馮濤 劉道中 章安源 李有志 （山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所 山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東 濟(jì)南 250022）

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高效液相色譜法測(cè)定恩諾沙星注射液中的磺胺類藥物

馮濤 劉道中 章安源 李有志*（山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所 山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東 濟(jì)南 250022）

為建立恩諾沙星注射液中非法添加磺胺類藥物的高效液相色譜檢查方法，研究使用C18色譜柱(4.6mm× 250mm，3.5μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.025mol/L磷酸溶液(用三乙胺調(diào)節(jié)pH=3.0)，流速1.0ml/min，進(jìn)樣量10μl，柱溫30℃，定性采集波長(zhǎng)范圍200~400nm，定量波長(zhǎng)為270nm。結(jié)果表明，8種磺胺類藥物進(jìn)樣濃度在5~100μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(R2均大于0.999)，平均回收率在95%~107%之間，批內(nèi)批間RSD均小于5%，適用于恩諾沙星注射液中非法添加磺胺類藥物的測(cè)定。

高效液相色譜法 恩諾沙星注射液 磺胺類藥物

當(dāng)前，某些獸藥生產(chǎn)企業(yè)為了擴(kuò)大恩諾沙星藥物的臨床治療效果、隱蔽磺胺類藥物的使用，在恩諾沙星注射液中添加磺胺類藥物的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。由于部分磺胺類藥物的休藥期比恩諾沙星長(zhǎng)，在恩諾沙星注射液中非法添加磺胺類藥物，極易造成畜產(chǎn)品中殘留大量磺胺類藥物的嚴(yán)重后果，對(duì)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全和人民群眾身體健康造成危害。本研究旨在建立一種檢測(cè)通量高、專屬性強(qiáng)的高效液相色譜法，用于恩諾沙星注射液中磺胺類藥物的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設(shè)備 高效液相色譜儀Waters e2695(配二極管陣列檢測(cè)器)；電子天平(感量0.00001g、0.01g)。

1.1.2 對(duì)照品 磺胺嘧啶(含量99.5%，批號(hào)H0361504)、磺胺間甲氧嘧啶(含量99.4%，批號(hào)C0031007)、磺胺二甲嘧啶(含量99.2%，批號(hào)H0371406)、磺胺氯吡嗪鈉(含量100.0%，批號(hào)H0281308)、磺胺喹噁啉鈉(含量99.6%，批號(hào)H0251407)、磺胺甲噁唑(含量99.8%，批號(hào)H026110 6)、磺胺對(duì)甲氧嘧啶(含量100.0%，批號(hào)H0301107)、恩諾沙星(含量99.5%，批號(hào)H0361504)，均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；磺胺噻唑(含量100.0%，批號(hào)510091-201407)，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.1.3 陰性樣品 恩諾沙星注射液批號(hào)171222，規(guī)格10%，煙臺(tái)綠葉動(dòng)物保健品有限公司提供。

1.1.4 試劑 乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水符合GB/T6682一級(jí)水的規(guī)定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 高效液相色譜條件 色譜柱:C18色譜柱，4.6mm× 250mm，3.5μm，或性能相當(dāng)者；流動(dòng)相：A 乙腈、B 0.025mol/L磷酸溶液(用三乙胺調(diào)節(jié)pH=3.0)；流速：1.0ml/min；進(jìn)樣量：10μl；柱溫:30℃。定性采集波長(zhǎng)范圍：200~400nm[1]；定量波長(zhǎng)：270nm。液相色譜梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

1.2.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取8種磺胺類藥物與恩諾沙星對(duì)照品約100mg至100ml的容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(-20℃冰箱中保存，有效期3個(gè)月)；精密量取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5ml，分別置100ml容量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

1.2.3 陰性樣品溶液制備 精密量取不含磺胺類藥物的恩諾沙星注射液(批號(hào)171222，規(guī)格10%，煙臺(tái)綠葉動(dòng)物保健品有限公司提供)1ml置100ml容量瓶中，用稀釋液溶解并稀釋至刻度；精密量取5ml，置100ml容量瓶中，用稀釋液稀釋至刻度，作為陰性樣品溶液。

1.2.4 陽(yáng)性樣品溶液制備 精密量取不含磺胺類藥物的恩諾沙星注射液(批號(hào)171222，規(guī)格10%，煙臺(tái)綠葉動(dòng)物保健品有限公司提供)1ml置100ml容量瓶中，用稀釋液溶解并稀釋至刻度；精密量取上述溶液5ml、8種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各5ml，置100ml容量瓶中，用稀釋液稀釋至刻度，作為陽(yáng)性樣品溶液。

1.2.5 試劑空白溶液 將稀釋液作為試劑空白溶液。

1.2.6 稀釋液 乙腈：0.025mol/L磷酸溶液(用三乙胺調(diào)節(jié)pH=3.0)=17:83。

2 結(jié)果

2.1 專屬性試驗(yàn)[2]

精密吸取對(duì)照品溶液、陽(yáng)性樣品溶液、陰性樣品溶液、試劑空白溶液各10μl，注入液相色譜儀，在上述高效液相色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，陽(yáng)性樣品溶液色譜中恩諾沙星和磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺氯吡嗪鈉、磺胺喹噁啉鈉、磺胺噻唑、磺胺甲惡唑、磺胺對(duì)甲氧嘧啶峰的分離度符合要求；在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置出相同的峰；陰性樣品無干擾。結(jié)果見圖1~3。

2.2 峰純度及光譜圖匹配檢查圖

用磺胺嘧啶等8種磺胺類藥物對(duì)照品溶液建立光譜庫(kù)，對(duì)陽(yáng)性樣品溶液中與各磺胺類藥物對(duì)照品保留時(shí)間一致的色譜峰進(jìn)行峰純度檢查，純度角小于純度閾值，匹配角小于匹配閾值。

