李 霞, 劉 旭, 李 玲, 王艷麗, 田其燕, 劉艷明*

(1. 山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院, 山東 濟(jì)南 250000; 2. 山東省環(huán)境執(zhí)法局, 山東 濟(jì)南 250000)

丙酸及其鹽類是國(guó)內(nèi)外食品加工中常用的防腐劑之一。應(yīng)用于食品中的丙酸鹽主要有丙酸鈣和丙酸鈉[1]。由其于優(yōu)良的防霉性能,我國(guó)國(guó)標(biāo)[2]規(guī)定丙酸及其鹽類可作為防腐劑,用于面包、糕點(diǎn)、醬油、醋等食品中。丙酸及其鹽類具有輕微的丙酸味,對(duì)熱和光穩(wěn)定,有吸濕性,可溶于水,微溶于甲醇和乙醇,不溶于苯及丙酮。在酸性條件下,產(chǎn)生游離丙酸,對(duì)霉菌、枯草桿菌、馬鈴薯?xiàng)U菌等的生長(zhǎng)有抑制作用,有廣泛的抗菌作用。根據(jù)我國(guó)國(guó)標(biāo)[2]規(guī)定,丙酸及其鈉鹽、鈣鹽(以丙酸計(jì))在原糧中的限量為1.80 g/kg,在生濕面制品中的限量為0.25 g/kg,在豆類制品、面包、糕點(diǎn)、醋和醬油中的限量為2.50 g/kg。

目前測(cè)定食品中丙酸及其鹽類的方法主要有離子色譜法[3]、氣相色譜法[4-8]、液相色譜法[9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10]等?，F(xiàn)有國(guó)標(biāo)[11]及大部分文獻(xiàn)[12-16]方法主要是通過(guò)水蒸氣蒸餾提取樣品中的丙酸再進(jìn)行測(cè)定,前處理比較繁瑣,在樣品量大的情況下效率較低,給食品檢驗(yàn)帶來(lái)困難。有文獻(xiàn)[17]報(bào)道,樣品經(jīng)酸化后提取丙酸,經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定,沒(méi)有去除樣品中的油脂,不但污染了儀器和色譜柱,而且氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)儀器成本較高,無(wú)法滿足部分檢測(cè)機(jī)構(gòu)的要求。本方法根據(jù)丙酸的化學(xué)性質(zhì)和所檢測(cè)樣品的不同,采用不同的提取方法。對(duì)含油脂少或不含油脂的樣品(醬油、醋、豆腐乳、豆?jié){)采用直接提取法,對(duì)提取溶液pH值等條件進(jìn)行了考察;對(duì)含油脂多的樣品(桃酥、餅干、面包、月餅、元宵等)采用脫脂提取法,對(duì)丙酸進(jìn)行pH溶解性的考察,pH≤2時(shí),丙酸在正己烷中溶解性最小,丙酸提取率達(dá)到最大值。本方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏度好、準(zhǔn)確度高,可以滿足檢測(cè)的要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

Agilent 7890型氣相色譜儀,配有電子捕獲檢測(cè)器(FID)(美國(guó)Agilent公司);感量0.01 g和0.000 1 g的天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司); MS 3basic渦旋儀(德國(guó)IKA公司);SIGMA 3-18K離心機(jī)(德國(guó)SIGMA公司)。標(biāo)準(zhǔn)品:丙酸(分析純,德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司);鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉(均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);正己烷、乙酸乙酯(均為色譜純,美國(guó)Fisher公司);水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。

1.2 色譜條件

色譜柱:HP-INNOWAX石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),載氣為高純氮?dú)?純度≥99.999%);進(jìn)樣量為1 μL;進(jìn)樣方式:分流進(jìn)樣(分流比為10∶1);恒流模式:載氣流速為1 mL/min;氫氣流速:30 mL/min;空氣流速:400 mL/min;進(jìn)樣口溫度:250 ℃;檢測(cè)器溫度:300 ℃。柱溫采用程序升溫程序:100 ℃保持2 min,以20 ℃/min的速度升至240 ℃,保持10 min。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:準(zhǔn)確稱取0.250 0 g丙酸標(biāo)準(zhǔn)品,用乙酸乙酯溶解并定容至25 mL,配制成質(zhì)量濃度為10 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于4 ℃冰箱中保存,有效期為6個(gè)月。

