王 慧,趙 江,楊勝楠,張曉寒,程 靜,王 浩

(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457)

肌醇是羥基環(huán)己醇,屬于水溶性B族維生素,共有9種同分異構(gòu)體[1],而D-手性肌醇(DCI)在自然界中廣泛存在于蕎麥、大豆等植物中,屬于光學(xué)活性體的一種肌醇[2]。DCI具有降血糖、抗炎、抗癌、提高耐力等多種生物活性,有研究發(fā)現(xiàn),在果蠅飲食中添加DCI可以顯著延長果蠅的壽命[3],也有文獻報道,一定劑量的DCI能夠促進胰島素抵抗HepG2細胞對葡萄糖的吸收[4]。但近年來,對于DCI的研究多在降血糖、抗衰老方面,對高糖膳食導(dǎo)致氧化損傷的機體延緩衰老的作用未見報道。

自由基學(xué)說認為,機體代謝過程中產(chǎn)生的大量ROS自由基能夠?qū)е录毎煞职l(fā)生氧化損傷從而導(dǎo)致衰老。而機體在受到各種氧化應(yīng)激的過程中會產(chǎn)生ROS自由基,ROS積累使氧化系統(tǒng)失衡,引起機體衰老[5]。在高脂環(huán)境中,生物膜成分更易受到自由基的攻擊而發(fā)生過氧化損傷,從而使機體加速衰老[6]。而抗氧化劑可以清除體內(nèi)多余的自由基,延緩氧化損傷。

表1 線蟲抗衰老基因 mRNA 表達水平測定用 PCR 引物Table 1 PCR primers used to measure the mRNA expression levels of anti-aging genes in Caenorhabditis elegans

秀麗隱桿線蟲是一種小型土壤線蟲,其遺傳信息與信號通路相對保守[7],生命周期短暫,適合短期內(nèi)構(gòu)建驗證實驗,而且線蟲隨著年齡的增加,會表現(xiàn)出行為遲緩,生理功能減退等現(xiàn)象。因此,秀麗隱桿線蟲是研究衰老作用比較理想的模式生物[8]。

因此,本實驗以秀麗隱桿線蟲為實驗?zāi)Ｊ缴?研究DCI對高糖氧化損傷的線蟲延緩衰老的作用,觀察其正常壽命變化并進一步研究其保護機制,為相關(guān)DCI的抗氧化產(chǎn)品開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生型秀麗隱桿線蟲 北京生命科學(xué)研究所王曉晨研究員贈送;D-手性肌醇 上海諾金科生物科技有限公司(純度 95%);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒、過氧化氫酶(catalase,CAT)試劑盒 南京建成生物工程研究所;Trizol試劑、cDNA合成試劑盒和SYBR Green 寶生物生物工程有限公司。

HWS-850智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱 寧波海曙賽福實驗儀器廠;UVmini-1240紫外/可見分光光度計 日本島津公司;Real Time-PCR儀 美國BIO-RAD公司;倒置熒光顯微鏡 Olympus。

1.2 實驗方法

1.2.1 線蟲的培養(yǎng) 線蟲基礎(chǔ)NGM培養(yǎng)基的培養(yǎng)基成分參考文獻[9];高糖培養(yǎng)基:在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入1%的葡萄糖?？瞻讓φ战M線蟲在基礎(chǔ)NGM培養(yǎng)基中培養(yǎng),高糖模型組線蟲在高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng),實驗組線蟲則分別培養(yǎng)在添加0、5、10、20 μm/L的DCI的高糖培養(yǎng)基中。

1.2.2 油紅O染色實驗 將0.5 g油紅O染料溶解于100 mL異丙醇中,配制成油紅O溶液,將油紅O溶液與蒸餾水以3∶2 (v/v)的比例混合,沉淀過濾后作為儲備液備用。收集同期化線蟲,按照壽命實驗中的飼養(yǎng)方法培養(yǎng)。當(dāng)線蟲分別培養(yǎng)至10 d時,用PBS緩沖液沖洗收集線蟲。線蟲首先用多聚甲醛固定,-80 ℃下冷凍15 min后,于43 ℃水浴解凍,PBS沖洗3次后,用1% Triton X-100的油紅O儲備液浸泡30 min,PBS沖洗后,將空白對照組與高糖模型組線蟲挑至1%濃度的瓊脂糖凝膠上,于倒置熒光顯微鏡下觀察脂滴含量并拍照[10]。

