秦嘉 △

(1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科,2內(nèi)分泌科 上海 200032)

中國高血壓患者總?cè)藬?shù)已突破3.3億,按病因可分為原發(fā)性和繼發(fā)性高血壓。其中原發(fā)性醛固酮增多癥(primary aldosteronism,PA)是繼發(fā)性高血壓中最常見的病因,在年輕高血壓人群中約占10%[1-4]。PA臨床表現(xiàn)為高血壓和(或)低血鉀的臨床綜合征,其作為一種“可治愈的高血壓”,若能早期診斷,可通過手術(shù)或藥物治療使血壓回到正常水平[5],可降低患者心血管事件的發(fā)生率,改善患者預(yù)后[6]。

腎素是由腎小球旁器釋放的一種蛋白水解酶,能催化肝臟分泌進(jìn)入血漿中的血管緊張素原轉(zhuǎn)變成血管緊張素Ⅰ (angiotensin Ⅰ,Ang Ⅰ),從而增加醛固酮的生成。醛固酮是由腎上腺皮質(zhì)球狀帶分泌的鹽皮質(zhì)激素,主要生理功能是保鈉排鉀,通過調(diào)節(jié)血容量維持體液水鹽平衡[7]。臨床上推薦使用醛固酮/腎素活性比值(aldosterone to renin ratio,ARR)作為PA的初篩方法,再使用生理鹽水抑制試驗(yàn)、開博通試驗(yàn)等作為確認(rèn)試驗(yàn),最后使用腎上腺靜脈取樣檢測醛固酮(AVS試驗(yàn))進(jìn)行術(shù)前定位[8]。在這些臨床實(shí)驗(yàn)中,準(zhǔn)確檢測腎素活性-醛固酮濃度至關(guān)重要。

血漿腎素活性(plasma renin activity,PRA)水平非常低,僅為ng級,因此對檢測方法的靈敏度要求很高。19世紀(jì)70年代起使用放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)檢測[9],之后也開發(fā)出化學(xué)發(fā)光法檢測直接腎素濃度[10-11],這兩種方法是目前臨床常用的腎素檢測方法。免疫法可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作,檢測快速、成本低,但單次僅能檢測一種靶標(biāo)激素,特異性差、尤其是女性患者易出現(xiàn)交叉反應(yīng)[12-13]。內(nèi)分泌激素水平在機(jī)體病理狀態(tài)下波動(dòng)范圍大,易出現(xiàn)極高/低值,而免疫分析法在此類情況下準(zhǔn)確性與重復(fù)性的不足,令其在功能性試驗(yàn)中無法正確反映患者的激素水平動(dòng)態(tài)波動(dòng),從而影響臨床診斷的靈敏度及特異性。因此迫切需要尋找更靈敏、更準(zhǔn)確的方法檢測PRA。

本文旨在建立質(zhì)譜技術(shù)檢測PRA的方法,并結(jié)合多重反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)技術(shù),利用質(zhì)譜平臺的高敏感性和高特異性準(zhǔn)確定量PRA,早期快速篩查PA,從而更好地為臨床提供有效、準(zhǔn)確的信息,為快速篩查診斷PA創(chuàng)造條件。

資 料 和 方 法

儀器和試劑AB SCIEX?Triple Quad 6500+LC-MS/MS系統(tǒng),標(biāo)準(zhǔn)品為人血管緊張素Ⅰ乙酸鹽水合物(5 mg,上海市圓創(chuàng)生物科技有限公司);內(nèi)標(biāo)品為Ang Ⅰ穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)arginine13C15N (5 mg,Anaspec,Fremont,成都康普尼生物科技有限公司);無激素正常人混合血漿SeraConTMⅡ (美國SeraCare Life Sciences公司);甲醇(德國Merck公司,色譜級);牛血清白蛋白(美國Sigma Life Science公司);苯甲基磺酰氟(德國Roche診斷公司);Tris Base堿(德國Roche診斷公司);甲酸(美國ROE scientific公司,高效液相色譜級)。

