衛(wèi) 敏, 金小青, 趙岳星

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 金華 321004)

高效液相色譜法(HPLC)因具有靈敏度高、分析速度快和專屬性強(qiáng)等特點被廣泛應(yīng)用于食品、生物、藥物檢測等行業(yè)[1-4],其中大多數(shù)需檢測的物質(zhì)為強(qiáng)堿性和強(qiáng)極性化合物,在對該類化合物進(jìn)行分離時,由于改性后的硅膠表面仍存在大量的殘余硅羥基,堿性物質(zhì)會在其上發(fā)生不可逆吸附,造成峰形拖尾現(xiàn)象[5]。經(jīng)過不斷探索,研究者發(fā)現(xiàn),將極性基團(tuán)嵌入到烷烴鏈上有助于減弱殘余硅羥基對堿性化合物的影響[6-10],因此目前已有許多色譜工作者致力于該項研究。將各類極性基團(tuán)嵌入到短鏈烷烴如C18上[11-15]，雖然在很大程度上改善了堿性物質(zhì)的峰形,但該類固定相擇形性差,限制了色譜柱的應(yīng)用范圍。色譜理論認(rèn)為硅膠表面鍵合的烷烴碳鏈越長,固定相的擇形性越好[16]。為使兩者兼得,研究者將極性基團(tuán)嵌入到碳鏈較長的烷烴上。張明亮等[17,18]將氨基酸甲酯這一極性基團(tuán)成功嵌入到C30上,并通過實驗證明該填料不僅可以對強(qiáng)堿性物質(zhì)有很好的分離效果,還彌補了短鏈烷烴擇形性差的缺陷。本研究旨在開發(fā)一種新型的極性填料,采用兩步法將脲丙基嵌入到C30上,并對其做了一系列的物理性質(zhì)表征與色譜性能研究。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters e2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司); Nicolet NEXUS670紅外光譜儀(美國Thermo公司); JW-BK222型比表面及孔徑分析儀(北京精微高博科學(xué)技術(shù)有限公司); Vario EL CUBE型元素分析儀(德國Elementar公司); OS20-S型電動攪拌機(jī)(北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司); ZNHW型電熱套(鞏義市予華儀器有限公司); MS-H-ProfT磁力加熱攪拌器(北京星瑞通航科技有限公司); DSTV-150型裝柱機(jī)(深圳市正大流體機(jī)電設(shè)備有限公司); YB-W400型移動式空壓機(jī)(上海勇霸機(jī)電技術(shù)有限公司)。

硅膠(5 μm,蘇州麥可旺志科技有限公司); 3-脲丙基三甲氧基硅烷、三十烷基三氯硅烷(上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司);鹽酸、甲苯、三乙胺、甲醇、丙酮、四氫呋喃和氫氟酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。所有試劑均為分析純;色譜性能測試所用甲醇為色譜純;水為德國Millipore Direct-Q3所制得的超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1極性脲丙基-C30(TPU-C30)固定相的制備

準(zhǔn)確稱取10 g硅膠和50 mL體積分?jǐn)?shù)為20%的鹽酸溶液,置于250 mL三口燒瓶中,加熱攪拌回流24 h,抽濾,用超純水洗滌,直至濾液為中性(用pH試紙測定),于100 ℃真空干燥12 h,制得酸化硅膠。

準(zhǔn)確稱取10 g上述酸化硅膠、55 mL甲苯和12 mL 3-脲丙基三甲氧基硅烷,置于250 mL三口燒瓶中,于110 ℃在N2氣氛下加熱攪拌回流24 h。反應(yīng)完成后抽濾,依次用20 mL甲苯、20 mL丙酮、20 mL四氫呋喃和30 mL甲醇洗滌,于80 ℃真空干燥12 h,得到TPU。

