荊玉棟，周駿翔

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人類高賴氨酸血癥源于線粒體穩(wěn)態(tài)破壞

荊玉棟，周駿翔

中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所，北京 100101

周駿翔 博士

氨基酸代謝紊亂是一類遺傳性代謝病，絕大多數(shù)屬于常染色體隱性遺傳病。高賴氨酸血癥即是其中一種比較罕見的氨基酸代謝病，分I型和II型。I型患者血液中賴氨酸濃度偏高，但是癥狀不明顯。II型患者血液中除賴氨酸濃度升高外，酵母氨酸濃度也會增高，患者會表現(xiàn)出嚴重的神經(jīng)損傷和發(fā)育遲緩，多數(shù)患者在成年之前死亡。目前的研究對人體內(nèi)的賴氨酸主要降解途徑——酵母氨酸途徑已經(jīng)比較清楚：雙功能酶α-氨基半醛合酶(α-aminoadipic semialdehyde synthase, AASS)是該途徑主要的催化酶，N端是賴氨酸-酮戊二酸還原酶(lysine ketalu-tarate reductase, LKR)結構域，C端是酵母氨酸脫氫酶(saccharopine dehydrogenase, SDH)結構域，線粒體內(nèi)的賴氨酸在LKR活性催化下與酮戊二酸結合，形成酵母氨酸，然后在SDH活性催化下分解成谷氨酸和氨基己二酸半醛，最后經(jīng)過一系列生化反應變成乙酰輔酶A進入三羧酸循環(huán)。高賴氨酸血癥的致病基因也已經(jīng)明確，即賴氨酸降解途徑的關鍵酶AASS。I型主要是LKR部分發(fā)生了突變，II型主要是SDH部分發(fā)生了突變。但是，關于賴氨酸和酵母氨酸濃度升高與患者癥狀的關聯(lián)機制并不明確。截至目前II型高賴氨酸血癥在臨床上尚無有效的治療方法，只能給病人食用不含賴氨酸的食物。

細胞是生命活動的基本結構和功能單位，細胞的生理活動需要能量維持，而生命體的能量主要以三磷酸腺苷(ATP)為載體，而線粒體就是動物細胞合成ATP的主要場所。另外線粒體還是代謝的重要場所，三羧酸循環(huán)、脂肪酸的β-氧化、血紅素的合成以及某些氨基酸的代謝等都在線粒體內(nèi)進行。所以線粒體是一類非常重要的細胞器，也是細胞內(nèi)最豐富的細胞器之一，通常占細胞質容積的20%~25%，其數(shù)目和形態(tài)處于動態(tài)變化中。線粒體的形狀變化很大，有球狀、棒狀、分枝狀等，低倍鏡下呈網(wǎng)狀或線狀。線粒體的分裂和融合對線粒體的形狀以及維持線粒體穩(wěn)態(tài)至關重要，該過程涉及還會許多調控蛋白的參與。目前研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)動蛋白(dynamin)家族控制著線粒體分裂和融合的動態(tài)變化過程。第一個線粒體發(fā)動蛋白Mgm1在酵母中被發(fā)現(xiàn)，定位于線粒體內(nèi)膜，介導線粒體內(nèi)膜的融合。其在人類中的同源蛋白為OPA1，在線蟲的同源蛋白是EAT-3。介導線粒體外膜融合的蛋白首先在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，被命名為fuzzy onions，后來在果蠅中又發(fā)現(xiàn)了一個控制外膜融合的蛋白Marf，而人類中的同源蛋白分別是MFN1和MFN2。但是酵母或線蟲中只發(fā)現(xiàn)了一個同源蛋白Fzo1p或FZO-1。Dnm1是最先在酵母中被發(fā)現(xiàn)的控制線粒體分裂的動力蛋白，其在線蟲和哺乳動物的同源蛋白分別是DRP-1和DRP1。

為尋找新的調控線粒體穩(wěn)態(tài)的因子，來自云南大學楊崇林教授和中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所郭偉翔研究員領導的研究團隊聯(lián)合以秀麗線蟲為模式材料，構建了一個株系，用綠色熒光蛋白標記線蟲表皮細胞內(nèi)的線粒體，從而在熒光顯微鏡下觀察線粒體的形態(tài)。

研究團隊通過EMS誘變進行了正向遺傳學篩選，獲得了一些線粒體形態(tài)發(fā)生改變的突變體株系。其中一類是具有球狀增大線粒體的突變體，被命名為和(圖1)。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，兩個突變體影響的是同一個基因，該基因編碼的蛋白質與人類α-氨基半醛合酶同源，所以將該基因命名為。和兩個突變體中基因發(fā)生了功能缺失突變，而且突變位點都在C端的酵母氨酸脫氫酶(SDH)結構域(圖2)。以從國際線蟲遺傳中心(Genetics Center, CGC)獲得的LKR功能受到影響的線蟲株系()作為對照，該突變體由于基因缺失突變導致AASS-1蛋白中的LKR和SDH功能缺失。用熒光蛋白標記其線粒體發(fā)現(xiàn)，()表皮細胞中的線粒體并不增大。說明只有在SDH功能受損而LKR功能正常的情況下才會造成線粒體球狀增大的表型。

