王智聰, 傅榮杰, 吉建國, 陳 波

(安捷倫科技(上海)有限公司, 上海 200131)

中藥化學成分是中藥藥效的物質(zhì)基礎(chǔ),中藥化學成分分析是中藥藥效物質(zhì)闡明及質(zhì)量控制的關(guān)鍵。中藥化學成分復雜,傳統(tǒng)的一維色譜法往往不能提供足夠的分辨率和峰容量,色譜峰重疊現(xiàn)象嚴重,而二維液相色譜法具有分離效果好和峰容量高等特點,已廣泛用于復雜基質(zhì)樣品中目標組分或全組分的分析[1-4]?；谌S液相色譜法無樣品信息丟失、峰容量高的特點,全二維液相色譜法常用于中藥化學成分的解析,如指紋譜圖分析、中藥物質(zhì)基礎(chǔ)表征、活性成分篩選或痕量雜質(zhì)篩查等[5,6];基于中心切割二維液相色譜法靈活的切割方式,常用于特定目標組分的分離分析等[7,8]。傳統(tǒng)的中心切割二維液相色譜法采用大體積樣品環(huán),收集并儲存第一維目標組分,可能會造成第二維色譜柱的嚴重過載,導致色譜峰變形、展寬等,也會出現(xiàn)切割體積超過樣品環(huán)體積的情況,造成色譜峰丟失,從而影響準確定量;如果采用捕集柱進行捕集,需要考察捕集柱的捕集能力,溶劑效應可能會影響第二維液相色譜的分離,甚至發(fā)生切割組分在捕集柱中不保留等情況[9]。Giddings[10,11]指出,二維液相色譜法中各組分間的分離效率不應受后續(xù)分離的影響,而傳統(tǒng)的以大體積樣品環(huán)或捕集柱為接口的二維液相色譜,即使切割組分在第一維已經(jīng)取得較小的分離度,由于在大體積樣品環(huán)或捕集柱接口重新混合,降低了二維系統(tǒng)的整體分離度。

金銀花具有清熱解毒、疏散分熱等功效?！吨袊幍洹?2015版)一部收錄金銀花,在“含量測定”項下,對綠原酸和木犀草苷的含量測定分別采用不同的高效液相色譜方法[12]。金銀花化學成分復雜,基質(zhì)可能干擾目標組分的測定,尤其是共洗脫組分會對目標化合物的定性和定量造成影響;使用二維液相色譜法可以檢驗色譜峰純度,揭示一維分離中可能與目標組分共洗脫的隱藏峰[13,14]。

本文利用高分辨采樣二維液相色譜法(HiRes 2D-LC),結(jié)合全二維液相色譜法連續(xù)切割和中心切割二維液相色譜法多次切割的特點[15],對金銀花樣品第一維分析的綠原酸和木犀草苷進行多次高分辨采樣,利用多組小體積樣品環(huán)不間斷收集第一維的目標峰,并對第一維的多個目標組分進行“整峰”切割,在第二維實現(xiàn)了目標組分與雜質(zhì)的分離,為目標峰純度的確認奠定基礎(chǔ);目標組分在切割、轉(zhuǎn)移過程中也沒有損失,基于高分辨采樣的定量基礎(chǔ)也更為可信和可靠。相對于全二維液相色譜中樣品“全信息”的展示,高分辨采樣二維液相色譜法是將第一維分離的部分組分引入第二維,具有較強的針對性,對于中藥特定組分的分離確認、準確定量具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

二維液相色譜系統(tǒng)(1290 Infinity II,美國Agilent公司),包括高速泵(二元泵,G7120A)、全能泵(四元泵,G7104A)、自動進樣器(G7167B)、柱溫箱(G7116B)、二極管陣列檢測器(G7117B)、閥驅(qū)(G1170A)、二維接口閥(G4243A)、多中心切割閥(G4242A)、色譜工作站(OpenLAB CDS ChemStation Edition C01.08)和二維色譜軟件(2D-LC Software A.01.04 SR1)等。

甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、磷酸(分析純)和乙酸(分析純)(德國Merck公司);綠原酸和木犀草苷對照品(純度>98%，上海詩丹德公司);超純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備;金銀花樣品購自當?shù)厮幍辍?/p>

1.2 標準溶液的配制

稱取適量綠原酸和木犀草苷對照品,分別加入適量50%(v/v)甲醇水溶液超聲溶解,分別配制成質(zhì)量濃度為2.0 g/L和1.0 g/L的綠原酸和木犀草苷標準儲備液;取適量綠原酸和木犀草苷標準儲備液,加入50%(v/v)甲醇水溶液稀釋,配制成系列混合標準工作液,綠原酸的質(zhì)量濃度分別為1 000、500、250、100、50、25、10和5 mg/L,木犀草苷的質(zhì)量濃度分別為100、50、25、10、5.0、2.5、1.0和0.5 mg/L。

1.3 樣品前處理

取金銀花樣品適量,粉碎,過四號篩;取篩下物約2 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,加入50 mL 50%(v/v)甲醇水溶液,稱定重量,超聲處理30 min,放冷,再稱定重量,用50%(v/v)甲醇水溶液補足減失的重量,搖勻,過濾,精密量取濾液5 mL,置于25 mL棕色量瓶中,加入50%(v/v)甲醇水溶液至刻度,搖勻,待測。

1.4 色譜條件

1.4.1第一維液相色譜

色譜柱:ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm,美國Agilent公司);柱溫:35 ℃;自動進樣器溫度:15 ℃;流動相A: 0.4%(v/v)磷酸水溶液;流動相B:乙腈;流速:0.2 mL/min。梯度洗脫程序:0～1.0 min, 8%B; 1.0～5.0 min, 8%B～14%B; 5.0～6.0 min, 14%B～20%B; 6.0～12.0 min, 20%B～24%B; 12.0～13.0 min, 24%B～95%B; 13.0～18.0 min, 95%B; 18.0～18.1 min, 95%B～8%B; 18.1～23.5 min, 8%B。進樣量:2 μL。

圖 1 高分辨采樣二維液相色譜儀的接口示意圖Fig. 1 Interface diagram of high resolution sampling two-dimensional liquid chromatography (HiRes 2D-LC) a. the first dimension (1D) heat cut through Deck A (multiple heart-cutting valve A capillaries), the second dimension (2D) separation through Deck B ; b. 1D heat cut through Deck B, 2D separation through Deck A; ASM: active solvent modulator.

1.4.2第二維液相色譜

色譜柱:ZORBAX RRHD SB-Phenyl柱(50 mm×3.0 mm, 1.8 μm,美國Agilent公司);柱溫:35 ℃;流動相A: 0.5%(v/v)乙酸水溶液;流動相B:乙腈;流速:1.8 mL/min。梯度洗脫:0～1.0 min, 10%B～30%B; 1.0～1.1 min, 30%B～10%B。第二維梯度停止時間(2D gradient stop time): 1.1 min;第二維循環(huán)時間(2D cycle time): 1.5 min;檢測波長:350 nm;數(shù)據(jù)采集頻率:40 Hz。

二維色譜采樣模式:高分辨采樣。綠原酸:目標峰切割開始時間6.02 min;采樣時間6 s;切割次數(shù)5次。木犀草苷:目標峰切割開始時間10.50 min;采樣時間4 s;切割次數(shù)4次。

