龍 珍, 衛(wèi) 辰, 郭志謀, 馬 霄, 李月琪, 姚勁挺, 冀 峰, 李長坤, 黃濤宏

(1. 島津企業(yè)管理(中國)有限公司, 北京 100020; 2. 中國食品藥品檢定研究院, 衛(wèi)生部生物技術產(chǎn)品檢定方法及其標準化重點實驗室, 北京 102629; 3. 中國科學院分離分析化學重點實驗室, 中國科學院大連化學物理研究所, 遼寧 大連 116023)

百白破(DTP)疫苗由百日咳疫苗、白喉疫苗和破傷風疫苗聯(lián)合組成,是全球范圍內(nèi)應用最廣的疫苗之一,同時也是報道不良反應次數(shù)最多的疫苗。2015年,百白破疫苗不良反應約占中國疫苗不良反應的三分之一[1]。百日咳桿菌氣管細胞毒素(TCT)最早由Goldman等[2]從百日咳桿菌培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn),它的存在被認為是導致百日咳和百白破疫苗不良反應的原因之一。在呼吸道上皮細胞培養(yǎng)實驗中發(fā)現(xiàn),濃度為1 μmol/L的TCT即可摧毀纖毛細胞群[2]。當纖毛細胞被破壞以后可以產(chǎn)生類似百日咳的癥狀,如咳嗽甚至肺部感染[3]。由于TCT的高活性和破壞力,各國藥典均對百日咳疫苗中TCT的最高含量做出了限定,即不得超過2 pmol/劑。按照通常百白破疫苗的體積(0.5 mL)計算,TCT在成品中不得超過4 nmol/L。

盡管各國藥典均對TCT的含量做出了限定,但由于無商品化TCT對照品、TCT對照品制備困難和缺乏高靈敏度、高選擇性的TCT檢測方法等原因,目前各國藥典均無TCT的檢測方法記載。TCT無強紫外吸收基團且易受疫苗基質干擾,即使采用低波長檢測,仍然無法實現(xiàn)復雜疫苗基質中TCT的高靈敏度準確檢測。例如,以204 nm為檢測波長,進樣10 μL濃度為4 nmol/L的TCT對照品,無明顯紫外吸收峰檢出。Goldman等[4]將柱前衍生-HPLC-UV方法用于疫苗中TCT的含量測定,該方法在進樣200 μL時,可實現(xiàn)濃度為5 nmol/L TCT的檢測,該方法靈敏度與藥典要求尚存在一定差距,且方法耗時較長(45 min)。此外,衍生效率受基質和衍生試劑干擾,從而影響定量的準確性、重復性和再現(xiàn)性[3],不能實現(xiàn)疫苗中TCT的高靈敏度、高選擇性、高準確度檢測,且定量所需消耗的對照品質量較多,增加了TCT對照品制備的工作量。通用型檢測器為紫外檢測器的有利補充,無需衍生即可實現(xiàn)弱紫外吸收和無紫外吸收化合物的檢測[5-8]。但通用型檢測器的靈敏度通常在mg/L級別,無法滿足各國藥典對TCT含量檢測的限量要求。更重要的是,無論是紫外檢測器還是通用型檢測器均需要對照品,通過對比樣品和對照品保留時間定性。目前尚無商品化的TCT對照品,且TCT對照品的制備復雜。通過48 h培養(yǎng)、純化1 L TCT培養(yǎng)液最多只能制備得到700 nmol的TCT對照品[2]。

為了實現(xiàn)疫苗中TCT的有效定性和定量分析,需要發(fā)展一種無須衍生、靈敏度好、選擇性較高、適合百日咳和百白破疫苗中TCT的快速檢測的方法。本文發(fā)展了一種親水作用色譜(HILIC)-MS/MS方法用于百日咳和百白破疫苗中TCT的定性和定量分析。從百日咳桿菌培養(yǎng)液中純化得到TCT樣品后,通過LC-離子阱飛行時間質譜表征確定其結構后作為對照品,用于HILIC-MS/MS定量方法的發(fā)展。系統(tǒng)優(yōu)化了TCT檢測的色譜條件和MRM參數(shù),并對方法的重復性、回收率、線性關系、檢出限(LOD)和定量限(LOQ)等進行了考察。方法優(yōu)化后,將其用于兩種主流工藝(共純化和組分)所得百日咳和百白破疫苗中TCT的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC-MS/MS系統(tǒng)包括LCMS-8045三重四極桿質譜、LC-20ADXR高壓二元泵、脫氣機、SIL-30AC自動進樣器、CTO-20AC柱溫箱、SPD-M30A紫外檢測器,用于TCT的定量。LCMS-IT-TOF系統(tǒng)用于TCT的結構確定。LCMS-8045和LCMS-IT-TOF均使用ESI離子源并同時監(jiān)測正、負離子模式。LabSolutions和LCMSSolution工作站分別用于LCMS-8045和LCMS-IT-TOF的數(shù)據(jù)處理。以上儀器和軟件購自島津(京都,日本)。