準(zhǔn)確稱取5 g TPU、40 mL甲苯,置于250 mL三口燒瓶中,于110 ℃加熱攪拌回流2 h,然后停止加熱,向三口燒瓶中加入2滴氫氟酸和3 g三十烷基三氯硅烷,于110 ℃在N2氣氛下加熱攪拌回流24 h。反應(yīng)完成后,抽濾,并依次用20 mL甲苯、丙酮、四氫呋喃和甲醇洗滌,于80 ℃真空干燥至恒重,即可制得TPU-C30。TPU-C30的制備路線見圖1。

圖 1 TPU-C30固定相的合成路線Fig. 1 Synthesis route of the polar urea-propyl-C30 (TPU-C30) stationary phase

1.2.2TPU-C30柱裝填

采用勻漿法裝柱,以環(huán)己醇-乙腈(1∶1, v/v)為勻漿劑,將3 g TPU-C30懸浮于其中制成勻漿液。以甲醇為頂替液,在高壓下將TPU-C30填入不銹鋼柱管(250 mm×4.6 mm)中,保持柱壓為70 MPa,裝柱時間約10 min。

1.2.3樣品配制

甲苯標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確量取170 μL甲苯,置于100 mL容量瓶中,用甲醇-水(75∶25, v/v)定容,冷藏。

極性與非極性物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取1 mg尿嘧啶、40 mg苯酚、170 mg甲苯和5 mg 4-硝基氯苯,用甲醇-水(75∶25, v/v)溶解,定容于100 mL容量瓶中,冷藏。樣品濃度:尿嘧啶0.01 g/L、苯酚0.4 g/L、甲苯1.7 g/L、4-硝基氯苯0.05 g/L。

苯并菲、鄰三聯(lián)苯、間三聯(lián)苯、對三聯(lián)苯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取2.5 mg苯并菲、7 mg鄰三聯(lián)苯、2.5 mg間三聯(lián)苯和10 mg對三聯(lián)苯,用甲醇溶解,定容于100 mL容量瓶中,冷藏。樣品濃度:苯并菲0.025 g/L、鄰三聯(lián)苯0.07 g/L、間三聯(lián)苯0.025 g/L、對三聯(lián)苯0.1 g/L。

阿米替林標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取2.5 mg阿米替林,用超純水溶解,定容于10 mL容量瓶中,冷藏。樣品濃度:0.25 g/L。

1.3 TPU-C30柱性能測試條件

1.3.1檢出限

樣品:甲苯標(biāo)準(zhǔn)溶液;色譜柱:C18柱(250 mm×4.6 mm)、C30柱(250 mm×4.6 mm)、TPU-C30柱(250 mm×4.6 mm);柱溫:25 ℃;流動相:甲醇-水(75∶25, v/v);流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣體積:10 μL;檢測波長:254 nm。

1.3.2選擇性

樣品:極性與非極性物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液;色譜柱:TPU-C30柱和C30柱;柱溫:25 ℃;流動相:水-甲醇(65∶35, v/v)(TPU-C30柱),水-甲醇(25∶75, v/v)(C30柱);流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣體積:10 μL;檢測波長:254 nm。

1.3.3擇形性

樣品:苯并菲、鄰三聯(lián)苯、間三聯(lián)苯、對三聯(lián)苯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液;色譜柱:TPU-C30柱、C30柱和C18柱;柱溫:25 ℃;流動相:水-甲醇=(20∶80, v/v);流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣體積:10 μL;檢測波長:254 nm。

1.3.4拖尾因子考察測試條件

樣品:阿米替林標(biāo)準(zhǔn)溶液;色譜柱:TPU-C30柱和C30柱;柱溫:25 ℃;流動相:水-甲醇(20∶80, v/v)(用20 mmol/L的KH2PO4與20 mmol/L的K2HPO4調(diào)節(jié)pH值至7);流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣體積:2 μL;檢測波長:254 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 TPU-C30的設(shè)計

含有氮基團(tuán)的配體有利于堿性物質(zhì)的分離,受到大多數(shù)色譜研究者的青睞。脲丙基三甲氧基硅烷為含氮有機(jī)硅烷試劑,可與硅醇在硅膠表面發(fā)生共價反應(yīng),生成中間產(chǎn)物TPU。該反應(yīng)穩(wěn)定且鍵合量高。TPU繼續(xù)與三十烷基三氯硅烷發(fā)生取代反應(yīng),即可得到TPU-C30。