2 結(jié)果與討論

2.1 二維液相色譜儀的接口

二維液相色譜儀的接口可采用二位八通閥或二位十通閥,并配置兩支樣品環(huán),交替儲存、分析第一維切割的組分;二位八通閥的連接流路比較簡單,但其中一個樣品環(huán)的收集和洗脫會出現(xiàn)不同方向的情況;二位十通閥可以保證兩個樣品環(huán)收集和洗脫方向相同,但收集和洗脫的流路長短不一致,上述兩種接口均因流路不對稱對二維液相色譜方法的建立和優(yōu)化有較高要求[16]。Talus等[17]采用二位十通閥接口,發(fā)現(xiàn)不對稱的流路易造成第二維壓力變化較大,顯著影響二維分析結(jié)果及第二維色譜柱的使用壽命。近期發(fā)展的二位四通雙流路閥可以實現(xiàn)流路的完全對稱,減小閥切換時系統(tǒng)壓力的變化,進一步簡化了二維液相色譜方法的建立和運用。本文采用五位十通閥作為二維接口,如圖1所示,該閥在實現(xiàn)一維與二維切割組分轉(zhuǎn)移的同時,還可以進行“在線稀釋”,即在不增加第三路稀釋溶劑(或泵)的情況下,在線使用第二維溶劑對切割組分進行稀釋,從而減小或消除溶劑效應[18,19];其中“在線稀釋”的功能可以打開或關(guān)閉，如圖1所示，ASM中毛細管 6-9 處于旁路位置，“在線稀釋”處于“關(guān)閉”狀態(tài)，此時該閥相當于常規(guī)的二位四通雙流路閥。

傳統(tǒng)的二位八通閥或二位十通閥二維接口配置2支樣品環(huán),高分辨采樣二維液相色譜儀采用具有在線溶劑稀釋功能的ASM閥作為二維接口,并且將傳統(tǒng)的2支樣品環(huán)采用多中心切割閥代替,如圖1所示,兩個多中心切割閥的樣品環(huán)組件Deck A和Deck B,每個Deck可配置6支樣品環(huán),這樣高分辨采樣二維液相色譜的接口可擴展至12支樣品環(huán)。如圖1a所示,第一維目標組分依次儲存于Deck A的樣品環(huán)中,然后閥切換至圖1b所示,第一維目標組分繼續(xù)依次儲存于Deck B的樣品環(huán)中;與此同時,第二維流動相將儲存于Deck B或Deck A樣品環(huán)中的切割組分依次導入第二維色譜柱進行分析。

2.2 金銀花樣品的一維液相色譜分析

在《中國藥典》方法[12]的基礎(chǔ)上,本文采用HiRes 2D-LC對金銀花樣品中的綠原酸和木犀草苷組分進行峰純度確認和含量測定。第一維采用C18色譜柱,金銀花樣品的一維液相色譜圖見圖2。

圖 2 金銀花樣品的第一維液相色譜圖Fig. 2 1D LC chromatograms of Lonicerae Japonica FlosYellow parts were for 1D multiple target heart cuts.

2.3 標準品的二維液相色譜分析

按1.4節(jié)色譜條件,對綠原酸和木犀草苷標準品進行二維液相色譜分析(見圖3),其中圖3a為綠原酸5個切割片段疊加的色譜圖,圖3b為木犀草苷4個切割片段疊加的色譜圖。

圖 3 (a)綠原酸和(b)木犀草苷標準品的第二維疊加色譜圖Fig. 3 2D overlay chromatograms of (a) chlorogenic acid and cynaroside standard samples

高分辨采樣二維液相色譜法可以對第一維的目標組分或多個目標組分進行切割,每個組分可進行一次或多次連續(xù)切割;高分辨采樣模式是基于時間觸發(fā)的切割方式,在二維方法設(shè)置中,對各組分設(shè)置切割開始時間、采樣持續(xù)時間和切割次數(shù)等。本文對綠原酸的色譜峰進行5次切割,每次切割采樣持續(xù)時間6 s,對木犀草苷的峰進行4次切割,每次切割采樣持續(xù)時間4 s。第一維的流速為0.2 mL/min,每次切割體積為20 μL,多中心切割閥配置的樣品環(huán)體積為40 μL;對綠原酸和木犀草苷來說,切割體積分別約占樣品環(huán)體積的50%和33%。