患者入組本研究納入2017年12月至2018年1月就診于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院門診內(nèi)分泌科并獲得醫(yī)囑檢測PRA的360名高血壓患者及同期在我院體檢中心體檢的296名表面健康人群。所有樣本獲取及使用過程均獲復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)及患者知情同意。

高血壓患者納入標(biāo)準(zhǔn):原發(fā)性高血壓診斷依據(jù)為2010年中國高血壓防治指南。其中27例PA的診斷依據(jù)為2016年中國制定的《原發(fā)性醛固酮增多癥診斷治療的專家共識》。

體檢表面健康人群納入標(biāo)準(zhǔn):年齡≥18歲;BMI為18.0～35.0 kg/m2;血壓無異常(<130/80 mmHg,1 mmHg=0.133 kPa);血鉀無異常(2.8～6.2 mmol/L);未服用降壓藥物或經(jīng)過激素治療;無吸煙嗜酒;無嚴(yán)重器質(zhì)性心臟病;無心功能3級及以上的心功能不全;無肝、腎功能不全;非妊娠、哺乳期婦女。

標(biāo)本采集使用EDTA抗凝真空管采集患者靜脈血。盡快(2 h內(nèi))離心分離血漿,并分裝到尖底離心管內(nèi),-80 ℃凍存。

標(biāo)準(zhǔn)品配制 在2 mL無激素正常人混合血漿中準(zhǔn)確溶解10 μg Ang I,配制成5 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。將儲備液按照一定比例稀釋為0.337 5 (S1)、0.675 0 (S2)、1.350 0 (S3)、2.700 0 (S4)、9.000 0 (S5)及30.0000 ng/mL (S6)標(biāo)準(zhǔn)品。分裝后-80 ℃保存?zhèn)溆?不能反復(fù)使用。

質(zhì)控品配制 在無激素正常人混合血漿中準(zhǔn)確溶解10 μg Ang I,配制成5 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。將儲備液按照一定比例稀釋為2.0、4.0及8.0 ng/mL質(zhì)控品。分裝后-80 ℃保存?zhèn)溆?不能反復(fù)使用。

內(nèi)標(biāo)品配制 在含有2 mL 1% BSA的0.1 mol/L Tris (pH=6)工作緩沖液中準(zhǔn)確溶解10 μg arginine13C15N,配制成5 000 ng/mL的內(nèi)標(biāo)儲備液。將Ang I 內(nèi)標(biāo)儲備液用10%甲酸水溶液稀釋至10 ng/mL。

樣本前處理將血漿、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和內(nèi)標(biāo)品取出平衡至室溫。(1)孵育反應(yīng)[14]:分別取250 μL 標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和患者血漿,加入50 μL孵育緩沖液,震蕩混勻后37 ℃孵育3 h。孵育結(jié)束后加入300 μL Ang Ⅰ SIS震蕩混勻后終止酶促反應(yīng)。孵育緩沖液的配置:分別取121.1 g Tris Base與74.0 g EDTA,加入900 mL去離子水后超聲30 min,直至完全溶解后再用去離子水定容至1 000 mL。最后用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至5.45～5.50,2～8 ℃保存。(2)固相萃取:使用Waters OASIS HLB uElution 96孔板進(jìn)行抽提和萃取。每孔預(yù)先使用甲醇和5%甲酸水溶液1 mL對填料進(jìn)行平衡和活化,加入孵育反應(yīng)后的600 μL樣本(血漿或標(biāo)準(zhǔn)品)進(jìn)行抽提和萃取,依次加入5%甲酸水溶液和20%甲醇水溶液各1 mL進(jìn)行淋洗,分別將不同極性的雜質(zhì)洗脫。最后使用250 μL甲醇將目標(biāo)分析物以及穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)洗脫入樣本收集板。

