韓雅楠，蘇慧鋒

（烏海職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化工系，內(nèi)蒙古 烏海 016000）

蜂膠是工蜂從植物體上采集的樹脂和與其上顎腺、蠟腺的分泌物混合而形成的具有粘性、芳香氣味的固體膠狀物質(zhì)[1，2]，其主要化學(xué)成分為黃酮類化合物，其中白楊黃素（chrysin，ChR）在蜂膠中含量較高[3，4]。ChR又稱白楊素、5，7-二羥黃酮，可從多種植物（木蝴蝶、山柏松、芒松）、蜂蜜和蜂膠中提取的一種天然黃酮類化合物，具有抗菌、消炎、降血脂、抗糖尿病、抗氧化和防心腦血管疾病等[5-8]，對腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡等抗腫瘤活性，常以蜂膠提取物形式被添加到食品、藥品和化妝品中，尤其是各種功效型牙膏，用以預(yù)防或減輕牙菌斑、牙齦腫痛、口腔潰瘍和口臭等口腔問題。QB/T 2966-2014《功效型牙膏》和國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告《化妝品功效宣稱評價(jià)指導(dǎo)原則》（征求意見稿）中關(guān)于功效評價(jià)及安全性要求，功效成分應(yīng)進(jìn)行定性或定量檢測。

目前關(guān)于ChR的檢測方法主要為高效液相色譜法（HPLC）[9-14]，該法具有簡便易用、效率高，但易受雜質(zhì)干擾、靈敏度不高，且檢測的ChR對象主要為蜂膠，而關(guān)于蜂膠類牙膏等復(fù)雜基質(zhì)中ChR的檢測報(bào)道較少。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）是將液相色譜儀的高效分離能力與質(zhì)譜儀的強(qiáng)組分鑒定能力結(jié)合，是有效分離分析復(fù)雜混合物的可靠方法，關(guān)于LC-MS/MS法測定ChR的報(bào)道較少[15，16]。本文采用甲醇提取蜂膠類牙膏中ChR，冷凍離心凈化，經(jīng)Diamonsil C18色譜柱分離，質(zhì)譜檢測器檢測，建立LC-MS/MS法測定蜂膠類牙膏中ChR的含量，以期為蜂膠類牙膏中功效成分ChR的定性或定量提供檢測方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑與儀器

ChR （CAS 480-40-0，分子式C15H10O4，分子量254.24，純度99.9%，20 mg），色譜純，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；甲醇、乙腈、丙酮、異丙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、乙酸銨，色譜純，美國TEDIA公司；其余所用試劑均為分析純，上?；瘜W(xué)試劑廠；8種不同品牌的功效型牙膏，購自蘇寧易購網(wǎng)上商城。

Waters ACQUITY UPLC/ Xevo TQ MS型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國Waters公司；CPA324S型電子天平，德國Sartorius公司；SK8300BT型超聲清洗器，上海漢克科學(xué)儀器有限公司；Milli-Q型超純水器，美國Millipore公司；vortex-genie2型渦旋混合器，美國Scientific Industries公司；5427R高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；Syncore Polyvap多樣品平行蒸發(fā)儀，瑞士BUCHI公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取ChR標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10 mg（精確到0.1 mg），置于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容配制成質(zhì)量濃度為1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取ChR標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用乙腈逐級(jí)稀釋得到質(zhì)量濃度依次為5.0，10.0，25.0，50.0和100.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 LC-MS/MS條件

液相色譜條件：色譜柱為Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；流速為0.3 mL/min；流動(dòng)相A為0.2 mmol/L 乙酸銨溶液；流動(dòng)相B為乙腈。梯度洗脫程序：0～5.0 min，20%～80%B；5.0～7.0 min，80%～100% B；7.0～7.1 min，80% B；7.1～10.0 min，80%～20% B。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子化負(fù)離子采集模式（ESI-）；離子源溫度120 ℃；脫溶劑溫度350 ℃；毛細(xì)管電壓3.5 kV；脫溶劑氣為N2，600 L/h；錐孔氣N2，50 L/h；碰撞氣Ar，0.06 mL/min；檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；定性離子對（m/z）為253.2/172.1；定量離子對（m/z）為253.2/120.2；錐孔電壓20 V；碰撞能量25 V。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取蜂膠類牙膏2.0 g（精度0.1 mg），置于50 mL離心管中，加入2 mL飽和氯化鈉溶液，渦旋30 s分散均勻，加入20 mL 甲醇，渦旋30 s分散均勻后超聲提取30 min，10 000 r/min冷凍離心10 min，收集上清液；殘?jiān)?0 mL甲醇再渦旋混勻超聲提取30 min，10 000 r/min離心10 min，合并上清液，45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用1 mL乙腈渦旋溶解后，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，供LC-MS/MS檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用蠕動(dòng)泵以1.0 μL/min的流速將1.0 mg/L ChR標(biāo)準(zhǔn)工作溶液連續(xù)注入ESI離子源中，分別進(jìn)行正負(fù)離子檢測方式對ChR進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析（母離子掃描）；對準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析（子離子掃描）。結(jié)果表明：在負(fù)離子檢測方式下，獲得準(zhǔn)分子離子[M-H]-信號(hào)較強(qiáng)（m/z 253.2），且干擾較小，這可能與ChR分子結(jié)構(gòu)中羥基易失去H有關(guān)；對準(zhǔn)分子離子[M-H]-進(jìn)行子離子掃描，以得到的豐度較大的兩個(gè)碎片離子m/z 172.1和m/z 120.2作為定性離子，以其中豐度較大的碎片離子m/z 120.2作為定量離子（見圖1）。