2.4 金銀花樣品的二維液相色譜分析

金銀花樣品的二維色譜圖如圖4所示,從圖4a可以看出,綠原酸的5個切割組分在第二維色譜中均未檢出其他雜峰,說明在第一維分離中,綠原酸與雜質(zhì)分離良好,無共洗脫峰或隱藏峰;從圖4b可以看出,通過第二維色譜分離,在木犀草苷的第2和第3個切割組分中均顯示有雜質(zhì)。高分辨采樣二維液相色譜法通過第二維不同分離機理或不同選擇性色譜柱的進一步分離,提高了目標峰與雜質(zhì)的分離度,可用于色譜峰純度的確認，或檢查目標峰是否包含隱藏的共洗脫雜質(zhì)。

圖 4 金銀花樣品中(a)綠原酸和(b)木犀草苷的 第二維疊加色譜圖Fig. 4 2D overlay chromatograms of (a) chlorogenic acid and (b) cynaroside in Lonicerae Japonica Flos

高分辨采樣二維液相色譜法使用連續(xù)切割的特點,可以控制目標組分的切割窗口,對某一個或多個目標組分實現(xiàn)片段式“整峰”切割,從而為實現(xiàn)目標峰的準確定量提供技術(shù)基礎(chǔ)。對系列混合標準工作液進行二維液相色譜分析,結(jié)果顯示,在5～1 000 mg/L范圍內(nèi),綠原酸的線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r)為1.000 00;在0.5～100 mg/L范圍內(nèi),木犀草苷的線性關(guān)系良好,r為0.999 97。

2.5 加標回收率的考察

進行了兩個水平的基質(zhì)加標回收試驗的考察,每個水平平行制備3份,分析結(jié)果見表1。在低濃度和高濃度加標水平下,綠原酸和木犀草苷的平均加標回收率為94.0%～101.6%,相對標準偏差(RSD)小于3.3%,說明高分辨采樣二維液相色譜法定量準確。

表 1 綠原酸和木犀草苷的加標回收率和相對標準偏差(n=3)

2.6 重復性考察

按1.3節(jié)樣品前處理方法制備金銀花樣品提取液,按照1.4節(jié)二維液相色譜條件進行分析,重復分析6次,第二維連續(xù)色譜圖的疊加圖如圖5所示,綠原酸和木犀草苷保留時間的RSD分別為1.2%和0.6%,峰面積的RSD分別為0.4%和4.3%,說明高分辨采樣二維液相色譜法具有優(yōu)異的重復性。

圖 5 金銀花樣品連續(xù)6次進樣的第二維疊加色譜圖Fig. 5 2D overlay chromatogram of Lonicerae Japonica Flos for the six replicates of consecutive Nos. 1-5: chlorogenic acid cuts; Nos. 6-9: cynaroside cuts; F: loop flush.

2.7 實際樣品測定

按1.3節(jié)樣品前處理方法制備金銀花樣品提取液,按照1.4節(jié)二維液相色譜條件進行分析,樣品測試液中綠原酸和木犀草苷的質(zhì)量濃度分別為257.3 mg/L和5.9 mg/L,換算為金銀花樣品中綠原酸和木犀草苷的質(zhì)量分數(shù)分別為3.2%和0.077%, 《中國藥典》(2015版)[12]中規(guī)定綠原酸和木犀草苷的量分別不得少于1.5%和0.050%,測試樣品中指標成分滿足其要求。

3 結(jié)論

本文使用高分辨采樣二維液相色譜法對金銀花中綠原酸和木犀草苷進行分析。高分辨采樣二維液相色譜法可以實現(xiàn)目標組分的峰純度確認和準確定量分析,該技術(shù)可用于中藥的質(zhì)量控制,以及食品、制藥、生物、環(huán)境等領(lǐng)域復雜基質(zhì)樣品的分析。