標(biāo)準(zhǔn)工作液:取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中,用乙酸乙酯配制成質(zhì)量濃度為2.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液,再用乙酸乙酯逐級(jí)稀釋成2、10、50、200、500和1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液。于4 ℃冰箱中保存,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 樣品的制備

固體樣品經(jīng)組織搗碎機(jī)搗碎混勻后備用。

1.5 樣品處理

1.5.1脫脂提取法

脫脂提取法適用于桃酥、餅干、面包、月餅、元宵等。稱取2.00 g樣品,加入10 mL水和1 mL 50%(體積分?jǐn)?shù))鹽酸-水溶液,渦旋2 min。加入5.0 mL正己烷和2 g氯化鈉,渦旋2 min,以8 000 r/min的速度離心5 min,棄去上清液。下層加入5 mL乙酸乙酯,渦旋2 min。以8 000 r/min的速度離心5 min,取上清液于10 mL容量瓶中,殘?jiān)偌尤? mL乙酸乙酯提取一次,合并兩次提取液,搖勻。取2 mL溶液于15 mL離心管中,加入0.5 g無(wú)水硫酸鈉,渦旋2 min,取上清液供GC測(cè)定。

1.5.2直接提取法

直接提取法適用于醬油、醋、豆腐乳、豆?jié){等。稱取2.00 g樣品,加入1 mL 50%(體積分?jǐn)?shù))鹽酸-水溶液,渦旋2 min,加入5 mL乙酸乙酯,渦旋2 min,以8 000 r/min的速度離心5 min,取上清液置于10 mL容量瓶中。向殘?jiān)屑尤? mL乙酸乙酯，按前述方法再提取一次,合并兩次提取液,搖勻。取2 mL溶液于15 mL離心管,加入0.5 g無(wú)水硫酸鈉,渦旋2 min,取上清液供GC測(cè)定。

圖 1 標(biāo)準(zhǔn)溶液、面包和豆腐乳中丙酸的氣相色譜圖Fig. 1 Gas chromatograms of propionic acid in standard solution, bread and bean curd

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的優(yōu)化

丙酸是有機(jī)酸,屬于極性物質(zhì)。選擇不同極性的色譜柱:HP-5色譜柱(弱極性)、DB-1701色譜柱(中等極性)和HP-INNOWAX色譜柱(強(qiáng)極性),在相同進(jìn)樣和分析條件下,對(duì)同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,弱極性的色譜柱響應(yīng)值低,其分離效果遠(yuǎn)不及強(qiáng)極性色譜柱,所以選用強(qiáng)極性的HP-INNOWAX色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)溶液、面包和豆腐乳中丙酸的色譜圖見(jiàn)圖1,丙酸的出峰時(shí)間為5.332 min。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1pH值

丙酸的pKa值為4.873 2,不同的pH值條件下,丙酸在水和有機(jī)溶劑中的溶解性不同。為了提高方法的加標(biāo)回收率,本文分別對(duì)脫脂提取法和直接提取法中的pH值進(jìn)行了優(yōu)化。

首先考察了脫脂提取法中不同pH值條件下丙酸在正己烷(脫脂溶劑)和乙酸乙酯(提取溶劑)中的提取率。用1 mL正己烷和1 mL乙酸乙酯分別提取1 mL不同pH值(1、2、3、5、7、9、11和13)的丙酸加標(biāo)水溶液,以pH值為橫坐標(biāo),以丙酸百分含量為縱坐標(biāo)作圖,如圖2所示,當(dāng)pH小于7時(shí),隨著pH值降低,丙酸在正己烷中溶解性降低,在乙酸乙酯中溶解性增大,因此pH值減小既可以減小在脫脂溶劑中的損失又可以提高提取溶劑的提取率。當(dāng)pH大于7時(shí),丙酸轉(zhuǎn)化為丙酸鹽溶解于水中,在正己烷和乙酸乙酯中溶解性降低,最后在強(qiáng)堿條件(pH≥11)下無(wú)法檢測(cè)。