乙腈、甲酸和低吸附離心管購自Merck (MA, USA)。超純水由Milli-Q系統(tǒng)制備(Millipore, USA)。HILIC色譜柱Click XAmide (150 mm×2.1 mm, 3 μm)由中國科學院大連化學物理研究所提供。QMA柱為購自Waters的陰離子交換固相萃取柱。共純化百日咳疫苗(廠家1和2)、組分百日咳疫苗(廠家3和4)、組分百白破疫苗(廠家5和6),共純化百白破疫苗(廠家7、8和9)和疫苗基質(百日咳和百白破疫苗基質)由中國食品藥品檢定研究院提供。

表 1 MRM模式下TCT的MS/MS參數(shù)

CE: collision energy. *Quantitative ion.

1.2 溶液配制、TCT對照品的制備

QMA柱所用平衡液和洗滌液均為含有10 mmol/L乙酸銨的甲醇水溶液(pH 5.5),其中甲醇與水的體積比為2∶8。QMA柱洗脫液為含有10 mmol/L乙酸銨、1 mol/L氯化鈉的甲醇水溶液(pH 5.5),其中甲醇與水的體積比為2∶8。TCT對照品參考文獻[2]的方法制備,具體步驟如下。(1)純化:百日咳桿菌培養(yǎng)液在4 ℃下采用高速離心的方法去除大分子雜質,取上清液過0.22 μm醋酸纖維素膜進一步去除溶液中的大分子雜質,收集濾液,用三氟乙酸調(diào)節(jié)濾過液pH值至3。(2)C18柱純化TCT:用甲醇和體積分數(shù)為0.1%的三氟乙酸水溶液依次洗滌C18填料;將洗滌后的C18填料填裝在玻璃柱中,然后注入純化步驟所得濾液;抽干柱中溶液,再用體積分數(shù)為0.1%的三氟乙酸水溶液洗滌色譜柱;用三氟乙酸-正丁醇-水(1∶200∶800, v/v/v)溶液洗脫TCT并收集餾分;減壓濃縮餾分以備QMA柱純化。(3)深度純化:用平衡液浸潤QMA柱10 min,再用20 mL洗滌液清洗QMA柱,再用20 mL甲醇清洗QMA柱,最后用20 mL平衡液平衡QMA柱。將減壓濃縮所得餾分注入QMA柱,再用洗滌液洗滌未結合蛋白質,然后用洗脫液洗脫TCT并收集。(4)脫鹽:用三氟乙酸酸化第(3)步所得TCT溶液至pH為3,再按富集步驟的操作流程上樣并收集TCT脫鹽餾分,凍干TCT脫鹽餾分,得TCT對照品,稱重后放置于-80 ℃保存。

1.3 疫苗樣品的前處理

向疫苗樣品中加入乙腈,直到乙腈體積分數(shù)為80%,充分振蕩、混合樣品1 min后,置于離心機中以14 000 r/min離心15 min。取上清液用于LC-MS/MS分析。處理前和處理后疫苗樣品均放置于4 ℃保存。

1.4 HPLC條件

LCMS-IT-TOF定性分析TCT與LCMS-8045定量分析TCT的HPLC條件相同。進樣體積為10 μL;色譜柱:Click XAmide (150 mm×2.1 mm, 3 μm);流動相A為10 mmol/L甲酸銨水溶液(pH 3.0),流動相B為10 mmol/L甲酸銨乙腈溶液(每升含100 μL甲酸)。流速為0.3 mL/min;梯度:0～5 min, 75%B～20%B; 5～5.1 min, 20%B～75%B; 5.1～9 min, 75%B。0～2 min的色譜柱洗脫液由六通閥切換至廢液,其余切換到MS檢測。

1.5 MS條件

TCT定性:離子源為電噴霧電離源,正離子模式;離子化電壓為3.5 kV;霧化氣流速為1.5 L/min;加熱模塊溫度為200 ℃;脫溶劑管(CDL)溫度為235 ℃;檢測器電壓為1.70 kV; TOF飛行管溫度為(40.0±0.3) ℃;質譜數(shù)據(jù)采集范圍m/z300～1 500;三氟乙酸鈉(NaTFA)溶液用于正負離子模式校正。

