張秀堯, 蔡欣欣, 張曉藝, 李瑞芬

(溫州市疾病預(yù)防控制中心, 浙江 溫州 325001)

馬桑(Coriaria sinica Maxim)是馬桑科馬桑屬植物,主要分布于我國(guó)西北、西南等地,全株有毒,尤以未成熟的果實(shí)毒性最大,馬桑果為豌豆大小,未成熟時(shí)為綠色,成熟時(shí)由鮮紅色漸變?yōu)樽虾谏?外形酷似桑葚,味微甜,常被兒童采食引起中毒,人誤食馬桑青果15～60 g即可中毒[1-5]。同時(shí),馬桑屬植物又是新西蘭廣泛分布的有毒原生植物,若蜜蜂采集到以馬桑汁液為生的澳洲廣翅蠟蟬(Scolypopa australis)所分泌的蜜露,則蜂蜜可能有毒,從而可能會(huì)引起食用者中毒[6-9]。馬桑的毒性成分主要有馬桑內(nèi)酯(馬桑毒素,coriamyrtin)、羥基馬桑內(nèi)酯(吐丁內(nèi)酯,tutin)、馬桑亭(coriatin)、馬桑寧(corianin)等倍半萜內(nèi)酯類化合物[10,11],化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。馬桑內(nèi)酯和羥基馬桑內(nèi)酯等為γ-氨基丁酸(GABA)受體拮抗劑,小鼠皮下注射馬桑根煎劑、葉煎劑、莖煎劑的半數(shù)致死量(LD50)分別為25 g/kg、9.75 g/kg和20 g/kg[2],羥基馬桑內(nèi)酯的LD50為3.2 mg/kg(bw)[8]。馬桑中毒潛伏期為0.5～3 h,輕者會(huì)有惡心、嘔吐、胸悶、腹部不適、頭昏和嗜睡等癥狀,可自行恢復(fù);重者則反復(fù)嘔吐、頭暈、心悸、全身發(fā)麻、突然昏迷而進(jìn)入抽搐期,嚴(yán)重者呼吸衰竭而死亡[12]。因此,迫切需要建立一種快速確定馬桑中毒的檢測(cè)方法。

圖 1 馬桑內(nèi)酯、羥基馬桑內(nèi)酯、馬桑亭和馬桑寧的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structures of coriamyrtin, tutin, coriatin and corianin

馬桑內(nèi)酯類化合物的檢測(cè)方法報(bào)道較少,早期報(bào)道的薄層色譜掃描法主要適用于生藥及注射液中有效成分的測(cè)定[13],近年來殷耀等[14]采用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用法在電噴霧電離(ESI)負(fù)離子模式下測(cè)定蜂蜜中的馬桑亭、馬桑寧和羥基馬桑內(nèi)酯,檢出限為0.05 mg/kg,定量限為0.1 mg/kg。Fields等[8]采用丙酮-水溶液提取、二氯甲烷-正己烷萃取、硅膠固相萃取柱凈化,超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法在大氣壓化學(xué)電離(APCI)正離子模式下測(cè)定人血清中羥基馬桑內(nèi)酯,采用大體積進(jìn)樣(100 μL),檢出限達(dá)0.1 ng/mL。目前有關(guān)血漿和尿液中馬桑亭和馬桑寧的檢測(cè)方法未見公開報(bào)道。本文選用馬桑亭和馬桑寧作為馬桑中毒的標(biāo)志物,采用固相支持液液萃取法提取和凈化樣品,超高效反相液相色譜分離,三重四極桿質(zhì)譜法檢測(cè),內(nèi)標(biāo)法定量,方法快速、靈敏、準(zhǔn)確。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀(包括ACQUITY UPLC BSM二元溶劑管理系統(tǒng)、ACQUITY UPLC FTN樣品管理系統(tǒng)、ACQUITY UPLC CM-A色譜柱管理系統(tǒng)和Empower 3工作站,美國(guó)Waters公司); QTRAP 6500三重四極桿/線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜儀(Analyst 1.6.2軟件,美國(guó)AB SCIEX公司); MS3旋渦混旋器(德國(guó)IKA-WERKE公司); 24孔N-EVAP氮吹儀(美國(guó)Organomation公司); Gradient A10 Milli-Q超純水器(法國(guó)Millipore公司)。

