周 潔，吉 玲，王新華，周栩平

(1.駐馬店市中心醫(yī)院新生兒科，河南 駐馬店 463000；2.鄭州大學第三附屬醫(yī)院新生兒科，河南 鄭州 450000)

哮喘是一種常見的呼吸系統(tǒng)疾病，其發(fā)病率呈上升趨勢，給患者及其家庭帶來嚴重影響[1-4]。哮喘的發(fā)生與支氣管上皮細胞凋亡有關(guān)，研究支氣管上皮細胞凋亡水平對探討哮喘的發(fā)病機制具有重要作用[5]。細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule，ICAM-1)屬于免疫球蛋白超家族的成員之一，在呼吸道上皮反應中起重要作用，其在白細胞滲出、細胞信號轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)錄因子活化等過程中均起作用[6]。呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus，RSV)是誘發(fā)支氣管炎、肺炎等呼吸系統(tǒng)疾病的主要原因，嚴重威脅免疫低下患者的生命健康[7]。有研究顯示，ICAM-1在支氣管上皮細胞黏附和炎癥反應中具有重要作用，其還是多種病毒的受體蛋白[8-9]。目前，ICAM-1在支氣管上皮細胞凋亡中的作用尚不清楚。本研究通過檢測哮喘兒童支氣管黏膜組織中ICAM-1水平，并用RSV感染支氣管上皮細胞，探討ICAM-1在哮喘支氣管上皮細胞凋亡中的作用，以期為研究哮喘的發(fā)病機制提供參考。

1 材料與方法

1.1材料收集駐馬店市中心醫(yī)院2014年5月至2017年12月收治的28例支氣管哮喘兒童的支氣管黏膜組織標本，男16例，女12例，年齡4～13(8.0±0.3)歲；同時選取28例支氣管擴張非哮喘兒童的支氣管黏膜組織作為對照，男13例，女15例，年齡6～14(10.0±0.8)歲。支氣管黏膜組織來源于纖維支氣管鏡檢查，組織標本采集均征得患者及家屬同意，并經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準同意。

1.2細胞、試劑與儀器支氣管上皮細胞16HBE購自上海歌凡生物細胞庫，RSV由購自上海邦奕生物科技有限公司的酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒保存；ICAM-1 siRNA購自上海西寶生物科技股份有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自德國Qiagen公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)檢測試劑盒購自美國Abcam公司，活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase,Cleaved Caspase-3)抗體、核因子-κB p65(nuclear factor-κB p65，NF-κB p65)抗體購自美國CTS公司；紫外分光光度計UV-2450購自日本島津公司，6孔板細胞爬片購自上海晶安生物科技有限公司，流式細胞儀購自美國Beckman公司。

1.3實驗方法

1.3.1qRT-PCR檢測支氣管黏膜組織中ICAMmRNA表達按照RNA提取試劑盒說明書提取正常支氣管黏膜組織和哮喘支氣管黏膜組織中的RNA，紫外分光光度計檢測提取的RNA的濃度和純度，-80 ℃保存。使用cDNA合成試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，qRT-PCR測定不同支氣管黏膜組織中ICAM-1 mRNA的表達。ICAM-1上游引物序列為5′-GCGACCACGGACGGAATTTCT-3′，下游引物序列為5′-TCAGGACCCTAGTCGGAAGATCGA-3′。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydroge-nase，GAPDH)上游引物序列為5′-CGGAGTCAA-CGGATTTGGTCGTAT-3′，下游引物序列為5′-AGC-CTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。qRT-PCR反應程序為：94 ℃，45 s；58 ℃，60 s；72 ℃，80 s，共35個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，2-△△Ct法計算不同支氣管黏膜組織中ICAM-1 mRNA表達水平。