TCT定量:離子源為電噴霧電離源,正離子模式;掃描模式為多反應監(jiān)測(MRM)模式;離子化電壓為3.0 kV;離子源溫度為300 ℃;脫溶劑管(DL)溫度為235 ℃;霧化氣流速為3 L/min;干燥氣流速為10 L/min;加熱器流速為10 L/min。TCT的3個離子對通道用于TCT分析(見表1)。

1.6 標準溶液

將對照品制備步驟中所得TCT對照品(0.1 mg)用1 mL水溶解,配制成質量濃度為100 μg/L的TCT母液。取TCT母液,用疫苗基質逐級稀釋成質量濃度為369、184.5、92.25、46.13、23.06、11.53、5.76 ng/L,進樣10 μL,獲取線性曲線。

LOD和LOQ測試溶液配制方法如下:取質量濃度為5.76 ng/L的TCT溶液,用疫苗基質稀釋成質量濃度為2.88 ng/L和0.74 ng/L。

2 結果與討論

2.1 TCT對照品的結構鑒定

由于尚無商品化的TCT對照品,在發(fā)展TCT定量方法前需制備TCT對照品。根據(jù)文獻[2]方法制備、純化得到TCT樣品后用LCMS-IT-TOF鑒定其結構。根據(jù)LCMS-IT-TOF的一級質譜數(shù)據(jù)(圖1a)結合formula predictor軟件測得TCT分子式為C37H59N7O20,該結構與文獻[2]報道一致。由于所得TCT對照品質量較少(0.1 mg)且TCT固體對照品容易吸水(核磁氫譜中受水峰影響較大),難以實現(xiàn)用核磁共振測試其純度,本文采用質譜和紫外光譜法輔助測試樣品純度。在m/z100～2 000范圍內(nèi)和在200～400 nm范圍內(nèi)分別獲取TCT總離子流圖(圖1c)和紫外光譜圖(圖1d),其中210 nm處的色譜圖見圖1d。從圖1c可以看到,除TCT主峰以外,無其他雜質峰檢出。如圖1d所示,TCT樣品中無雜質峰檢出。由于TCT紫外吸收弱,低濃度TCT也無法被紫外檢測器檢出。

圖 1 LCMS-IT-TOF所得TCT的(a)一級質譜圖、(b)二級質 譜圖、(c)總離子流圖以及(d)TCT對照品的紫外光譜圖Fig. 1 (a) MS spectrum, (b) MS2 spectrum, (c) total ion chromatogram of TCT obtained by LCMS-IT-TOF and (d) UV/Vis chromatogram of TCT Injecting 10 μL 1 mg/L TCT to obtain total ion chromatogram of TCT in the range of m/z 100-2000. Injecting 10 μL 0.1 mg/mL TCT to obtain 3D UV/Vis spectrum of TCT in the wavelength range of 190-400 nm.

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1色譜模式的選擇

由于大分子化合物(如疫苗中的鋁佐劑、蛋白質等)容易堵塞分離系統(tǒng),污染色譜柱,導致系統(tǒng)壓力升高、保留時間漂移和色譜峰變形,因此需要采用適當?shù)那疤幚聿襟E將其去除。蛋白質沉淀技術(PPT)[9]是常用的蛋白質沉淀和鋁佐劑去除方法。PPT處理后的樣品通常溶解在高濃度有機溶劑中。在反相分離(RPLC)模式中,高濃度有機溶劑為強洗脫溶劑,以高濃度有機溶劑為樣品溶劑容易造成RPLC分離色譜峰分叉、變形甚至穿透等溶劑效應現(xiàn)象[10-12]。在HILIC模式中高濃度有機溶劑為弱洗脫溶劑[13],不但沒有RPLC分離出現(xiàn)的溶劑效應,當HILIC分離初始流動相中有機相比例低于樣品溶劑中有機溶劑比例時,還具有柱頭富集的作用。雖然TCT在RPLC和HILIC模式中均可保留,但HILIC模式具有與PPT處理溶劑兼容性的優(yōu)點。因此,選擇HILIC模式用于疫苗中TCT的分離。

2.2.2流動相組成的優(yōu)化

圖 2 不同流動相組成下TCT的MRM圖Fig. 2 MRM chromatograms of TCT obtained with different mobile phases Ammonia format buffer: a. 5 mmol/L ammonia format (pH 5.0); b. 5 mmol/L ammonia format (pH 3.5); c. 10 mmol/L ammonia format (pH 3.5). Mobile phase A: ammonia format buffer; mobile phase B: ammonia format buffer in acetonitrile. Flow rate: 0.3 mL/min. Gradient: 0-5 min, 75%B-20%B; 5.0-5.1 min, 20%B-75%B; 5.1-9.0 min, 75%B.

