曹小燕,楊海濤

(1.陜西理工大學(xué)陜西省催化基礎(chǔ)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西漢中 723000;2.陜西理工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,陜西漢中 723000)

薺菜(Capsellabursa-pastoris.)是十字花科植物,在我國(guó)分布廣泛[1]。薺菜作為一種藥食同源植物,富含黃酮[2]、多糖[3]、生物堿[4]、氨基酸[5]、微量元素[6]、多酚[7]等多種活性成分,其中多酚是廣泛分布于植物體內(nèi)的多元酚類次生代謝產(chǎn)物,具有抗氧化活性、抑菌、抗腫瘤、降血糖和調(diào)節(jié)血脂等多種生物活性[8-9]。植物多酚的提取與分離研究,可為天然抗氧化劑和多酚保健食品的開(kāi)發(fā)提供原料。目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)植物多酚的提取技術(shù)已有較多的研究如溶劑浸提法[10]、微波提取[11]、超聲波輔助提取法[12]、酶輔助提取法[13]、超臨界流體萃取法[14]等,其中超聲波輔助提取法具有提取時(shí)間短、效率高、成本低和降低高溫對(duì)提取物的影響等優(yōu)點(diǎn)[15],但利用此法提取薺菜多酚的研究目前鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究以野生薺菜為原料,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面分析試驗(yàn)優(yōu)化了薺菜多酚的提取工藝;借助體外抗氧化模型,評(píng)價(jià)了薺菜多酚的自由基清除活性,為薺菜多酚功能性食品和保健品的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

薺菜 2017年3～5月采摘于漢中連城山;沒(méi)食子酸、Folin-Ciocalteu試劑、抗壞血酸、硫酸亞鐵 阿拉丁試劑;其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純,南京化學(xué)試劑有限公司。

EL104型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;Cary50紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)瓦里安中國(guó)有限公司;WGL-125B型電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;SB-4200DTD型超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司;RE-2A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;JXL-2S-6A數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市金祥龍電子有限公司;SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 薺菜預(yù)處理及多酚的提取工藝 采集開(kāi)花期薺菜全草,除雜后樣品分為四份(根、葉、花和全草)置于50 ℃烘箱中烘干至恒重,粉碎后過(guò)60目篩于4倍體積的石油醚中脫脂,烘干備用。準(zhǔn)確稱取一定量的脫脂樣品于50 mL錐形瓶中,加入一定體積的提取溶劑在一定的超聲溫度和功率條件下,超聲輔助提取一定的時(shí)間,于2500 r/min離心機(jī)中離心10 min,得到薺菜多酚的提取液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮提取液,蒸餾水定容于一定體積的容量瓶中,得到薺菜多酚的待測(cè)液。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 固定提取時(shí)間30 min,提取溫度40 ℃,料液比1∶30 (g∶mL),超聲功率280 W,提取溶劑為甲醇50%、乙醇50%、乙酸乙酯50%、正己烷50%和水,考察不同提取溶劑對(duì)薺菜多酚提取量的影響;固定提取溶劑為乙醇,提取時(shí)間30 min,提取溫度40 ℃,料液比1∶30 (g∶mL),超聲功率280 W,乙醇濃度為30%、40%、50%、60%、70%,考察乙醇濃度對(duì)薺菜多酚提取量的影響;固定乙醇濃度50%,提取溫度40 ℃,料液比1∶30 (g∶mL),超聲功率280 W,提取時(shí)間為10、20、30、40、50 min,考察提取時(shí)間對(duì)薺菜多酚提取量的影響;固定乙醇濃度50%,提取時(shí)間30 min,料液比1∶30 (g∶mL),超聲功率280 W,提取溫度為40、50、60、70、80 ℃,考察提取溫度對(duì)薺菜多酚提取量的影響;固定乙醇濃度50%,提取時(shí)間30 min,提取溫度40 ℃,超聲功率280 W,料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 (g∶mL),考察料液比對(duì)薺菜多酚提取量的影響;固定乙醇濃度50%,提取時(shí)間30 min,提取溫度40 ℃,料液比1∶30 (g∶mL),超聲功率為240、280、320、360、400 W,考察超聲功率對(duì)薺菜多酚提取量的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 以薺菜多酚的提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo),結(jié)合單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的原理,以乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間和提取溫度四個(gè)因素,設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)[16],優(yōu)化超聲輔助提取薺菜多酚的提取工藝。響應(yīng)面分析因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.4 多酚含量的測(cè)定