1.3.2Westernblot法檢測支氣管黏膜組織中ICAM-1蛋白表達用蛋白提取試劑盒提取正常支氣管黏膜組織和哮喘支氣管黏膜組織中的總蛋白。用二喹啉甲酸法對蛋白進行定量檢測。使用6孔板，每孔添加30 μg的蛋白樣品，與Loading buffer以同體積混合，100 ℃煮沸5 min。給予90 V電壓，電泳至溴酚藍達到分離膠和濃縮膠邊緣時，將電壓調(diào)整至120 V，繼續(xù)電泳至溴酚藍進入分離膠的底部。在室溫條件下，50 g·L-1牛血清白蛋白封閉 90 min，同時分別加入ICAM-1一抗(11 000)、GAPDH一抗(11 000)，4 ℃下反應過夜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(12 000)室溫孵育 90 min。Osyssey掃描圖像，ICAM-1蛋白相對表達量=ICAM-1灰度值/GAPDH灰度值。

1.3.3細胞培養(yǎng)與分組支氣管上皮細胞16HBE用含體積分數(shù)10% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。將正常培養(yǎng)的支氣管上皮細胞16HBE分為對照組、感染組、陰性組和干擾組。對照組細胞正常培養(yǎng)，不做任何處理；感染組細胞感染RSV，但不進行轉(zhuǎn)染；陰性組細胞轉(zhuǎn)染siRNA-control后感染RSV；干擾組細胞轉(zhuǎn)染ICAM-1 siRNA后感染RSV。當支氣管上皮細胞16HBE融合為60%時，用Lipofectamine 2000進行轉(zhuǎn)染，步驟參照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書。RSV感染步驟參照文獻[10]，當16HBE細胞融合為65%左右時，加入不含血清的培養(yǎng)液洗滌3次，在細胞中添加感染復數(shù)=0.006 7的RSV病毒懸浮液(用不含血清的培養(yǎng)液配制)，37 ℃孵育2 h。用不含血清的培養(yǎng)液洗滌細胞2次，加入細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.4qRT-PCR和Westernblot法檢測各組細胞中ICAM-1mRNA和蛋白水平各組細胞干預處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，qRT-PCR和Western blot法檢測細胞中ICAM-1 mRNA和蛋白水平，步驟同“1.3.1、1.3.2”項。

1.3.5流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡情況對照組、感染組、陰性組、干擾組干預處理后繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，收集細胞，加入胰蛋白酶消化，1 000 r·min-1離心 10 min，棄上清液，加入預冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)將細胞重懸后，1 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，加入5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)、5 μL 膜聯(lián)蛋白(Annexin)-V-異硫氫酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)(Annexin-V-FITC)，室溫、避光反應20 min，再加入400 μL結(jié)合緩沖液，1 h 內(nèi)用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。

1.3.6ELISA法檢測各組細胞培養(yǎng)基上清液中IL-1β、TNF-α水平對照組、感染組、陰性組、干擾組細胞在干預處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集各組細胞培養(yǎng)基上清液，ELISA法測定培養(yǎng)基上清液中IL-1β、TNF-α水平，嚴格按照IL-1β和TNF-α檢測試劑盒說明書進行操作。

1.3.7Westernblot法檢測各組細胞中CleavedCaspase-3、NF-κBp65蛋白水平對照組、感染組、陰性組、干擾組細胞在干預處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集各組細胞，提取細胞中的總蛋白，用Western blot法檢測細胞中Cleaved Caspase-3、NF-κB p65蛋白水平，Cleaved Caspase-3、NF-κB p65一抗分別以1800和1600稀釋，其他步驟同“1.3.2”項。

2 結(jié)果

2.1ICAM-1mRNA和蛋白在不同支氣管黏膜中表達比較結(jié)果見圖1。正常支氣管黏膜組織和哮喘支氣管黏膜組織中ICAM-1 mRNA的表達水平分別為1.00±0.13和2.64±0.25，ICAM-1 蛋白表達水平分別為0.32±0.02和1.05±0.14。哮喘支氣管黏膜組織中ICAM-1 mRNA和蛋白水平顯著高于正常支氣管黏膜組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