本文考察了流動相pH值(3.0～6.3)、緩沖鹽濃度(5～20 mmol/L)和初始乙腈體積分數(shù)(85%～60%)對TCT保留行為的影響,如圖2所示。隨著流動相中pH的增加,TCT保留增強且呈現(xiàn)拖尾峰(圖2a), pH過低不利于色譜柱的長期穩(wěn)定性,綜合考慮選擇pH 3.5用于TCT分離。pH 3～4是甲酸銨的常用緩沖范圍,故選擇甲酸銨作為緩沖鹽。流動相中緩沖鹽濃度的增加可增加親水層的極性,增強化合物的親水保留,但同時降低離子交換保留和增加MS檢測背景噪音。本文選擇10 mmol/L甲酸銨作為TCT分離的緩沖鹽濃度,該濃度相對于5 mmol/L甲酸銨(圖2b)作流動相添加劑無明顯MS背景增加[12],且TCT峰形更為對稱、柱效更高(圖2c),有利于提高檢測靈敏度。隨著初始流動相中乙腈含量的減少,TCT保留變?nèi)?因此確定初始流動相中乙腈的體積分數(shù)為75%,并在5 min內(nèi)線性降低到20%。該起始體積分數(shù)(75%)低于PPT處理所得樣品中乙腈的體積分數(shù)(80%),可避免溶劑強度帶來的溶劑效應[14]。如圖2c所示,TCT在乙腈體積分數(shù)約為36%時從色譜柱洗脫,該體積分數(shù)高于C18分離TCT時所用乙腈含量(20%)。當乙腈體積分數(shù)低于80%時,隨著乙腈體積分數(shù)的增加,可有效增加霧化效率[15],從而提高檢測靈敏度。

2.3 TCT定量分析時質譜條件的優(yōu)化

首先在m/z100～2 000范圍內(nèi),采用ESI+掃描方式獲取TCT對照品的一級質譜圖(見圖3a)。從一級譜圖中得到TCT的[M+H]+為m/z922.4。在10～50 eV碰撞能范圍內(nèi)獲取TCT的產(chǎn)物離子譜圖,選擇多種碰撞能下均可獲得且響應最高的3種產(chǎn)物離子作為TCT的MRM監(jiān)測通道,在這3個通道中,選擇信噪比最高的離子對m/z922.4→719.3作為定量離子對,其他兩個通道m(xù)/z922.4→391.1和922.4→302.1作為參比離子通道用于TCT定性篩查,MRM譜圖見圖3。在確定監(jiān)測離子對后,采用自動優(yōu)化模式對各離子對的碰撞能、Q1電壓和Q3電壓進行優(yōu)化,優(yōu)化結果見表1。

2.4 方法學考察

本文從選擇性、樣品殘留、LOD、LOQ、重復性、定量準確度和線性范圍對發(fā)展的LC-MS/MS方法進行了考察。

2.4.1選擇性

將LC-MS/MS方法用于疫苗基質的分析,在TCT出峰處無明顯信號峰(見圖3c),表明該方法不受樣品處理溶劑和疫苗基質的干擾,可在復雜的疫苗基質中選擇性檢測TCT,是一種高選擇性的分離檢測方法。

2.4.2樣品殘留

用LC-MS/MS方法分析高濃度TCT對照品(369 ng/L),隨后進空白溶劑分析,在TCT出峰處無明顯MRM信號峰檢出,表明該方法無明顯殘留(見圖3d)?？瞻兹軇橐译?水(8∶2, v/v)。因此,該方法可用于較寬濃度范圍內(nèi)樣品的分離檢測,高濃度樣品分析后無需增加色譜柱和系統(tǒng)的清洗步驟,即可實現(xiàn)低濃度樣品的分離檢測。

2.4.3LOD和LOQ

將常見的兩種獲取多肽LOD的方法(理論計算和實驗驗證)用于TCT的LOD測定。

理論計算:采用Keshishian等[16]報道的統(tǒng)計學公式LOD=Mb+t0.95(SDb+SDs)/n進行計算。其中,Mb和SDb分別為空白樣品的平均偏差和標準偏差,SDs為線性曲線最低濃度點樣品的標準偏差,t0.95是樣本量n=4時的t分布值。LOQ=3×LOD。經(jīng)測試和計算得到本方法的LOD和LOQ分別為0.72 ng/L和2.88 ng/L。