色譜分析條件與質(zhì)譜條件色譜柱為Phenomenex Kinetex C18 (2.6 μm×100 mm×3.0 mm),柱溫55 ℃。流動(dòng)相A為0.2%的甲醇水溶液,流動(dòng)相B為0.2%的甲酸甲醇溶液,流速0.5 mL/min。按濃度梯度洗脫(表1)。將萃取得到的樣品上機(jī)檢測,每次進(jìn)樣量為5 μL。質(zhì)譜條件為Ang Ⅰ定量的轉(zhuǎn)換離子對(m/z)為433.1→647.5,錐孔電壓為46 V,碰撞能量為22 V;Ang I SIS定量的轉(zhuǎn)換離子對(m/z)為436.4→657.5,錐孔電壓為46 V,碰撞能量為22 V,質(zhì)譜裂解信息見圖1。

表1 檢測流動(dòng)相梯度Tab 1 Gradient of mobile phase

A:0.2% aqueous methanol solution;B:0.2% formic acid methanol solution.

圖1質(zhì)譜裂解信息
Fig1Themassspectrometrycleavageinformation

方法學(xué)考察

預(yù)驗(yàn)證 (1)特異性:使用無激素正常人混合血漿作為雙空白樣本,經(jīng)前處理后重復(fù)進(jìn)樣檢測5次,比較背景峰面積與定量檢測下限(lower limit of measuring interval,LLMI)峰面積,驗(yàn)證該方法的特異性。背景峰面積/LLMI峰面積<20%即判斷為可接受。(2)基質(zhì)效應(yīng):選取正常人混合空白血漿和流動(dòng)相,經(jīng)前處理后加入25 μL 9 ng/mL和100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品(標(biāo)準(zhǔn)品被稀釋10倍),4份標(biāo)本分別進(jìn)樣檢測5次,比較血漿基質(zhì)和純?nèi)芤合碌男盘柋戎?ME%),ME%<100%±15%即判斷為可接受。(3)攜帶污染:在250 μL甲醇中加入25 μL濃度為100.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品S7作為高值標(biāo)本(10.0 ng/mL);在250 μL甲醇中加入25 μL 9.0 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品S5作為低值標(biāo)本(0.9 ng/mL),低值標(biāo)本進(jìn)樣5次,高-低進(jìn)樣反復(fù)5個(gè)循環(huán)。高-低值轉(zhuǎn)換樣品均值與低-低值轉(zhuǎn)換樣品均值之差小于低-低值轉(zhuǎn)換樣品的3倍標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation,SD)即判斷為可接受。(4)重復(fù)性:將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至110% LLMI (0.372 ng/mL)、90% LLMI (27.000 ng/mL)和50% [(LLMI+ULMI)15.169 ng/mL,ULMI:upper limit of measuring interval (定量檢測上限)]作為待測樣品。經(jīng)前處理后每種濃度的樣本重復(fù)進(jìn)樣20次,計(jì)算SD和CV,CV<15%即判斷為可接受。

性能驗(yàn)證

定量下限 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品,當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.337 5、0.084 4和0.042 2 ng/mL,每個(gè)濃度重復(fù)檢測10次,將同時(shí)滿足CV<15%、檢測偏倚(deviation,Dev)<10%且信噪比>20∶1的最低濃度值定為定量檢出限。

線性評價(jià) 將濃度為100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為6個(gè)濃度(30.000 0、9.000 0、2.700 0、1.350 0、0.675 0、0.337 5 ng/mL),重復(fù)檢測3次取均值。各濃度的Dev<10%,CV<15%且曲線的回歸系數(shù)(r2)>0.99可判斷為呈線性。

不精密度評價(jià) 使用高(8.0 ng/mL)、中(4.0 ng/mL)、低(0.25 ng/mL) 3個(gè)濃度水平的質(zhì)控品作為待測樣品,分別同時(shí)檢測20次,評價(jià)批內(nèi)不精密度;將混合血漿分裝于-20 ℃保存,連續(xù)檢測3天,每天重復(fù)3次,評價(jià)批間不精密度。LLMI濃度3倍附近低值CV<20%,其余CV<15%即判斷為可接受。