1.2.3 壽命實驗 將5 d齡體內(nèi)帶卵的線蟲用M9緩沖液沖下,加入裂解液裂解后,20 ℃靜置過夜,得到L1期線蟲,將其接種到涂有大腸桿菌OP50的NGM培養(yǎng)基上,20 ℃培養(yǎng)48～54 h,即得到用于實驗的L4期線蟲。將同期化線蟲隨機分為5組:空白對照組、高糖模型組和DCI處理組(5、10和20 μm/L),每組 3 板,每板30 條。每2 d更換一次相應(yīng)的新鮮培養(yǎng)基,每組培養(yǎng)基需加入150 mm/L的五氟尿嘧啶來抑制線蟲繁殖,同時觀察線蟲的生存狀況,直至線蟲全部死亡為止[9]。

1.2.4 脂褐素水平的測定 收集同期化線蟲,按照壽命實驗中的飼養(yǎng)方法分別培養(yǎng)10 d。配制1%濃度的瓊脂糖凝膠,每個平面挑取線蟲4～5條,NaN3麻醉,倒置熒光顯微鏡下,激發(fā)340～380 nm,發(fā)射430 nm,觀察線蟲體內(nèi)脂褐素水平,拍攝熒光圖片,利用Image J軟件分析處理線蟲體內(nèi)脂褐素?zé)晒馑健?/p>

1.2.5 ROS水平的測定 收集同期化線蟲,按照壽命實驗中的飼養(yǎng)方法培養(yǎng)。當(dāng)線蟲分別培養(yǎng)至10 d時,用PBS緩沖液沖洗收集各組線蟲于避光條件下加入DCFDA 探針儲備液,PBS沖洗3次后,于激發(fā)485 nm、發(fā)射530 nm波長條件下,拍攝熒光圖片[11]。

1.2.6 線蟲抗氧化酶活力的測定 與壽命生存試驗培養(yǎng)方法相同,培養(yǎng)6 d后,轉(zhuǎn)移至EP管中,將線蟲用生理鹽水冰浴勻漿后,4 ℃、2500 r/min 離心,收集上清液。采用試劑盒測定線蟲體內(nèi)SOD酶和CAT酶活力。

1.2.7 線蟲體內(nèi)抗氧化基因mRNA表達水平的測定 將同期化2 d齡線蟲培養(yǎng)6 d后,轉(zhuǎn)移至EP管中。生理鹽水洗滌后放入-80 ℃冰箱備用。利用Trizol法提取mRNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,再利用Real-time PCR法以gpd-1為看家基因,檢測age-1、daf-2、sir-2.1、sod-3、daf-16、ctl-1基因mRNA表達水平。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用 SPSS statistics17.0 軟件進行統(tǒng)計分析,單因素方差分析進行顯著性檢驗,p<0.05認為存在顯著性差異,p<0.01認為存在極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 高糖對線蟲體內(nèi)脂滴的影響

油紅O作為一種油性染料,可以高度溶解于脂肪。由圖1可知,經(jīng)過高糖喂養(yǎng)之后的線蟲體內(nèi)脂滴明顯增多,且線蟲個體較對照組相比較大。Matsuyama等[12]通過研究表明,一定濃度的葡萄糖可以顯著增加線蟲體內(nèi)的脂肪積累。而線蟲在高脂情況下,生物膜更易受到自由基攻擊而發(fā)生氧化損傷,加速衰老,Schultz等[13]也以葡萄糖代謝功能障礙的線蟲為模型發(fā)現(xiàn),葡萄糖干預(yù)后能夠顯著降低線蟲的壽命。

圖1 200x顯微鏡下高糖對線蟲體內(nèi)脂滴的影響Fig.1 Effect of high glucose on lipid droplet in C. elegans by 200x microscope