圖 2 pH值對(duì)正己烷和乙酸乙酯提取率的影響(n=3)Fig. 2 Effects of pH values on the extraction rates of n-hexane and ethyl acetate (n=3)

圖 3 脫脂提取法中pH值對(duì)加標(biāo)回收率的影響(n=3)Fig. 3 Effects of pH values on the spiked recoveries by the degrease extraction method (n=3)

在上述研究的基礎(chǔ)上,考察了樣品溶液pH值對(duì)脫脂提取法的加標(biāo)回收率的影響。樣品加標(biāo)水平為0.01、0.10和2.5 g/kg, pH值分別為1、2、3、5和7,采用1.5.1節(jié)方法進(jìn)行前處理。結(jié)果如圖3所示,pH值等于1和2時(shí)的加標(biāo)回收率可達(dá)到92%以上,pH等于3時(shí)加標(biāo)回收率有所下降,pH等于5～7時(shí)加標(biāo)回收率明顯下降,因此最佳pH條件為pH≤2。對(duì)50%(體積分?jǐn)?shù))鹽酸-水溶液的體積進(jìn)行考察,結(jié)果發(fā)現(xiàn),加入50%(體積分?jǐn)?shù))鹽酸-水溶液體積為1 mL時(shí),樣品的pH≤2,可滿足實(shí)驗(yàn)要求。

對(duì)于不含油脂的樣品(醬油、醋、豆腐乳、豆?jié){)采用直接提取法?；谏衔囊宜嵋阴ヌ崛÷实难芯?考察了直接提取法中樣品溶液pH值對(duì)加標(biāo)回收率的影響,前處理方法同1.5.2節(jié)。如圖4所示,pH值對(duì)加標(biāo)回收率有明顯影響,pH等于1和2時(shí)的加標(biāo)回收率可達(dá)到93%以上,pH等于3時(shí)加標(biāo)回收率有所下降,pH等于5和7時(shí)丙酸加標(biāo)回收率明顯下降,因此直接提取法中樣品溶液最佳pH條件為pH≤2。加入50%(體積分?jǐn)?shù))鹽酸-水溶液體積為1 mL時(shí),樣品的pH≤2,可滿足實(shí)驗(yàn)要求。

圖 4 直接提取法中pH值對(duì)加標(biāo)回收率的影響(n=3)Fig. 4 Effects of pH values on the spiked recoveries by the direct extraction method (n=3)

2.2.2脫脂溶劑

糕點(diǎn)、月餅等食品中的脂肪含量較高,樣品經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑提取后,大部分脂肪被提取出來(lái)。脫脂提取法對(duì)樣品中脂肪的去除是前處理過(guò)程中非常重要的步驟。本文考察了正己烷、石油醚和環(huán)己烷3種溶劑對(duì)脫脂凈化效果的影響。結(jié)果顯示,使用3種脫脂溶劑都能達(dá)到很好的凈化效果,經(jīng)脫脂溶劑凈化后,樣品溶液變?yōu)闊o(wú)色透明。綜合考慮脫脂溶劑的毒性和使用成本,本文采用正己烷作為脫脂溶劑。脫脂提取法雖然增加了提取步驟,但其很大程度上凈化了基質(zhì),提高了方法的選擇性。

2.2.3提取溶劑和提取次數(shù)