1：正常支氣管黏膜組織；2：哮喘支氣管黏膜組織。

圖1不同支氣管黏膜組織中ICAM-1蛋白表達(Westernblot)

Fig.1ExpressionofICAM-1proteinindifferentbronchialmucosatissues(Westernblot)

2.2各組支氣管上皮細胞16HBE中ICAM-1mRNA和蛋白表達比較結(jié)果見圖2。對照組、感染組、陰性組、干擾組細胞中ICAM-1 mRNA表達水平分別為1.00±0.12、2.17±0.23、2.15±0.20、1.58±0.11，ICAM-1蛋白表達水平分別為0.25±0.03、1.03±0.07、1.02±0.09、0.47±0.05。感染組、陰性組、干擾組細胞中ICAM-1 mRNA和蛋白表達水平均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。干擾組細胞中ICAM-1 mRNA和蛋白水平均顯著低于感染組和陰性組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3各組支氣管上皮細胞16HBE細胞凋亡率比較結(jié)果見圖3。對照組、感染組、陰性組、干擾組細胞凋亡率分別為(7.62±0.71)%、(28.32±2.17)%、

(27.49±2.40)%、(14.38±1.22)%。感染組、陰性組、干擾組細胞凋亡率顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；干擾組細胞凋亡率顯著低于感染組和陰性組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

1：對照組；2：感染組；3：陰性組；4：干擾組。

圖2各組支氣管上皮細胞中ICAM-1蛋白表達(Westernblot)

Fig.2ExpressionofICAM-1proteinofbronchialepithelialcellsineachgroup(Westernblot)

圖3流式細胞術(shù)檢測各組支氣管上皮細胞細胞凋亡情況

Fig.3Apoptosisofbronchialepithelialcellsineachgroupdetectedbyflowcytometry

2.4各組支氣管上皮細胞16HBE培養(yǎng)基上清液中IL-1β、TNF-α水平比較對照組、感染組、陰性組、干擾組細胞培養(yǎng)基上清液中IL-1β水平分別為1.11±0.10、1.62±0.08、1.66±0.12、1.35±0.08，TNF-α水平分別為1.64±0.13、2.38±0.21、2.39±0.20、2.01±0.12。感染組、陰性組、干擾組細胞培養(yǎng)基上清液中IL-1β、TNF-α水平均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。干擾組細胞培養(yǎng)基上清液中IL-1β、TNF-α水平顯著低于感染組和陰性組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.5各組支氣管上皮細胞16HBE中CleavedCaspase-3、NF-κBp65蛋白水平比較結(jié)果見圖4。對照組、感染組、陰性組、干擾組細胞中Cleaved Caspase-3蛋白水平分別為0.26±0.05、0.84±0.09、0.87±0.04、0.48±0.06，NF-κB p65蛋白水平分別為0.28±0.04、0.89±0.07、0.86±0.06、0.64±0.05。感染組、陰性組、干擾組細胞中Cleaved Caspase-3、NF-κB p65蛋白水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。干擾組細胞Cleaved Caspase-3、NF-κB p65蛋白水平顯著低于感染組和陰性組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

1：對照組；2：感染組；3：陰性組；4：干擾組。

圖4各組支氣管上皮細胞中CleavedCaspase-3、NF-κBp65蛋白表達(Westernblot)

Fig.4ExpressionofCleavedCaspase-3andNF-κBp65proteinbronchialepithelialcellsineachgroup(Westernblot)