TPU-C30固定相在分離極性與非極性物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液時,存在以下作用力:C30長鏈給予的疏水作用力以及脲基與某些溶質(zhì)產(chǎn)生的π-π作用力。在分離堿性化合物時,理論上可能存在以下分離機(jī)理:(1)空間位阻效應(yīng),三十烷基分子較大,空間位阻大,可減小硅膠表面殘余硅羥基與堿性化合物的接觸;(2)靜電屏蔽作用,含氮基團(tuán)的固定相可與堿性溶質(zhì)間形成較強(qiáng)的靜電吸引力,屏蔽了硅羥基與堿性物質(zhì)間的作用力,改善了峰形。

2.2 TPU-C30的結(jié)構(gòu)表征

2.2.1掃描電子顯微鏡(SEM)表征

本研究對酸化硅膠和TPU-C30的外觀形貌分別進(jìn)行了SEM表征(見圖2)。可以看出,鍵合反應(yīng)前后硅膠的形貌無任何變化,均為規(guī)則的球狀顆粒,且單分散性良好。表明TPU-C30具有良好的機(jī)械強(qiáng)度,適于色譜柱的裝填,擁有良好的分離穩(wěn)定性。

圖 2 (a)酸化硅膠與(b)TPU-C30的SEM圖Fig. 2 Scanning electron microscope (SEM) images of (a) acidified silica gel and (b) TPU-C30

圖 3 酸化硅膠、TPU和TPU-C30的紅外光譜圖Fig. 3 Infrared spectra of acidified silica gel, TPU and TPU-C30

2.2.2紅外光譜表征

紅外光譜儀可對物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成進(jìn)行分析,為了鑒定所合成化合物的具體結(jié)構(gòu),分別對酸化硅膠、TPU與TPU-C30進(jìn)行了紅外光譜分析(見圖3)?？梢钥闯?在3 423.1 cm-1處的吸收峰為硅膠表面硅羥基伸縮振動峰信號;在1 101.1 cm-1和798.4 cm-1兩處的吸收峰為Si-O伸縮振動帶。TPU和TPU-C30均在2 927.5 cm-1左右出現(xiàn)了C-H伸縮振動吸收峰,表明硅膠表面含有機(jī)物,在約1 654.6 cm-1處出現(xiàn)了-NH振動峰。相較于TPU, TPU-C30的紅外光譜圖上的C-H振動吸收峰幅度更大,說明TPU-C30存在更多的有機(jī)成分。以上分析表明TPU-C30已成功合成。

2.2.3元素分析

元素分析能測定有機(jī)物中的元素種類,并可準(zhǔn)確測定其相對含量。本研究采用元素分析技術(shù)分別對酸化硅膠與TPU-C30中所含N、C、H的相對含量進(jìn)行了測定(見表1)。酸化硅膠的含碳量代表硅膠表面硅烷的鍵合程度。理論上色譜填料的含碳量應(yīng)在2%～50%之間,經(jīng)元素分析測定,TPU-C30的平均碳含量為13.76%,符合色譜填料的要求;N、C、H相對含量的相對偏差均小于5%,表明該填料制備工藝重復(fù)性良好。

圖 5 酸化硅膠、TPU和TPU-C30的熱重曲線圖Fig. 5 Thermogravimetric (TG) curves of acidified silica gel, TPU and TPU-C30

%

2.2.4比表面與孔徑分析

對TPU-C30進(jìn)行比表面積與孔徑分析測定。圖4為TPU-C30的氮氣吸脫附等溫線與孔徑分布圖。氮氣吸脫附等溫線圖中存在明顯的滯后環(huán),屬于HI模型,表明TPU-C30為介孔材料。從孔徑分布圖可知,該材料孔徑分布范圍較窄,孔徑均一,具有良好的色譜性能。測定結(jié)果表明,TPU-C30比表面積為114.434 m2/g,孔體積為0.378 cm3/g,孔徑為7.466 nm。