實驗驗證:配制理論計算所得LOD和LOQ對應濃度的TCT對照品溶液進樣測試,結果顯示質量濃度為0.72 ng/L和2.88 ng/L的TCT的信噪比(S/N)分別為3.2和13.4。

結合柱上樣量,對比本方法和文獻中靈敏度最高的柱前衍生-HPLC-UV方法[2](進樣200 μL, LOQ為1 408.5 ng/L),本方法的靈敏度比文獻方法[2]高9 781倍。藥典規(guī)定疫苗中TCT含量不得超過2 pmol每劑。按照通常疫苗體積0.5 mL計算,藥典控制濃度應為3 684 ng/L。本方法的LOQ (2.88 ng/L)是藥典要求疫苗中TCT最高殘留量的1/1 279。此外,該方法僅需9 min(含色譜柱平衡)即可完成一個樣品中TCT的檢測,與柱前衍生-HPLC-UV方法(45 min)[2]相比,具有更高的檢測通量。

2.4.4線性曲線

配制質量濃度從5.76 ng/L到369 ng/L范圍內(nèi)的TCT對照品溶液,共7個濃度樣品,每個濃度樣品進樣3次。將每個濃度所得TCT的峰面積(y)與對應質量濃度(x,ng/L)作線性曲線,得工作曲線:y=1 164.7x-1 201.7,R2=0.999 5。線性曲線的定量準確性用回收率A表示。A=C測試濃度/C標準濃度×100%。C測試濃度為實際測得的TCT質量濃度,計算方法為將線性曲線濃度點峰面積帶入工作曲線,計算所得濃度。C標準濃度為配制的對照品溶液的實際濃度。經(jīng)計算所得,線性曲線的7個濃度點回收率在98.7%到104.8%范圍內(nèi),表明該方法用于5.76 ng/L到369 ng/L濃度范圍內(nèi)TCT的含量測定具有較高的準確性。

2.4.5重復性

考察了低質量濃度(11.53 ng/L)和中等質量濃度(92.25 ng/L)的TCT對照品溶液進樣5次的峰面積重復性,其RSD分別為3.9%和2.7%。TCT為疫苗中需嚴格控制的有毒物質,如果疫苗中存在TCT,為保證定量準確性,避免疫苗質量的誤判,測定其含量所用標準曲線建議每天測試。

2.5 百日咳和百白破疫苗中TCT的含量測定

將優(yōu)化后的LC-MS/MS方法用于9個不同廠商生產(chǎn)的共純化百日咳疫苗、組分百日咳疫苗、共純化百白破疫苗和組分百白破疫苗中TCT的篩查和含量測定。如表2所示,9個疫苗樣品中均無TCT檢出,表明這些疫苗均未受TCT污染。方法回收率由以下方法[3,17]測試:回收率=(A加標-A樣品)/A標×100%,其中A加標為疫苗加標樣品進樣所得TCT峰面積,A樣品為樣品進樣所得TCT峰面積;A標為對照品溶液進樣所得TCT峰面積?；厥章蕼y試溶液配制方法如下:(1)標樣配制:取質量濃度為184.5 ng/L的TCT溶液100 μL,加入900 μL疫苗空白基質。(2)樣品配制:取疫苗樣品900 μL,加入100 μL疫苗空白基質。(3)樣品加標:取疫苗樣品900 μL,加入100 μL質量濃度為184.5 ng/L TCT溶液。如表2所示,TCT在所有樣品基質中均具有較好的回收率,表明共純化百日咳疫苗、組分百日咳疫苗、共純化百白破疫苗和組分百白破疫苗基質均對TCT檢測沒有明顯抑制作用[18]。

表 2 百日咳和百白破疫苗樣品中TCT的檢測結果和回收率

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3 結論

本文發(fā)展了一種HILIC-MS/MS方法用于共純化百日咳疫苗、組分百日咳疫苗、共純化百白破疫苗和組分百白破疫苗中TCT的檢測。該方法可實現(xiàn)不同廠家百日咳和百白破疫苗中TCT的高靈敏度快速篩查,其靈敏度比已報道的衍生-HPLC-UV方法高9 781倍,LOQ是藥典要求疫苗中TCT最高殘留量的1/1 279,完全滿足藥典對百日咳和百白破疫苗中TCT含量測定的要求。