劉曉婧 叢雁方 魏波 王宏華 王艷玲 蔣貽海* 袁延文 張春革 （青島蔚藍(lán)生物制品有限公司 山東 青島 青島動保國家工程技術(shù)研究中心有限公司 山東 青島 青島蔚藍(lán)生物股份有限公司 山東 青島 山東省壽光市畜牧獸醫(yī)管理局 通標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司青島分公司 山東 青島）

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不同佐劑制備雞新城疫、禽流感二聯(lián)滅活苗免疫效果評價試驗

劉曉婧①叢雁方②魏波②王宏華③王艷玲②③蔣貽海③*袁延文④張春革⑤（①青島蔚藍(lán)生物制品有限公司 山東 青島 ②青島動保國家工程技術(shù)研究中心有限公司 山東 青島 ③青島蔚藍(lán)生物股份有限公司 山東 青島 ④山東省壽光市畜牧獸醫(yī)管理局 ⑤通標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司青島分公司 山東 青島）

基于對市場現(xiàn)有佐劑產(chǎn)品的了解取不同佐劑產(chǎn)品作比較，以禽類疫苗為例。選取雞新城疫、禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活苗(Lasota株+WD株)滅活后抗原液，按不同佐劑的配苗比例分別配制滅活苗，驗證其免疫效果。將添加不同佐劑配制的滅活苗分別免疫7日齡商品肉雞，分6組，每組30只，其中1~5組分別免疫5種不同佐劑配制的禽流感滅活疫苗，6組為空白對照，各免疫0.3ml/只。分別于免疫后14、21、28、35d采血，離心后取血清，利用血凝抑制方法分別檢測雞新城疫和H9亞型禽流感血清抗體。計算抗體平均滴度。試驗結(jié)果顯示，MF59、GEL02和ISA70VG等新型佐劑較傳統(tǒng)佐劑均能產(chǎn)生較高的抗體水平且能使機(jī)體在短期內(nèi)快速產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)并能很好的維持其抗體水平。

滅活苗 佐劑 免疫效果

雞新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的一種急性高度接觸性傳染病，其發(fā)病率和死亡率極高[1]。禽流感(AI)則是由A型流感病毒(AIV)引起，主要通過呼吸系統(tǒng)傳播的嚴(yán)重侵害禽類呼吸系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的一種傳染病[2,3]。在我國新城疫和禽流感等疫病的暴發(fā)對養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，均屬于必須要防控的重要疫病。

目前，雞新城疫和禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗(Lasota株+WD株)多數(shù)采用白油作為佐劑[4,5]，但隨著科技的發(fā)展，越來越多的佐劑種類出現(xiàn)，現(xiàn)已提出了許多新的作用機(jī)制。選擇合適的佐劑可促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生特異的免疫應(yīng)答反應(yīng)：提高抗原吸收率、延長抗原儲備時間、激活補(bǔ)體活性、促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞因子釋放、將抗原提呈給不同的APC群、調(diào)節(jié)MHCI型和II型抗原分子表達(dá)和刺激抗體產(chǎn)生。為更好地了解不同佐劑制備的雞新城疫、流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗在雞群的免疫效果，我們從市場上選取5種禽類疫苗用佐劑，分別配制二聯(lián)苗，開展了田間雞新城疫、流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗免疫效果的評估工作。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 肉仔雞180只。在選定的養(yǎng)殖場根據(jù)常規(guī)方法養(yǎng)殖。

1.1.2 試驗滅活抗原 雞新城疫病毒(Lasota株)、H9亞型禽流感病毒(WD株)二聯(lián)滅活抗原液：青島蔚藍(lán)生物制品有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 檢測試劑 雞新城疫HI實驗標(biāo)準(zhǔn)抗原和陽性血清均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。H9亞型禽流感HI標(biāo)準(zhǔn)抗原和陽性血清均購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.2 方法

1.2.1 疫苗制備 先將經(jīng)檢測合格的新城疫病毒液和禽流感(H9亞型)滅活病毒液按配苗比例混合，再將混合后的病毒液與佐劑按照其參考劑量制備滅活苗，共制備5種二聯(lián)滅活苗。

1.2.2 安全檢驗 根據(jù)《中華人民共和國獸藥典》附錄中的檢測方法進(jìn)行檢驗。每組疫苗10只，每只頸部皮下注射疫苗0.1ml，觀察14日內(nèi)是否出現(xiàn)因疫苗引起的局部和全身性不良反應(yīng)[6]。

1.2.3 免疫程序 5種滅活苗分別于肉仔雞7日齡免疫，劑量0.3ml/羽。不同佐劑制備的二聯(lián)滅活苗分組情況如表1。

表1 實驗分組情況

1.2.4 抗體測定 分別于7日齡免疫前，免疫后14、21、28和35d，每組采集30份雞血清分別測定其抗體效價。

1.2.5 HI抗體效價測定 按照《中華人民共和國獸藥典》附錄中血凝抑制標(biāo)準(zhǔn)檢測方法[6]，分別測定ND和AI(H9亞型)抗體水平，記錄實驗結(jié)果。

1.2.6 數(shù)據(jù)整理和分析 對檢測結(jié)果用Excel、SPSS20.0等軟件，進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計分析。HI效價≥4log2判定為合格。

2 結(jié)果

2.1 疫苗檢驗

疫苗檢驗結(jié)果詳見表2。由表2可見，各滅活苗的安全檢驗均符合國家標(biāo)準(zhǔn)。雞群精神狀態(tài)良好，采食正常；注射部位未見肉芽組織形成，疫苗吸收良好，機(jī)體未產(chǎn)生過敏反應(yīng)和局部不良反應(yīng)。