圖 4 TPU-C30的(a)氮氣吸脫附等溫線和(b)孔徑分布圖Fig. 4 (a) Nitrogen adsorption and desorption isotherm and (b) pore size distribution of TPU-C30

2.2.5熱重分析

熱重分析技術(shù)可在程序控制溫度下測量物質(zhì)的質(zhì)量與溫度間的關(guān)系。本研究分別對酸化硅膠、TPU與TPU-C30進(jìn)行了熱重分析(見圖5)?？梢钥闯?酸化硅膠、TPU與TPU-C30的熱重曲線均在100 ℃前呈下降趨勢,這是由于硅膠表面吸附的水分子蒸發(fā)導(dǎo)致的;TPU在200 ℃后呈下降趨勢,在700 ℃時趨于平緩,在這一溫度區(qū)間內(nèi)汽化的基團(tuán)為脲丙基。TPU-C30在200～450 ℃區(qū)間與TPU呈一致的下降趨勢,表明其所汽化的有機(jī)成分也為脲丙基;在450 ℃后下降趨勢加大,這是由于C30的沸點為460 ℃, C30與脲丙基同時汽化導(dǎo)致了這一現(xiàn)象。

2.3 TPU-C30柱使用壽命的考察

用300個柱體積(1.2 L)的甲醇沖洗制備的色譜柱,再用300個柱體積的甲醇-水(75∶25, v/v)沖洗制備的色譜柱。沖洗色譜柱前后,分別采用甲苯標(biāo)準(zhǔn)溶液對色譜柱進(jìn)行穩(wěn)定性測試。測試結(jié)果表明,甲苯在沖洗前后保留時間不變,柱效維持穩(wěn)定,表明TPU-C30色譜柱具有良好的穩(wěn)定性。

2.4 TPU-C30性能測試結(jié)果

2.4.1檢出限考察

以甲苯標(biāo)準(zhǔn)溶液為溶質(zhì)探針,在相同色譜條件下比較采用3種色譜柱(C18柱(250 mm×4.6 mm)、C30柱(250 mm×4.6 mm)和TPU-C30柱(250 mm×4.6 mm))時樣品的檢出限。結(jié)果表明,采用C18柱、C30柱和TPU-C30柱時,甲苯的檢出限分別為1.08、0.61和0.17 mg/L。說明TPU-C30柱更有利于樣品的檢測與分析。

圖 6 4種極性與非極性化合物在TPU-C30柱和 C30柱上的色譜圖Fig. 6 Chromatograms of the four polar and non-polar compounds on the TPU-C30 column and C30 column

2.4.2選擇性考察

以4種極性與非極性物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液為溶質(zhì)探針,考察TPU-C30柱對極性不同的樣品的選擇性。結(jié)果表明,4種溶質(zhì)在TPU-C30柱上實現(xiàn)了基線分離,并顯示出不同于C30柱的選擇性(見圖6)。溶質(zhì)在C30柱上的保留機(jī)理為疏水作用,按照其疏水性大小,溶質(zhì)的保留時間順序依次為尿嘧啶<苯酚<4-硝基氯苯<甲苯;采用TPU-C30柱時,疏水作用力占主導(dǎo)地位,但除此之外,固定相上還存在羰基、脲基,能與溶質(zhì)分子形成較強(qiáng)的π-π作用力與氫鍵作用力,導(dǎo)致其選擇性異于C30柱。

圖 7 鄰三聯(lián)苯、間三聯(lián)苯、對三聯(lián)苯和苯并菲在C18柱、 C30和TPU-C30柱上的色譜圖Fig. 7 Chromatograms of o-terphenyl, m-terphenyl, p-terphenyl and triphenylene on the C18, C30 and TPU-C30 columns α1/4: the ratio of the separation factor of triphenylene to o-terphenyl. Peak identifications: 1. o-terphenyl; 2. m-terphenyl; 3. p-terphenyl; 4. triphenylene.