圖1 恩諾沙星和8種磺胺類藥物分離效果

圖2 陰性樣品色譜圖

圖3 試劑空白色譜圖

2.3 重復(fù)性

取不含磺胺類藥物的恩諾沙星注射液陰性樣品(批號(hào)171222，規(guī)格10%，煙臺(tái)綠葉動(dòng)物保健品有限公司提供)，添加8種磺胺類藥物至50μg/ml，按照上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，各組分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于0.5%，表明重復(fù)性好。

2.4 線性

精密量取8種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各5ml，置50ml容量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻；精密量取適量，用稀釋液逐級(jí)稀釋成100、50、25、10、5μg/ml的系列溶液，注入液相色譜儀，在上述高效液相色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)(x，μg/ml)，進(jìn)行線性回歸分析。8種磺胺類藥物回歸方程見表2。結(jié)果表明，8種磺胺類藥物在5~100μg/ml濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，R2均大于0.999。

2.5 回收率

取不含磺胺類藥物的恩諾沙星注射液陰性樣品(批號(hào)171222，規(guī)格10%，煙臺(tái)綠葉動(dòng)物保健品有限公司提供)，添加8種磺胺類藥物，分別至12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml三個(gè)濃度，每個(gè)濃度平行6份。分別注入液相色譜儀，在上述高效液相色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3。

表2 8種磺胺類藥物回歸方程

表3 恩諾沙星注射液中添加磺胺類藥物回收率 (mg/g、%)

回收試驗(yàn)結(jié)果表明，8種磺胺類藥物陽(yáng)性添加樣品的回收率在95%~107%之間，批內(nèi)批間變異系數(shù)均小于5%。

2.6 檢出限

按上述色譜條件，將對(duì)照品溶液進(jìn)一步稀釋，同時(shí)記錄色譜圖及光譜圖，報(bào)告溶液光譜圖失真的最大濃度，以此濃度的2倍作為方法的檢出限。磺胺類藥物各組分最大失真濃度及檢出限見表4。

表4 磺胺類藥物各組分最大失真濃度及檢出限 （μg/ml）

當(dāng)磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺喹噁啉鈉在檢出限濃度1.0μg/ml時(shí)，信噪比分別為57、80、24；當(dāng)磺胺二甲嘧啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶在檢出限濃度2.0μg/ml時(shí)，信噪比分別為110、82；磺胺甲噁唑在檢出限濃度3.0μg/ml時(shí)，信噪比為124；當(dāng)磺胺間甲氧嘧啶、磺胺氯吡嗪鈉在檢出限濃度5.0μg/ml時(shí)，信噪比分別為288、277。由于需要對(duì)被測(cè)試藥物優(yōu)先進(jìn)行定性判斷，故本研究檢出限以光譜圖失真為依據(jù)，與傳統(tǒng)以信噪比1:3做為檢出限有所不同。8種磺胺類藥物在檢出限(光譜最大失真濃度2倍)時(shí)信噪比均大于1:10[2]，故未對(duì)定量限再做規(guī)定。

2.7 判定依據(jù)

2.7.1 定性測(cè)定[1]在相同條件下，在200~400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，供試品溶液色譜圖中如出現(xiàn)與8種磺胺類藥物對(duì)照品保留時(shí)間一致的峰(差異小于等于±5%)，且為單一物質(zhì)峰(純度角小于純度閾值)；兩者紫外光譜圖無明顯差異(匹配角小于匹配閾值)，且最大吸收波長(zhǎng)一致(差異小于等于±2nm)則可判斷樣品中存在該磺胺類藥物。

2.7.2 定量測(cè)定 取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10μl注入液相色譜儀，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄270nm波長(zhǎng)處的色譜圖，外標(biāo)法定量。

3 討論

（1）色譜洗脫程序的選擇本方法檢測(cè)的磺胺嘧啶等8種磺胺類藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)相似，等度洗脫時(shí)，各藥物的分離度達(dá)不到要求。在分離度差的出峰時(shí)間段內(nèi)，通過降低流動(dòng)相中乙腈的比例，延長(zhǎng)洗脫時(shí)間，提高了分離度；反之，對(duì)相鄰藥物之間間隔時(shí)間過長(zhǎng)的時(shí)間段內(nèi)，適當(dāng)提高流動(dòng)相中乙腈的比例，縮短洗脫時(shí)間，改善了后面藥物的峰型。經(jīng)反復(fù)優(yōu)化，最終確定了液相色譜梯度洗脫程序。（2）波長(zhǎng)選擇磺胺嘧啶等8種磺胺類藥物的最大紫外吸收波長(zhǎng)不一致，將8種磺胺類藥物同時(shí)添加到陰性恩諾沙星注射液中制成的陽(yáng)性樣品溶液注入液相色譜儀，在200~400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，在三位圖譜中提取不同檢測(cè)波長(zhǎng)的色譜圖進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示在270nm波長(zhǎng)處的色譜圖中各磺胺類藥物峰高均勻一致，因此選擇270nm作為定量檢測(cè)波長(zhǎng)。

本研究建立的UPLC法檢測(cè)恩諾沙星注射液中磺胺類藥物，方法簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，可為恩諾沙星注射液中非法添加磺胺類藥物的測(cè)定。

[1] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.恩諾沙星注射液中非法添加雙氯芬酸鈉檢查方法[s].中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第2398號(hào),1-2.

[2] 中華人民共和國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典[s].2015年版一部，315-319.

（2018–08–07）

S859.79

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1007-1733(2019)01-0003-03