圖1 aass-1基因的兩個功能缺失突變體yq170中表皮細胞內(nèi)的線粒體異常增大

右側為透射電鏡圖。

圖2 線蟲AASS-1蛋白與人類AASS蛋白之間的比對

波浪線表示線粒體定位信號(MTS)。線蟲AASS-1蛋白中的缺失突變和點突變的位置分別由紅線和星號(*)指示。

通過液相色譜-質譜聯(lián)用儀(LC-MS)檢測發(fā)現(xiàn)，()和()突變體的酵母氨酸濃度大概是野生型N2的100倍，賴氨酸濃度是N2的3~4倍。()突變體賴氨酸濃度是N2的5倍，但酵母氨酸濃度比野生型還低。熒光素發(fā)光實驗顯示，相對于野生型線蟲N2，()和()突變體表皮細胞中的ATP含量顯著降低，表明線粒體合成ATP的功能受到影響。而()突變體表皮細胞中的ATP含量基本不變。

為驗證突變體表皮細胞中線粒體增大是由于SDH突變導致的，以及人類AASS蛋白和線蟲AASS-1蛋白功能類似，將人類AASS蛋白的LKR 結構域和SDH結構域分別在線蟲中表達，結果發(fā)現(xiàn)LKR不能回復突變體線粒體增大的表型，而SDH結構域卻可以將增大的線粒體回復到野生型的絲狀或棒狀。

秀麗線蟲在進化上和結構上畢竟距離人類比較遠，研究團隊又通過構建高賴氨酸血癥的小鼠模型做進一步驗證。()純合突變體小鼠的突變位點在LKR結構域，該突變位點就是人I型高賴氨酸血癥的突變位點，()純合突變體小鼠的突變位點在SDH結構域，模擬II型高賴氨酸血癥，該突變位點是()線蟲突變體的突變位點。

LC-MS檢測發(fā)現(xiàn)，()突變體小鼠血漿中的酵母氨酸濃度比野生型小鼠更低，而()突變體小鼠的酵母氨酸濃度是野生型小鼠的100倍以上，這一結果與人類II型高賴氨酸血癥一致。線粒體的氧消耗量是其功能的重要指標，利用seahorse細胞能量代謝分析儀，對小鼠肝臟細胞的氧消耗量進行了檢測，發(fā)現(xiàn)()突變體小鼠的氧消耗量低于野生型小鼠。

II型高賴氨酸血癥會使得病人發(fā)育遲緩和過早死亡，而I型高賴氨酸血癥大部分病人的癥狀并不明顯。而在()突變體小鼠模型中，線粒體內(nèi)酵母氨酸氧化缺陷會造成肝臟內(nèi)線粒體的損傷，并使肝臟重量增加，從而導致小鼠生長遲緩和過早死亡。

為探索II型高賴氨酸血癥的治療策略，利用線蟲()突變體進行了抑制篩選，獲得突變體并克隆了相應基因。研究發(fā)現(xiàn)抑制LRK、抑制向線粒體的賴氨酸或谷氨酸運輸、抑制線粒體谷氨酸脫氫酶或異檸檬酸脫氫酶均可以抑制()突變體中酵母氨酸的產(chǎn)生，從而使線粒體恢復正常。這就為II型高賴氨酸血癥的治療提供了重要的理論依據(jù)和治療思路(圖3)。

我們通過秀麗線蟲和小鼠模型的研究，發(fā)現(xiàn)由于賴氨酸代謝產(chǎn)物酵母氨酸累積，使線粒體增大，破壞了線粒體穩(wěn)態(tài)，影響了線粒體的功能，從而影響了個體的發(fā)育。這就在細胞水平闡明了人類高賴氨酸血癥發(fā)病機理，并為下一步的治療指明了方向。高賴氨酸血癥發(fā)病機理的揭示，很好的體現(xiàn)了利用經(jīng)典模式生物秀麗線蟲進行基礎研究的重要性。通過研究維持線粒體穩(wěn)態(tài)的機制，最終闡明了一種氨基酸代謝缺陷病的發(fā)病機制。

圖3 賴氨酸代謝相關通路以及酵母氨酸累積造成線粒體損傷的機制示意圖

該項研究于2018年12月20日以Article形式在線發(fā)表在細胞生物學著名期刊上(//doi.org/10.1083/jcb.201807204)。云南大學楊崇林教授和中科院遺傳與發(fā)育生物學研究所郭偉翔研究員為該論文的共同通訊作者。楊崇林實驗室周駿翔博士為文章第一作者。楊崇林實驗室的王鑫老師提供了電鏡分析，郭偉翔實驗室的王敏老師和博士后郭野參與了小鼠部分的工作。中科院遺傳與發(fā)育生物學研究所王國棟研究組在代謝組學分析方面、錢文鋒研究組在生物信息方面給予極大幫助。該研究由科技部、國家自然科學基金委以及中科院項目資助。