準(zhǔn)確度評價(jià) 在3個(gè)濃度水平的質(zhì)控品(2.0、4.0和8.0 ng/mL)中同時(shí)添加標(biāo)準(zhǔn)品S4 (2.7 ng/mL),每份樣本重復(fù)檢測5次取均值,并與理論值進(jìn)行比較計(jì)算Dev。準(zhǔn)確度Dev<15%且低濃度Dev<20%即判斷為可接受。回收率需滿足80%～120%。

稀釋一致性 將濃度為100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品S7稀釋至3個(gè)濃度(20、10、5 ng/mL),經(jīng)前處理后每個(gè)濃度進(jìn)樣檢測5次,當(dāng)滿足濃度>3倍LLMI時(shí),回收率在100.0%±15.0%,CV<15%即判斷為可接受。

樣本穩(wěn)定性及儲存穩(wěn)定性 選取低、高各2組混合血漿樣本分別置于25、4、-80 ℃保存15 h后進(jìn)行檢測,每組檢測4次,計(jì)算均值與CV%,CV<15%即判斷為可接受。血液樣本采集后處理穩(wěn)定性:采用隨機(jī)數(shù)表法(不重復(fù)抽樣)在360例高血壓患者標(biāo)本中隨機(jī)選取20例血樣,按3種不同處理要求進(jìn)行血漿分離,分別檢測3種處理后的PRA計(jì)算均值與CV%,CV<15%即判斷為可接受。標(biāo)本采集后立即分離血漿,于37 ℃孵育3 h;標(biāo)本采集后立即分離血漿,于4 ℃放置5 h后于37 ℃孵育3 h;標(biāo)本采集后靜置5 h,隨后分離血漿,于37 ℃孵育3 h。

臨床評估 建立生物參考區(qū)間:表面健康人群根據(jù)性別進(jìn)行分組,并統(tǒng)計(jì)分析是否存在性別差異,如有差異則分組建立參考區(qū)間;通過相關(guān)性分析判斷年齡和檢測值之間是否存在相關(guān)性,如存在相關(guān)性則根據(jù)年齡分段建立參考區(qū)間。判斷健康人群結(jié)果是否為正態(tài)分布,非正態(tài)分布使用2.5%與97.5%百分位數(shù)作為參考區(qū)間上下限。方法學(xué)比較:與RIA檢測所得PRA結(jié)果進(jìn)行一致性與偏倚評價(jià)。臨床應(yīng)用評估:使用LC-MS/MS和RIA法所得結(jié)果計(jì)算ARR,評價(jià)兩者比值對PA診斷的靈敏度和特異性,綜合評價(jià)診斷性能。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 17.0 軟件計(jì)算均值、SD、CV、Dev和回收率。使用Skewness-Kurtosis檢驗(yàn)程序判斷數(shù)據(jù)正態(tài)性;使用Stem-and-Leaf&Box Plots程序剔除離群值;使用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析是否存在性別差異;使用Spearman相關(guān)性分析判斷年齡和檢測值之間是否存在相關(guān)性。方法間結(jié)果比較使用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)進(jìn)行分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ROC曲線評價(jià)自建質(zhì)譜方法與RIA所得結(jié)果對于PA診斷的靈敏度和特異性。

結(jié) 果

方法學(xué)驗(yàn)證

預(yù)驗(yàn)證

LC-MS/MS檢測 標(biāo)準(zhǔn)品S3和血漿標(biāo)本Ang Ⅰ (m/z:433.1→647.5)及其內(nèi)標(biāo)物Ang Ⅰ-IS (m/z:436.4→657.5)的色譜圖見圖2,保留時(shí)間分別為2.06和2.05 min。

A and B:The chromatogram of the standard S3 Ang I and Ang I-IS;C and D:The chromatogram of the plasma sample Ang I and Ang I-IS.