3 討論

支氣管哮喘是一種呼吸道免疫炎癥相關(guān)的疾病，其發(fā)生與肥大細胞、T淋巴細胞、呼吸道上皮細胞等多種細胞有關(guān)[11-12]。ICAM-1在內(nèi)皮細胞、白細胞、上皮細胞等細胞中廣泛表達，屬于免疫球蛋白超家族，參與細胞的識別、信號轉(zhuǎn)導、活化增殖與分化，以及細胞的伸展和轉(zhuǎn)移、免疫應答、腫瘤轉(zhuǎn)移等一系列重要的生理和病理過程[13]。正常情況下，ICAM-1表達水平較低，而在發(fā)生炎癥反應時，多種細胞因子作用于上皮細胞，誘導ICAM-1表達，進一步引起炎性因子釋放[14-15]。研究顯示，大鼠敲除ICAM-1基因后，基因缺陷的大鼠呼吸道內(nèi)炎癥程度明顯降低，提示抑制ICAM-1的表達可以降低哮喘呼吸道炎癥細胞的浸潤，減輕哮喘癥狀[16]。唐力瓊等[17]研究表明，用RSV誘導大鼠發(fā)生哮喘后，大鼠肺組織中ICAM-1水平升高，使用咳喘寧治療后，哮喘大鼠肺組織中ICAM-1水平下降。本研究收集了哮喘兒童支氣管黏膜組織和非哮喘兒童支氣管黏膜組織，用qRT-PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，ICAM-1在哮喘兒童支氣管黏膜組織中的表達水平高于非哮喘兒童支氣管黏膜組織，提示ICAM-1在哮喘兒童支氣管黏膜組織中表達上調(diào)。

呼吸道上皮細胞能夠?qū)⑼饨绛h(huán)境中的有害物質(zhì)隔離，形成免疫屏障，也是機體對抗病毒等物質(zhì)的機械屏障[18]。正常情況下，呼吸道上皮完整的組織結(jié)構(gòu)可以保護微環(huán)境的穩(wěn)定。當受到外界環(huán)境刺激后，呼吸道上皮細胞作為效應細胞合成黏附因子等多種細胞分子，參與免疫反應[19]。RSV感染后可誘導呼吸道上皮細胞發(fā)生損傷，破壞細胞骨架，導致呼吸道上皮組織完整性受到破壞，引起肺炎、支氣管炎、哮喘等疾病的發(fā)生[20]。本研究結(jié)果顯示，RSV感染后的支氣管上皮細胞凋亡率增加，細胞培養(yǎng)基上清液中IL-1β、TNF-α水平也升高，而下調(diào)ICAM-1后，細胞凋亡率有所降低，細胞培養(yǎng)基上清液中 IL-1β、TNF-α水平下降，說明下調(diào)ICAM-1可以緩解RSV誘導的支氣管上皮細胞損傷。

NF-κB與炎性因子、趨化因子等多種細胞因子的分泌有關(guān)，其在正常情況下以非活性形式存在于細胞質(zhì)內(nèi)，當細胞受到外界環(huán)境刺激后可以被激活進入到細胞核內(nèi)，影響靶基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細胞的生長、凋亡等過程[21]。NF-κB p65是NF-κB發(fā)揮生物學活性所必需的亞單位[22]。研究顯示，NF-κB p65在哮喘兒童肺組織中表達上調(diào)，在呼吸道上皮細胞中廣泛表達[23]。Caspase-3參與支氣管上皮細胞的凋亡過程，是Caspase凋亡級聯(lián)反應中的凋亡執(zhí)行子，其活化成為Cleaved Caspase-3后可以誘導細胞凋亡的發(fā)生[24-26]。本研究結(jié)果顯示，RSV感染后的支氣管上皮細胞中Cleaved Caspase-3、NF-κB p65水平升高，而下調(diào)ICAM-1后，支氣管上皮細胞經(jīng)RSV感染，細胞中的Cleaved Caspase-3、NF-κB p65水平下降，提示下調(diào)ICAM-1可以通過降低Caspase-3活化水平抑制RSV誘導的支氣管上皮細胞凋亡，其作用機制還可能與NF-κB p65有關(guān)。

綜上所述，ICAM-1在哮喘兒童支氣管黏膜組織中過度表達，參與哮喘的發(fā)生，在RSV誘導的支氣管上皮細胞凋亡和炎性因子分泌中具有重要作用，而其具體作用機制仍需進一步研究。本研究為今后研究哮喘的發(fā)病機制及靶向ICAM-1減少哮喘支氣管上皮細胞損傷提供了理論基礎。