圖1 ChR的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.1 Secondary mass spectrum of chrysin

2.2 色譜柱的選擇

考察了Waters BEH C18、X Bridge C18、Diamonsil C18、Zorbox SB C18、Shim-pack VP-ODS C18等不同液相色譜柱對蜂膠類牙膏中ChR的分離效果。結(jié)果表明：在相同流動(dòng)相的前提下，采用Diamonsil C18色譜柱能夠提供較好的分離效果，ChR色譜峰峰形對稱，保留時(shí)間5.32 min適中，質(zhì)譜響應(yīng)值較高（見圖2），故選擇Diamonsil C18作為色譜分析柱。

圖2 ChR標(biāo)準(zhǔn)工作溶液總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of chrysin standard solution

2.3 流動(dòng)相的選擇

考察了不同流動(dòng)相體系（甲醇/乙腈-水、甲醇/乙腈-醋酸水溶液、甲醇/乙腈-磷酸緩沖液、甲醇/乙腈-乙酸銨溶液）對目標(biāo)物ChR的分離效果和離子化效率的影響。結(jié)果顯示：乙腈作為有機(jī)相對ChR的分離效果優(yōu)于甲醇；流動(dòng)相體系中酸度越強(qiáng)，采用正離子模式檢測的化合物相應(yīng)越高，采用負(fù)離子模式檢測的化合物相應(yīng)受到抑制。在負(fù)離子檢測方式下，選擇以乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)，ChR出現(xiàn)峰展寬及拖尾現(xiàn)象，這可能是由于ChR結(jié)構(gòu)中2個(gè)羥基與C18色譜柱中的硅羥基發(fā)生弱離子交換作用，從而導(dǎo)致峰展寬及拖尾現(xiàn)象；選擇以乙腈-乙酸銨溶液為流動(dòng)相時(shí)，ChR的分離效果明顯改善，尤其是以乙腈-0.2 mmol/L 乙酸銨為流動(dòng)相對ChR進(jìn)行洗脫，ChR的分離效果良好，色譜峰峰形對稱，且響應(yīng)值較高。故選擇乙腈-0.2 mmol/L 乙酸銨溶液作為流動(dòng)相。

2.4 提取和凈化方式的選擇

考察了甲醇、乙腈、丙酮、異丙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷和正己烷等不同提取溶劑對蜂膠類牙膏中ChR的提取效果及凈化方式的選擇。結(jié)果顯示：ChR可溶于甲醇、乙腈、丙酮、異丙醇和乙酸乙酯中，微溶于二氯甲烷和正己烷；依據(jù)不同提取溶劑對ChR提取回收率高低排序?yàn)椋罕?7.8%）＞甲醇（97.2%）＞乙腈（92.1%）＞異丙醇（86.4%）＞乙酸乙酯（81.3%）＞二氯甲烷（62.8%）＞正己烷（51.3%），其中丙酮對ChR的提取回收率最高，但丙酮萃取液存在部分雜質(zhì)峰或干擾峰；而甲醇對ChR的提取回收率為97.2%，雜質(zhì)峰或干擾峰較少，但提取后存在提取液起泡現(xiàn)象；采用添加飽和氯化鈉溶液可消除提取液起泡現(xiàn)象，且經(jīng)冷凍離心可將提取溶液與蜂膠類牙膏基質(zhì)中碳酸鈣、磷酸氫鈣、二氧化硅等成分有效分離，減少對ChR的干擾。故選擇甲醇作為提取溶劑及冷凍離心凈化方式。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)的考察