圖2LC-MS/MS檢測PRA的色譜圖
Fig2ChromatogramsofPRAdetectedbyLC-MS/MS

特異性 雙空白血漿重復(fù)進(jìn)樣5次所得到背景峰面積/LLMI峰面積分別為3.61%、3.02%、4.14%、2.43%和0.99%,均小于20%。另外,背景峰面積/預(yù)期IS峰面積分別為0.11%、0.18%、0.18%、0.09%和0.09%,均小于5%。以此驗(yàn)證該方法的特異性滿足要求。

基質(zhì)效應(yīng) 添加低、高值(9 ng/mL、100 ng/mL)標(biāo)準(zhǔn)品的血漿基質(zhì)和純?nèi)芤合碌男盘柋戎?ME%)分別為93.88%(低濃度)和103.02%,說明血漿基質(zhì)對低、高濃度樣本的影響分別表現(xiàn)為離子抑制和離子增強(qiáng),影響幅度在15%之內(nèi)則滿足建議要求。

攜帶污染 高-低值轉(zhuǎn)換樣品均值與低-低值轉(zhuǎn)換樣品均值分別為0.353和0.372,兩者的差值(0.019)小于3倍低-低值轉(zhuǎn)換樣品SD,判斷為可接受。

重復(fù)性 110% LLMI (0.372 ng/mL)、90%LLMI (27.000 ng/mL)和50%(LLMI+ULMI)(15.169 ng/mL) 3種濃度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的CV分別為5.17%、2.00%和7.93%,均<15%即判斷為可接受。

性能驗(yàn)證

線性評價(jià) 將濃度為100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為6個(gè)濃度(30.000 0、9.000 0、2.700 0、1.350 0、0.675 0、0.337 5 ng/mL),重復(fù)檢測3次取均值。LLMI濃度點(diǎn)及其余濃度點(diǎn)的Dev<10%且CV<15%則滿足建議要求。PRA的回歸方程是y=0.091 7x+0.010 3,相關(guān)系數(shù)r2=0.99,PRA的線性范圍為0.084 4～30.000 0 ng/mL。

不精密度評價(jià) 低(0.25 ng/mL)、中(4.0 ng/mL)、和高(8.0 ng/mL) 3個(gè)濃度水平的PRA溶液(質(zhì)控品)批內(nèi)不精密度分別為3.54%、1.32%和1.88%,日間不精密度分別為5.69%、2.22%和1.92%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示3濃度水平質(zhì)控品的批內(nèi)和日間CV 均<15%,滿足應(yīng)用建議要求。

準(zhǔn)確度評價(jià) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示低、中、高3個(gè)濃度水平質(zhì)控品的Dev分別為-8.81%、2.18%和2.62%,Dev均<15%,滿足應(yīng)用建議的要求?；厥章蕿?1.28%～102.62%,符合80%～120%的標(biāo)準(zhǔn)。

表3 PRA稀釋一致性Tab 3 The dilution consistency of PRA

Level 1:20 ng/mL;Level 2:10 ng/mL;Level 3:5 ng/mL.

樣本穩(wěn)定性 儲存穩(wěn)定性:低、高各2組混合血漿樣本在25、4、-80 ℃保存15 h后,4次檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.14)。血漿樣本采集后處理穩(wěn)定性:20例隨機(jī)血樣按A1、A2和B方案進(jìn)行血漿分離,3種樣本處理后的PRA差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),以A1為100%,換算為A2和B組的百分比繪制圖3。