2.2 DCI對高糖損傷線蟲壽命的影響

從表2中可以看出,喂養(yǎng)1%的葡萄糖后,高糖模型組線蟲的平均壽命與半數(shù)死亡時間與對照組相比極顯著降低(p<0.01)。與模型組相比,喂養(yǎng)DCI的高糖損傷組線蟲平均壽命和最高壽命與半數(shù)死亡時間均有所增加,且DCI攝入量與損傷組線蟲的壽命呈劑量依賴關(guān)系,其中20 μm/L的DCI組高糖損傷線蟲的平均壽命和最高壽命均顯著升高(p<0.05)。因此,DCI能夠延長高糖損傷線蟲的存活時間,延緩氧化損傷過程,對其有一定的保護作用。此外,HadaB等[3]也通過研究發(fā)現(xiàn),喂養(yǎng)一定劑量的DCI能夠顯著延長果蠅的壽命。

表2 DCI對高糖損傷線蟲壽命的影響Table 2 Effect of DCI on the lifespan in C. elegans damaged by high glucose

2.3 DCI對高糖損傷線蟲脂褐素含量的影響

線蟲體內(nèi)脂褐素隨年齡增長而增多,可作為線蟲機體衰老有效的生物標(biāo)志。由圖2可知,高糖損傷組線蟲與對照組相比脂褐素水平極顯著增加(p<0.01)。因此,高糖喂食能夠加速線蟲的機體衰老。與高糖損傷模型組相比,高糖給藥組脂褐素?zé)晒鈴姸冉档?其中10 μm/L的DCI組線蟲體內(nèi)的脂褐素?zé)晒庵递^高糖組相比顯著降低(p<0.05),20 μm/L的DCI組線蟲體內(nèi)的脂褐素?zé)晒庵递^高糖組相比極顯著降低了21%(p<0.01)。因此,一定含量的DCI能夠有效降低高糖損傷線蟲體內(nèi)的脂褐素水平,延緩其機體衰老。

圖2 DCI對高糖損傷線蟲體內(nèi)脂褐素相對含量的影響Fig.2 Effect of DCI on the content lipofuscin in high glucose-treated C. elegans注:脂褐素相對含量即線蟲體內(nèi)脂褐素自發(fā)熒光面積與線蟲身體面積之比;和對照組相比,# p<0.05,## p<0.01;和模型組相比,*p<0.05,**p<0.01。

2.4 DCI對高糖損傷線蟲體內(nèi)ROS水平的影響

由圖3可知,與對照組相比,高糖損傷組線蟲ROS水平極顯著升高(p<0.01)。機體在受到氧化損傷時會產(chǎn)生ROS自由基,ROS積累使氧化系統(tǒng)失衡,引起機體衰老。而給予高糖損傷線蟲5、10 μm/L的DCI后,ROS相對含量與模型組相比顯著降低(p<0.05),給予高糖損傷線蟲20 μm/L的DCI后,ROS相對含量與模型組相比極顯著降低(p<0.01)。因此DCI能降低線蟲體內(nèi)的ROS含量,有效降低高糖膳食對果蠅的氧化損傷作用。

圖3 DCI對高糖損傷線蟲體內(nèi)ROS相對含量的影響Fig.3 Effect of DCI on the content ROSin C. elegans damaged by high glucose注:ROS相對含量即線蟲體內(nèi)ROS發(fā)射熒光面積與線蟲身體面積之比;和對照組相比,#p<0.05,##p<0.01;和模型組相比,*p<0.05,**p<0.01。

2.5 DCI對高糖損傷線蟲抗氧化酶活力的影響

SOD和CAT是線蟲體內(nèi)兩種重要的抗氧化酶[14]。由圖4可知,給予一定劑量的DCI后,高糖損傷線蟲的抗氧化酶活力與模型組相比有所升高,其中喂養(yǎng)20 μm/L DCI的線蟲體內(nèi)的SOD活力和CAT活力分別提高了28.9%和58.9%。因此一定劑量的DCI能夠增強線蟲的抗氧化性,這可能是其發(fā)揮抗衰老的作用機制之一。此外張澤生等[15]研究了DCI的不同劑量對小鼠體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的影響也發(fā)現(xiàn),DCI能夠顯著升高小鼠不同組織的SOD、CAT活力,對衰老的小鼠具有延緩衰老的效果。