2.4.3擇形性考察

田中測試為常見的色譜固定相擇形性測試方法,測試樣品為苯并菲、鄰三聯(lián)苯、間三聯(lián)苯與對三聯(lián)苯,其物質(zhì)結(jié)構(gòu)大小(F)均為9,物質(zhì)分子長與寬的比值(L/B)分別為1.12、1.11、1.47和2.34。苯并菲與鄰三聯(lián)苯的L/B值最為接近,分子平面卻不同,本研究以兩者之間的分離因子比值(α1/4)來衡量3種色譜柱(C18柱、C30柱和TPU-C30柱)的擇形性。從圖7中可以看出,間三聯(lián)苯與苯并菲在C18柱上沒有達(dá)到基線分離。采用C30柱時,4種芳香類化合物雖然實現(xiàn)了基線分離,但苯并菲與鄰三聯(lián)苯的α1/4較小,分析時間較長。這是由于C30相比于C18碳鏈較長,在疏水作用的基礎(chǔ)上,與溶質(zhì)分子之間還存在較大的空間位阻作用,不僅改變了4種溶質(zhì)的出峰順序,也在一定程度上增強(qiáng)了C30柱的擇形性。而這4種芳香類化合物在TPU-C30柱上不僅實現(xiàn)了快速有效分離(保留時間小于13 min),而且其擁有比C30柱更大的α1/4值(2.67)。這是由于在TPU-C30柱中,固定相與溶質(zhì)之間除了疏水作用力和空間位阻作用力外,帶有苯環(huán)的溶質(zhì)還與TPU-C30中的羰基發(fā)生了較強(qiáng)的π-π作用力。因此TPU-C30柱擁有優(yōu)于C18柱和C30柱的擇形性。

圖 8 阿米替林在(a)TPU-C30柱和(b)C30柱上的色譜圖Fig. 8 Chromatograms of amitriptyline on (a) TPU-C30 column and (b) C30 column

2.4.4拖尾因子考察

阿米替林為含氮有機(jī)堿,在pH=7時,二甲基胺與硅羥基均以離子狀態(tài)存在,且此條件下兩者之間的靜電作用最強(qiáng)。因此采用阿米替林作為溶質(zhì)探針,將流動相的pH值調(diào)節(jié)至7,評價TPU-C30柱的性能。結(jié)果表明,阿米替林在TPU-C30柱上無明顯拖尾現(xiàn)象(見圖8a),其拖尾因子為1.103;在C30柱上出現(xiàn)了較嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象(見圖8b),拖尾因子達(dá)到了3.162。對堿性物質(zhì)進(jìn)行分析時,硅膠表面殘余硅羥基的數(shù)量是造成拖尾的直接原因。C30柱固定相雖然通過封尾這一操作在一定程度上減少了硅膠表面殘余硅羥基的數(shù)量,但由于存在空間位阻,其表面仍存在大量的硅羥基,使得阿米替林峰在C30柱上出現(xiàn)較嚴(yán)重的拖尾。而TPU-C30柱中存在脲基,在中性條件下,其解離出的N+與Si-O-存在較強(qiáng)的靜電吸引力,屏蔽了硅羥基與阿米替林之間的作用力,改善了峰形。

3 結(jié)論

本文成功制備了TPU-C30固定相,具有機(jī)械強(qiáng)度高、熱重穩(wěn)定、孔徑均一等優(yōu)點。TPU-C30柱主要作用力為疏水作用,同時由于嵌入基團(tuán)中含有羰基、氨基等多個作用位點,還存在π-π電荷轉(zhuǎn)移作用力及氫鍵作用力。多種作用力與適當(dāng)?shù)氖杷怨餐饔?使TPU-C30柱在分離極性不同的物質(zhì)時顯示出不同的選擇性;在分離同分異構(gòu)體時有更優(yōu)的擇形性;在分離堿性物質(zhì)時峰形改善明顯。TPU-C30柱在一定程度上彌補了傳統(tǒng)C18柱與C30柱的不足,具有較大的應(yīng)用空間。