，說明該受檢者的RHD基因外顯子3～6被RHCE基因替換，其基因表現(xiàn)為RHD-CE(3-6)-D，即D Ⅵc型。該基因型影響了紅細胞膜表面D抗原的表達，與一種單克隆抗體試劑不反應或弱反應，必須通過多種單克隆抗體試劑或多克隆抗體試劑予以驗證，或者通過分子生物學試驗證實受檢者存在RHD基因。臨床上，在D變異型中，DEL型D抗原表達最弱，需要通過更敏感的吸收放散試驗才可檢測出來。所以，在臨床中應重視D變異型個體的血型檢測。對于RhD變異型的個體，若作為患者，應輸RhD陰性血液，以預防遲發(fā)型輸血反應的發(fā)生；若作為獻血者，應按RhD陽性對待，避免D陽性的紅細胞進入患者體內誘發(fā)免疫反應，產生相應抗體。尤其是RhD陰性的育齡婦女，盡可能避免輸注RhD陽性血液，避免發(fā)生免疫反應，以預防新生兒溶血??；同時準確鑒定RhD血型及基因分型，可為臨床輸血安全提供保障。