甲醇、乙腈和叔丁基甲醚(液相色譜溶劑級(jí),德國(guó)Merck公司),乙酸乙酯(液相色譜溶劑級(jí),美國(guó)Tedia公司)。Cleanert SLE固相支持液液萃取柱(200 mg/3 mL,天津博納艾杰爾科技有限公司),親水聚四氟乙烯濾膜針式過濾器(直徑13 mm,孔徑0.22 μm,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)。羥基馬桑內(nèi)酯、馬桑亭和馬桑寧標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度≥98%,云南西力生物技術(shù)公司),氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度≥98%,德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司),溶于甲醇制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液,臨用時(shí)用甲醇稀釋至所需濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,-35 ℃保存。健康人血漿購(gòu)自溫州市中心血站,尿液由健康人提供。

1.2 樣品前處理

吸取1.00 mL血漿或尿液于2 mL Eppendrof管中,加入10 μL 0.10 mg/L氟苯尼考內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液和200 μL 1%(v/v)氨水溶液,混勻,待凈化。

吸取200 μL上述試液加至Cleanert SLE固相支持液液萃取柱中,待試液進(jìn)入填料后靜置5 min以上,用4.0 mL叔丁基甲醚洗脫(流速1～2 mL/min),收集洗脫液,于50 ℃氮?dú)獯蹈?加入200 μL 15%(v/v)甲醇水溶液,渦旋15 s,過0.22 μm濾膜,待測(cè)。

1.3 儀器條件

1.3.1色譜條件

Cortecs C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.6 μm)和Cortecs C18保護(hù)柱(5 mm×2.1 mm, 1.6 μm) (美國(guó)Waters公司)。流動(dòng)相A:甲醇;流動(dòng)相B:水。梯度洗脫程序:0～3.50 min, 15%A～54%A; 3.50～3.60 min, 54%A～95%A; 3.60～5.50 min, 95%A; 5.50～5.60 min, 95%A～15%A; 5.60～7.50 min, 15%A;流速:0.250 mL/min;柱溫45 ℃;進(jìn)樣體積10 μL。乙腈作為清洗溶劑(Wash solvent), 15%(v/v)甲醇溶液作為消除溶劑(Purge solvent)。

1.3.2質(zhì)譜條件

電噴霧離子源負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式檢測(cè)。離子化電壓(IS): -4 500 V,離子源溫度(TEM): 350 ℃,氣簾氣(CUR)壓強(qiáng):277 kPa(40 psi),噴霧氣(GS1)壓強(qiáng):345 kPa(50 psi),輔助加熱氣壓強(qiáng)(GS2): 345 kPa(50 psi),碰撞器(CAD): Medium。其他參數(shù)見表1。

表 1 馬桑亭、馬桑寧及內(nèi)標(biāo)物氟苯尼考的質(zhì)譜參數(shù)

DP: declustering potential; CE: collision energy. * Quantitative ion.

運(yùn)行開始時(shí),色譜柱流出液經(jīng)六通切換閥切換至廢液直到2.40 min,六通切換閥將柱流出液切換到質(zhì)譜離子源中,質(zhì)譜同時(shí)采集數(shù)據(jù)直到3.10 min,六通切換閥又將柱流出液切回至廢液中。

本次調(diào)查的低年資手術(shù)室護(hù)士共49人，男16例（32.7%），女33例（67.3%）；年齡25歲以下9人（18.37%）、25～29歲35人（71.43%）、30～34歲5人（10.2%）；護(hù)士30人（61.2%），護(hù)師19人（38.8%）；教育程度：中專7人（14.3%），大專24人（49.0%），本科及以上18人（36.7%）；正式在編護(hù)士6人（12.2%）、合同聘用護(hù)士43人（87.8%）；已婚22人（44.9%）、未婚27人（55.1%）。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別在電噴霧和大氣壓化學(xué)電離正負(fù)離子電離方式下對(duì)羥基馬桑內(nèi)酯、馬桑亭和馬桑寧的質(zhì)譜測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化,在以上4種電離模式下,羥基馬桑內(nèi)酯的響應(yīng)值均很低,不適用于生物樣品的低濃度測(cè)定。在電噴霧和大氣壓化學(xué)電離負(fù)離子電離模式下,馬桑亭和馬桑寧均有一定的響應(yīng),且在電噴霧負(fù)離子電離模式下的響應(yīng)更高,約為大氣壓化學(xué)電離的30倍,故后續(xù)試驗(yàn)在電噴霧負(fù)離子電離模式下進(jìn)行優(yōu)化。第1級(jí)四極桿全掃描時(shí)出現(xiàn)[M-H]-峰,以[M-H]-作為母離子進(jìn)行碰撞解離,通過子離子掃描得到目標(biāo)化合物的碎片離子信息,見圖2,然后再對(duì)去簇電壓、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,使得分子離子對(duì)的信號(hào)達(dá)到最高。每種待測(cè)物選擇響應(yīng)最高的兩對(duì)分子離子對(duì),以其中響應(yīng)高的分子離子對(duì)作為定量離子對(duì),另一分子離子對(duì)作為定性離子對(duì)。再設(shè)定合適的峰駐留時(shí)間(dwell time)使得色譜峰的采樣點(diǎn)數(shù)在15～20之間,得到較好的定量重復(fù)性。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見1.3.2節(jié)。