方法學(xué)比較360例高血壓樣本中臨床確診為PA的樣本為27例。比較分析LC-MS/MS和RIA結(jié)果之間的相關(guān)性,Spearman相關(guān)檢驗(yàn)結(jié)果顯示r2=0.81,P<0.05,兩者結(jié)果一致性較好(圖4)。Bland-Altman plot圖橫坐標(biāo)為兩方法所得結(jié)果的均值,縱坐標(biāo)為兩方法之間的相對偏差。與RIA結(jié)果相比,LC-MS/MS方法的檢測結(jié)果的平均偏差為-18.5% 。

臨床應(yīng)用評估根據(jù)兩方法檢測結(jié)果計(jì)算ARR,繪制兩種方法的ROC曲線(圖5),曲線下面積LC-MS/MS為0.983(P<0.05),RIA為0.894 (P<0.05)。LC-MS/MS所得PRA計(jì)算的ARR對PA的診斷性能更佳。以30作為ARR的切點(diǎn),LC-MS/MS的靈敏度和特異性分別為96.3%和91.0%,雖然RIA的診斷特異性(99.4%)較好,但靈敏度(33.3%)損失嚴(yán)重。

Using random number table method,Specimen selected from blood samples of 360 patients with hypertension.

圖3血漿樣本采集后處理穩(wěn)定性
Fig3Thetreatmentstabilityaftertheplasmasamplecolletion

Solid lines represented the mean negative bias.Dotted lines represented 95% limits of agreement.

圖4LC-MS/MS和RIA檢測PRA的BA圖
Fig4Bland-AltmananalysisbetweenLC-MS/MSandRIAforPRA

討 論

我們使用AB SCIEX?Triple Quad 6500+系統(tǒng)建立了LC-MS/MS檢測PRA的方法。PRA的定量分為兩個(gè)步驟:(1)經(jīng)過孵育血漿中的血管緊張素原轉(zhuǎn)換為Ang Ⅰ;(2)定量檢測Ang Ⅰ。所以PRA的檢測實(shí)際是Ang Ⅰ水平變化的檢測。

PRA的檢測在先前的研究中室間一致性結(jié)果較差,這可能是由于標(biāo)本的分析前和分析中因素等變量所造成。我們的方法在建立過程中不斷優(yōu)化反應(yīng)條件,對標(biāo)本保存方式、孵育時(shí)間溫度、SPE提取損失、樣本吸附等方面進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn),盡可能減少實(shí)驗(yàn)條件對檢測造成的分析前和分析中誤差,保證PRA定量的準(zhǔn)確性。

圖5LC-MS/MS與RIA的ROC曲線
Fig5ThereceiveroperatingcharacteristiccurveanalysisbetweenLC-MS/MSandRIA

在分析前誤差分析中,我們針對樣本的采集后處理穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性進(jìn)行了詳盡的分析。PRA標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)采集轉(zhuǎn)運(yùn)流程應(yīng)為:血樣采集后30 min內(nèi)冰浴送檢并離心分離血漿,但在實(shí)際操作中,尤其在住院患者的采樣中執(zhí)行難度較大。在我們的實(shí)驗(yàn)中,標(biāo)本采集后即刻離心分離血漿,與全血保存5 h后分離血漿進(jìn)行檢測,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這也保證了病房采集標(biāo)本后未能及時(shí)送檢不會帶來結(jié)果偏差。在分離血漿后樣本儲存的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中,血漿標(biāo)本可在室溫、4℃冷藏和-20 ℃冷凍情況下穩(wěn)定15 h。這也保證了非門診時(shí)間段采樣標(biāo)本分離血漿后儲存的穩(wěn)定性。

綜上所述,本研究利用高靈敏度和高特異性的質(zhì)譜平臺準(zhǔn)確定量PRA。該方法已在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院應(yīng)用于臨床,結(jié)果得到了認(rèn)可。但質(zhì)譜方法在臨床的推廣仍存在一定局限性。昂貴的儀器、較高的耗材成本、操作人員專業(yè)欠缺、實(shí)驗(yàn)室自建檢測方法建立有待規(guī)范和無法與實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)對接等問題仍需進(jìn)一步解決。