為避免蜂膠類牙膏基質(zhì)對LC-MS/MS法測定ChR過程中的影響或干擾，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME），ME=（B/A-1）×100%，式中，A為純乙腈基質(zhì)中ChR的響應(yīng)值，B為空白蜂膠類牙膏基質(zhì)中ChR的響應(yīng)值。當(dāng)ME＞10%，說明存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；當(dāng)-10%＜ME＜10%，說明不存在基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)ME＜-10%時(shí)，說明存在基質(zhì)減弱效應(yīng)。結(jié)果顯示：在純乙腈和空白蜂膠類牙膏中加入5.0，50.0和100.0 μg/L低中高3種質(zhì)量濃度的ChR標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4節(jié)進(jìn)行樣品前處理，經(jīng)LC-MS/MS法測定ChR的ME值分別為-3.8%，-1.7%和1.2%，這說明蜂膠類牙膏基質(zhì)對LC-MS/MS法測定ChR不存在基質(zhì)效應(yīng)。

2.6 線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

用不含待測物的空白基質(zhì)溶液配制一系列ChR標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行LC-MS/MS測定，以ChR質(zhì)譜響應(yīng)值（y）為縱坐標(biāo)，ChR質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；在不含目標(biāo)物的空白基質(zhì)牙膏中添加一系列低質(zhì)量濃度的ChR標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行測定20次，以信噪比S/N=3計(jì)算方法檢出限（LODs），信噪比S/N=10計(jì)算方法定量限（LOQs）。結(jié)果顯示：ChR在5.0～100.0 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=7.04×106x+3.16×105，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999 8；LODs為1.5 μg/kg，LOQ為5.0 μg/kg。

2.7 加標(biāo)回收率和精密度

在3份不同的蜂膠類牙膏樣品中分別添加5.0，50.0和100.0 μg/kg低中高3種濃度水平的ChR標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。從表1中可知，ChR在加標(biāo)濃度5.0～100.0 μg/kg范圍內(nèi)，蜂膠類牙膏中ChR加標(biāo)回收率測定值在86.7%～102.9%，平均回收率在93.0%～100.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.3%～3.4%。

表1 加標(biāo)回收率和精密度（n=6）Tab.1 Recoveries and precision（n=6）

2.8 實(shí)際樣品的測定

針對隨即選購的8份不同品牌蜂膠類牙膏（新西蘭Red seal紅印蜂膠牙膏、德國Paul-dent寶兒德蜂膠牙膏、澳大利亞Healthy Care蜂膠牙膏、紐西小精靈蜂膠薄荷牙膏、高露潔蜂膠舒齦牙膏、納諾神蜂蜂膠功效抑菌皓白牙膏、皓藍(lán)蜂膠茶潔牙膏和CEDEL時(shí)達(dá)樂蜂膠牙膏）按本文所建LC-MS/MS法測定蜂膠類牙膏中ChR的含量。結(jié)果顯示：8份受檢蜂膠類牙膏中，7份樣品檢出含有ChR （見圖3），ChR檢出率共計(jì)87.5%；檢出ChR的蜂膠類牙膏產(chǎn)品成分中均注明含有蜂膠提取物，功效主要為：清新口氣、多重功效、牙齦護(hù)理、抗敏感，部分產(chǎn)品外包裝上印有蜂巢圖案，這說明所檢市售蜂膠類牙膏中大部分生產(chǎn)商都通過添加蜂膠提取物來添加ChR，以達(dá)到清新口氣、多重功效，符合QB/T 2966-2014《功效型牙膏》中功效型牙膏中添加的功效成分應(yīng)進(jìn)行定性或定量測定的要求。

圖3 實(shí)際樣品總離子流圖Fig.3 Total ion chromatograms of actual samples

2.9 與現(xiàn)有檢測方法的比較

從線性范圍、加標(biāo)回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）、檢出限和定量限等方法學(xué)參數(shù)，將本文所建LC-MS/MS法與現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)、科學(xué)文獻(xiàn)等報(bào)道的檢測方法進(jìn)行比較，結(jié)果見表2。從表2中可知，現(xiàn)有檢測ChR的方法均具有較高的加標(biāo)回收率和RSD；與HPLC法相比，質(zhì)譜法（LC-MS或LC-MS/MS）的靈敏度更高；本文所建LC-MS/MS法具有加標(biāo)回收率高、檢出限低、精密度好等特點(diǎn)。

表2 不同檢測方法的比較Tab.2 Comparison of different analysis methods

3 結(jié)論

建立了LC-MS/MS法測定蜂膠類牙膏中ChR含量的方法。結(jié)果表明，ChR在5.0～100.0 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999 8；LODs為1.5 μg/kg，LOQ為5.0 μg/kg；平均加標(biāo)回收率在93.0%～100.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.3%～3.4%。該法靈敏度高、準(zhǔn)確度高、操作簡便，可為功效型牙膏生產(chǎn)企業(yè)及其行政監(jiān)管部門提供ChR檢測方法。