圖 2 馬桑亭和馬桑寧的子離子掃描譜圖Fig. 2 Product ion scan spectra of coriatin and corianin

2.2 超高效液相色譜條件優(yōu)化

試驗(yàn)比較了100 mm×2.1 mm規(guī)格的BEH C18(1.7 μm)、HSS T3(1.8 μm)、Cortecs C18(1.6 μm)等色譜柱對(duì)馬桑亭和馬桑寧的分離效果,結(jié)果顯示Cortecs C18色譜柱的色譜響應(yīng)和峰形均最佳,因此選為分析柱?？疾炝艘约状?水、乙腈-水以及加入低濃度的甲酸、乙酸銨緩沖鹽和0.05%(v/v)氨水后的甲醇-水、乙腈-水作為流動(dòng)相的分離效果,結(jié)果表明甲醇-水的響應(yīng)值最高,故選為流動(dòng)相。同時(shí)又對(duì)流動(dòng)相梯度洗脫程序和柱溫等分離條件進(jìn)行了優(yōu)化,最終使得待測(cè)物的色譜保留時(shí)間適當(dāng),優(yōu)化好的色譜條件見1.3.1節(jié)。馬桑亭和馬桑寧的化學(xué)結(jié)構(gòu)非常相似,在本分離條件下無法達(dá)到分離,由于它們的分子離子對(duì)各不相同,并不影響在質(zhì)譜上的檢測(cè)和定量。

2.3 內(nèi)標(biāo)物的選擇

采用內(nèi)標(biāo)法定量可以校正待測(cè)物在樣品前處理中的損失,可以校正質(zhì)譜測(cè)定過程中的基質(zhì)效應(yīng)等,從而得到更好的準(zhǔn)確度和精密度,最理想的是采用穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)法。由于目前馬桑亭和馬桑寧還沒有商品化的同位素內(nèi)標(biāo),因此嘗試采用能在電噴霧負(fù)離子模式下電離的氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素作為內(nèi)標(biāo)物,結(jié)果顯示氟苯尼考的保留時(shí)間為2.74 min,與馬桑亭2.76 min和馬桑寧2.80 min相近,最終選用氟苯尼考作為內(nèi)標(biāo)物,可以校正質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)的波動(dòng)性、樣品前處理過程中的損失和基質(zhì)效應(yīng)等。

2.4 樣品前處理方法優(yōu)化

固相支持液液萃取法(solid supported liquid/liquid extraction, SLE)采用多孔結(jié)構(gòu)的硅藻土作為載體材料,當(dāng)含水量高的血漿或尿液樣品上樣后,樣品被吸附于硅藻土微孔表面形成液膜,加入與水不互溶的洗脫溶劑時(shí),洗脫溶劑進(jìn)入硅藻土微孔內(nèi)與水性的液膜進(jìn)行微觀的液液萃取,待測(cè)物被洗脫溶劑從樣品液中萃取出來,而磷脂、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)則留在硅藻土吸附的樣品液中,達(dá)到待測(cè)物同時(shí)提取和凈化的目的。其操作簡(jiǎn)便快速,是一種高通量的樣品處理方法,已應(yīng)用于生物樣品的前處理[15]。

馬桑亭和馬桑寧屬倍半萜內(nèi)酯類物質(zhì),為脂溶性化合物,適合于固相支持液液萃取法提取和凈化,試驗(yàn)選用乙酸乙酯和叔丁基甲醚作為洗脫溶劑進(jìn)行比較,叔丁基甲醚在提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)、基線噪聲和基質(zhì)干擾等方面均優(yōu)于乙酸乙酯,最終選作洗脫溶劑;在各3份1.0 mL尿液和血漿中分別加入0.2 mL 3%(v/v)高氯酸、水和1%(v/v)氨水,代表酸性、中性和堿性條件進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果顯示在堿性條件下,基質(zhì)干擾和基質(zhì)效應(yīng)小、基線噪聲低,可能是在堿性條件下,尿液中大量酸性代謝成分未被萃取,試驗(yàn)最終選擇在堿性條件下以叔丁基甲醚進(jìn)行洗脫。