對(duì)比了3種溶劑(乙醚、乙酸乙酯和石油醚)的提取效果。結(jié)果表明,3種溶劑提取效率相差不大,但是石油醚和乙醚提取溶液時(shí)雜質(zhì)峰相對(duì)較多,且乙醚和石油醚易揮發(fā),因此本研究選用乙酸乙酯作為提取溶劑。

為進(jìn)一步提高提取效率,對(duì)乙酸乙酯的提取次數(shù)進(jìn)行考察,樣品加標(biāo)水平設(shè)置為0.05 g/kg,每次乙酸乙酯提取體積為5.0 mL、提取次數(shù)分別為1、2、3次。結(jié)果如表1所示,隨著提取次數(shù)的增加,提取效率增加,提取次數(shù)為2和3時(shí)結(jié)果相差不大。同時(shí)考察了用10 ml乙酸乙酯提取1次的提取效率,結(jié)果顯示加標(biāo)回收率低于80%,綜合考慮溶劑用量和提取效率,確定乙酸乙酯提取體積為5 ml,提取次數(shù)為2次。

表 1 提取次數(shù)對(duì)加標(biāo)回收率的影響

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1線性范圍、檢出限與定量線

取系列標(biāo)準(zhǔn)工作液,按優(yōu)化的條件進(jìn)樣,以丙酸的峰面積為縱坐標(biāo)(y)、質(zhì)量濃度(x, mg/L)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示,丙酸在2～1 000 mg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性方程為y=0.807x+0.480,相關(guān)系數(shù)R=0.999 8。采用空白樣品中添加目標(biāo)物的方法,以3倍和10倍信噪比(S/N)分別計(jì)算方法的檢出限(LOD)和定量線(LOQ),丙酸的LOD為0.003 g/kg, LOQ為0.01 g/kg。

2.3.2方法的回收率與精密度

按照1.5節(jié)和1.2節(jié)的方法分析檢測(cè)9種陰性樣品,加標(biāo)水平分別為0.01、0.10和2.50 g/kg,每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)試6次。由表2和表3可知,脫脂提取法中丙酸的回收率為87.5%～97.6%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.09%～6.86%;直接提取法中丙酸的平均回收率為90.1%～102.1%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.32%～6.33%。

表 2 桃酥、餅干、面包、月餅和元宵樣品丙酸的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

表 3 醬油、醋、豆?jié){和豆腐乳樣品中的加標(biāo)回收率和

2.4 方法對(duì)比

2.4.1與國(guó)標(biāo)方法的對(duì)比

如表4所示，取醬油、醋、面包和豆腐乳4種樣品,采用本方法和GB 5009.120-2016中水蒸氣蒸餾法對(duì)樣品中丙酸的測(cè)定值和加標(biāo)回收率進(jìn)行比較。本方法加標(biāo)回收率在95%以上,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%,而國(guó)標(biāo)蒸餾法的回收率多在90%左右。同時(shí)本方法快捷方便,可操縱性強(qiáng),適用于大批量操作,并提高了方法的準(zhǔn)確度和靈敏度。

表 4 GB 5009.120-2016(GB)與本方法在檢測(cè)實(shí)際樣品中丙酸結(jié)果的比較

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2.4.2與文獻(xiàn)方法的對(duì)比

將本方法與文獻(xiàn)[4,17-20]方法進(jìn)行比較,結(jié)果見(jiàn)表5。本方法針對(duì)含油脂和不含油脂的食品,分別建立了脫脂提取法和直接提取法,樣品用量少,操作簡(jiǎn)單,適用于食品中丙酸及其丙酸鹽的測(cè)定。

表 5 本方法與文獻(xiàn)報(bào)道的方法中提取方法、樣品用量、pH、加標(biāo)回收率和檢出限的比較

3 結(jié)論

建立了氣相色譜測(cè)定食品中丙酸的方法,針對(duì)含油脂和不含油脂的食品,分別建立了前處理方法。本方法提高了丙酸的提取和檢測(cè)效率,方法簡(jiǎn)便、快速、可靠,可用于食品中丙酸含量的測(cè)定。