圖4 DCI對高糖線蟲SOD、CAT酶活力的影響Fig.4 Effect of DCI on SOD and CAT activity in C. elegans damaged by high glucose注:和對照組相比,# p<0.05,## p<0.01;和模型組相比,*p<0.05,**p<0.01。

2.6 DCI對高糖損傷線蟲抗衰老相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

由圖5可知,與模型組相比,喂藥組高糖損傷線蟲的age-1、daf-2基因表達水平降低,其中給予20 μm/L DCI的高糖損傷組線蟲體內(nèi)的age-1基因表達水平極顯著下調(diào)(p<0.01),而給予20 μm/L DCI的高糖損傷組線蟲體內(nèi)的sir-2.1、sod-3、daf-16、ctl-1基因與模型組相比顯著上調(diào)(p<0.05)。胰島素信號通路可以調(diào)控線蟲衰老,而daf-2、age-1、daf-16基因是該通路中與線蟲壽命有關(guān)的信號因子。daf-2是胰島素/胰島素樣生長因子受體家族的同族體[16],age-1為哺乳動物磷脂酰激酶-3-羥基激酶的同族體[17],daf-16為叉頭轉(zhuǎn)錄因子的同族體,其靶基因為sod-3、ctl-1[18-19]。在胰島素信號通路中,線蟲體內(nèi)的DAF-2受體與胰島素配體結(jié)合后可磷酸化AGE-1[17],AGE-1又可通過AKT-1/AKT-2/SGK-1通路引起DAF-16磷酸化[20]。Abbas等[21]研究發(fā)現(xiàn),兒茶素能夠影響線蟲體內(nèi)的daf-2 胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,從而減少線蟲氧化損傷并延長其壽命。此外近些年也有研究表明,齊墩果酸能夠激活daf-16基因延長線蟲壽命,同時,sod-3、ctl-1基因的mRNA也過度表達[22]。ctl-1是編碼細胞質(zhì)基質(zhì)過氧化氫酶的基因,其過度表達可以延長線蟲壽命,提高氧化應(yīng)激耐受能力[23]。而sir-2.1作為線蟲體內(nèi)的長壽基因,其過度表達可以增強線蟲氧化應(yīng)激抵抗,Berdichevsky等[24]研究發(fā)現(xiàn),sir-2.1基因突變的線蟲對應(yīng)激表現(xiàn)更敏感。因此,一定劑量的DCI能夠通過調(diào)節(jié)與壽命相關(guān)的基因來延長高糖損傷組線蟲的壽命,對其起到一定的保護作用。

圖5 DCI對高糖損傷線蟲體內(nèi)延緩衰老相關(guān)基因mRNA表達水平的影響Fig.5 Effect of DCI on mRNA expression level about anti-aging genes in C. elegans damaged by high glucose注:和對照組相比,# p<0.05,## p<0.01;和模型組相比,*p<0.05,**p<0.01。

3 結(jié)論

本實驗結(jié)果表明,10、20 μm/L的DCI能夠顯著延長高糖損傷線蟲的平均壽命(p<0.05),而20 μm/L的DCI極顯著降低線蟲體內(nèi)脂褐素和ROS水平(p<0.01)。此外,20 μm/L劑量組氧化損傷線蟲體內(nèi)SOD和CAT活力顯著增加(p<0.05),age-1、daf-2基因mRNA 表達水平顯著下調(diào)(p<0.05),而sir-2.1、sod-3、daf-16、ctl-1基因的mRNA表達水平顯著上調(diào)(p<0.05)。因此DCI對高糖導(dǎo)致氧化損傷線蟲有保護作用,而延緩線蟲衰老的作用機制可能與其調(diào)控抗衰老相關(guān)基因的表達有關(guān)。本實驗結(jié)果為相關(guān)DCI抗氧化保健產(chǎn)品開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù),但本次研究只局限于生理表層和基因表達方面,將來更需要通過蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)實驗進行評價分析,為DCI在食品工業(yè)中的開發(fā)提供理論幫助。