在空白血漿和尿液的處理殘?jiān)?加入200 μL 1.0 μg/L馬桑亭和10.0 μg/L馬桑寧的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液制成基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect, ME)通過基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測(cè)物色譜峰面積的比值進(jìn)行評(píng)估[16],平行試驗(yàn)5次,結(jié)果顯示血漿中馬桑亭和馬桑寧的平均基質(zhì)效應(yīng)分別為98.6%(RSD為5.2%)和84.6%(RSD為5.8%),尿液中平均基質(zhì)效應(yīng)分別為78.1%(RSD為5.9%)和76.4%(RSD為6.1%),顯示有一定的基質(zhì)效應(yīng);提取回收率通過加標(biāo)樣品處理液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測(cè)物色譜峰面積的比值進(jìn)行評(píng)估[16],平行試驗(yàn)5次,血漿中馬桑亭和馬桑寧的平均提取回收率分別為71.2%(RSD為5.1%)和73.7%(RSD為5.9%),尿液中分別為68.7% (RSD為6.1%)和78.0%(RSD為5.8%)。以上試驗(yàn)顯示在測(cè)定過程中馬桑亭和馬桑寧存在一定的基質(zhì)效應(yīng),且平均提取回收率在68.7%～78.0%之間,提示不能采用純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液或用基質(zhì)溶液作為溶劑配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量,應(yīng)采用基質(zhì)工作曲線法進(jìn)行定量,即在樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，按樣品前處理方法制備再測(cè)定得到的工作曲線,期望能夠補(bǔ)償馬桑亭和馬桑寧在樣品處理時(shí)的損失和基質(zhì)抑制效應(yīng)。

2.5 方法的線性范圍、檢出限和定量限

分別在6份空白血漿樣品和6份空白尿液樣品中加入適量馬桑亭和馬桑寧混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,使馬桑亭的質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10.0 μg/L,馬桑寧的質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、50、100 μg/L(各含有1.0 μg/L氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)溶液),按1.2節(jié)進(jìn)行樣品前處理后再測(cè)定,采用MultiQuant定量軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,以定量離子對(duì)與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值(Y)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度(X, μg/L)進(jìn)行回歸(權(quán)重取1/X),結(jié)果見表2,相關(guān)系數(shù)均優(yōu)于0.996,線性關(guān)系良好。

在空白血漿和尿液樣品中分別加入低濃度的馬桑亭和馬桑寧進(jìn)行測(cè)定,以分子離子對(duì)的信噪比≥3時(shí)的樣品濃度作為檢出限(LOD),以信噪比≥10時(shí)的樣品濃度作為定量限(LOQ),測(cè)得血漿和尿液中馬桑亭和馬桑寧的檢出限和定量限見表2。定量限濃度水平加標(biāo)的血漿樣品的色譜圖見圖3。

2.6 樣品的加標(biāo)回收和精密度試驗(yàn)

在空白血漿和尿液樣品中分別添加4個(gè)質(zhì)量濃度水平的馬桑亭和馬桑寧標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.2節(jié)進(jìn)行樣品處理和測(cè)定,每個(gè)添加水平平行試驗(yàn)6次,血漿和尿液中馬桑亭和馬桑寧的平均加標(biāo)回收率為86.2%～110%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.1%～14.6%(見表3),符合痕量分析的要求。

表 2 血漿及尿液基質(zhì)中馬桑亭和馬桑寧的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限

Y: peak area ratio of the quantitative ions of analyte to internal standard (weight 1/X);X: mass concentration, μg/L.

圖 3 空白血漿及血漿加標(biāo)樣品中馬桑亭和馬桑寧的UPLC-MS/MS色譜圖Fig. 3 UPLC-MS/MS chromatograms of coriatin and corianin in a blank plasma and a plasma sample spiked with coriatin and corianin

CompoundMatrixSpiked level/(μg/L)Found/(μg/L)Recovery/%RSD/%Coriatinplasma0.030.03100.013.30.10.11110.09.41.00.9595.07.54.03.4586.25.4urine0.10.1100.013.70.50.5100.08.62.01.995.05.78.07.492.54.2Corianinplasma0.30.3100.012.51.01.1110.05.310.09.292.08.740.041.6104.05.1urine11.1110.014.65.05.1102.010.220.018.994.46.780.083.8104.87.9

3 結(jié)論

本文建立了測(cè)定血漿和尿液中馬桑中毒標(biāo)志物馬桑亭和馬桑寧的超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)方法。采用固相支持液液萃取法處理樣品,簡(jiǎn)化了操作步驟,通過對(duì)色譜分離和質(zhì)譜檢測(cè)等條件的優(yōu)化,得到了較高的檢測(cè)靈敏度。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明,方法快速、簡(jiǎn)便,靈敏度高,準(zhǔn)確度和精密度好,可用于馬桑中毒的快速檢測(cè)。