表2 不同佐劑制備的雞新城疫和禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活苗安全檢驗

2.2 抗體檢測情況

7日齡肉仔雞的抗新城疫病毒和H9亞型禽流感病毒的母源HI抗體效價幾何平均值分別為6.6log2和7.3log2。免疫后雞群抗ND和AI的抗體水平詳見表3和表4。

表3 實驗動物抗新城疫HI滴度測定情況 (nlog2)

注：表中數(shù)值均為HI滴度幾何平均值。

表4 實驗動物抗禽流感H9亞型HI滴度測定情況 (nlog2)

注：表中數(shù)值均為HI滴度幾何平均值。

2.2 免疫效果監(jiān)測情況

比較分析雞群抗新城疫病毒和H9亞型禽流感病毒的HI抗體水平結(jié)果，分別見圖1、圖2。

圖1 6組雞抗新城疫病毒HI抗體滴度變化

（1）由圖1可知，雞群中抗新城疫抗體5組最高，免疫后14d抗體水平均達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)。免疫后28d抗體水平均達(dá)到最高值，其中4組和5組效果最好。免疫后35d抗體效價均開始下降但4組較其他疫苗組抗體水平維持期較長，抗體衰減平緩。5組的抗體水平較其他疫苗組在免疫后21d能很快達(dá)到較高的抗體水平。1組較其他疫苗組抗體水平明顯較低，但仍能達(dá)到疫苗保護(hù)的國家標(biāo)準(zhǔn)。（2）由圖2可知，雞群中抗H9亞型禽流感病毒的抗體在免疫后14d均能達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)，其中2組和5組在免疫后28d抗體水平達(dá)到最高值。免疫后35d各疫苗組抗體水平均有下降，但5組表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，雞群中的抗體水平較其他疫苗組仍維持較高水平。其中，1組仍能達(dá)到疫苗的國家標(biāo)準(zhǔn)，但較其他疫苗組抗體水平明顯較低。

圖2 6組雞抗H9亞型禽流感病毒HI抗體滴度變化

3 討論與結(jié)論

（1）理想的疫苗應(yīng)生產(chǎn)成本低、易于運(yùn)輸和保存且易于應(yīng)用、無毒性反應(yīng)，能誘導(dǎo)良好的體液免疫，或能誘導(dǎo)良好的細(xì)胞介導(dǎo)免疫和黏膜免疫。鋁膠和石蠟油佐劑依舊是目前市場應(yīng)用廣泛的免疫佐劑，而滅活疫苗尤其是禽用滅活疫苗，因其抗體滴度維持時間較長，通常使用礦物油佐劑[7,8]。但是，不同佐劑對疫苗免疫效果的增強(qiáng)作用存在差異[9]，市場上有許多新型的佐劑，其便于應(yīng)用，免疫效果更佳。雞新城疫、流感二聯(lián)滅活苗是目前市場廣泛應(yīng)用的禽類疫苗，故我們選取5種佐劑與雞新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒抗原液按佐劑推薦使用劑量制備出五組二聯(lián)滅活苗，針對市場上的商品雞進(jìn)行免疫效果評價。（2）本研究旨在通過對雞群免疫后HI抗體的效價來評價目前市場上的多種免疫佐劑的使用效果。試驗表明，選取的五種佐劑所制備的二聯(lián)滅活疫苗均能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答反應(yīng)，抵御病毒攻擊，具有較好的免疫保護(hù)效果，同時無免疫副反應(yīng)，疫苗安全有效。（3）本試驗發(fā)現(xiàn)，7日齡(首免日齡)肉雞針對新城疫病毒和H9亞型流感病毒的母源抗體效價均較高，免疫后其抗體效價均急劇下降，其原因可能是疫苗抗原與母源抗體中和，因而造成疫苗對雞群免疫保護(hù)的真空期[10]。為盡量減少或避免母源抗體影響，建議定期檢測雛雞母源抗體，根據(jù)雛雞體內(nèi)母源抗體水平確定首免時間，優(yōu)化免疫程序。（4）本研究以田間試驗方式，對常規(guī)養(yǎng)殖的肉雞180只，按照預(yù)定的免疫程序進(jìn)行免疫，定期采集血清測定抗體效價，評估該疫苗的免疫效果。試驗結(jié)果顯示，第5組添加MF59佐劑的綜合表現(xiàn)最好，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體較快，免疫后14d即可達(dá)到保護(hù)水平且最終達(dá)到的抗體水平最高，抗體持續(xù)時間較長。使用ISA 70 VG佐劑和GEL02佐劑的二聯(lián)苗免疫效果也很好，使用ISA70VG佐劑雖在免疫后14d抗體水平達(dá)不到4log2，但后期刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體水平較高持續(xù)時間較長；而使用GEL 02佐劑二聯(lián)苗的雞群抗新城疫病毒效果較好，抗H9亞型禽流感病毒的HI在免疫后35d下降較快，抗體水平維持時間較短?？傮w來說，選用的幾種佐劑配制的二聯(lián)苗均能達(dá)到免疫保護(hù)效果，其中MF59更為突出，即使用納米粘膜佐劑的疫苗抗體水平維持時間較長。新型佐劑的作用機(jī)理和應(yīng)用效果還需在養(yǎng)殖場進(jìn)行進(jìn)一步驗證。

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（2018–09–18）

青島“人才特區(qū)”人才項目, 新型禽流感納米黏膜佐劑疫苗的開發(fā)

S851.3

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1007-1733(2019)01-0008-03