1.2.4.1 繪制沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 參考郭彩霞等[17]實(shí)驗(yàn)方法稍作修改。精確配制1 mg/mL的沒(méi)食子酸母液,依次配制成質(zhì)量濃度為0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035、0.040、0.045、0.050、0.055 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。于10 mL離心管中加入上述標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL,0.1 mg/mL福林酚試劑5 mL,搖勻后反應(yīng)6 min。加入75 mg/mL Na2CO3溶液4 mL,避光靜置60 min,以蒸餾水做空白對(duì)照,于756 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)其吸光度值。以沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程為:y=151.57x+0.0271(R2=0.9998),用于評(píng)價(jià)薺菜多酚的質(zhì)量濃度。

1.2.4.2 薺菜多酚的提取量測(cè)定 依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法,測(cè)定待測(cè)液中薺菜多酚的質(zhì)量濃度,依據(jù)下列公式,計(jì)算薺菜多酚的提取量。

K=a×b/m

式中,K為薺菜多酚的提取量,用mg/g表示;a是薺菜提取液中的多酚質(zhì)量濃度(mg/mL);b為待測(cè)液體積(mL);m為所稱取薺菜樣品的質(zhì)量(g)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均為測(cè)定三次、取平均值,采用Origin 7.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取溶劑對(duì)薺菜多酚提取量的影響 由圖1可知,5種提取溶劑對(duì)薺菜多酚提取量的影響次序?yàn)橐掖?丙酮>甲醇>乙酸乙酯>水,其中乙醇所得的多酚提取量最高為(21.93±0.15) mg/g,故提取溶劑選擇乙醇。

圖1 不同提取溶劑對(duì)薺菜多酚提取量的影響Fig.1 Effects of different extraction solvents on the contents of polyphenols from Capsella bursa-pastoris

2.1.2 乙醇濃度對(duì)薺菜多酚提取量的影響 由圖2可知,薺菜多酚的提取量隨乙醇濃度的增加而增加(30%～50%),50%時(shí)達(dá)到峰值。當(dāng)乙醇濃度增大時(shí),降低了溶劑體系的極性,更容易破壞植物體內(nèi)多酚類物質(zhì)與多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)間的氫鍵,促使多酚類物質(zhì)的溶出增加;繼續(xù)增加乙醇濃度達(dá)到最大值時(shí),溶劑極性較弱,增加了薺菜中的醇溶性物質(zhì)與多酚的競(jìng)爭(zhēng)性溶出[22]。故乙醇濃度選擇50%。

圖2 乙醇濃度對(duì)薺菜多酚提取量的影響Fig.2 Effects of ethanol concentration on the contents of polyphenols from Capsella bursa-pastoris

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)薺菜多酚提取量的影響 由圖3可知,在10～30 min范圍內(nèi),隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),薺菜多酚的提取量快速增加,30 min時(shí)達(dá)到最大值。隨著提取時(shí)間的增加,薺菜中的多酚類物質(zhì)慢慢溶出,30 min時(shí)多酚的溶出完全,進(jìn)一步延長(zhǎng)提取時(shí)間,由于超聲波的空化作用、機(jī)械效應(yīng)促使多酚類物質(zhì)發(fā)生氧化、聚合等副反應(yīng)[23],促使提取量降低。因此選擇超聲時(shí)間30 min為宜。

圖3 提取時(shí)間對(duì)薺菜多酚提取量的影響Fig.3 Effects of extract time on the contents of polyphenols from Capsella bursa-pastoris

2.1.4 提取溫度對(duì)薺菜多酚提取量的影響 由圖4可知,在40～60 ℃范圍內(nèi),隨提取溫度的升高,薺菜多酚的提取量快速增加,提取溫度60 ℃時(shí)達(dá)到峰值。當(dāng)提取溫度升高時(shí),促使提取體系內(nèi)分子的平均動(dòng)能增加,多酚類物質(zhì)間的傳質(zhì)增多,從而增加了多酚的提取量,當(dāng)提取溫度過(guò)高時(shí),高溫會(huì)引起多酚類物質(zhì)的氧化而破壞[24]。故選取60 ℃為較佳的提取溫度。

圖4 提取溫度對(duì)薺菜多酚提取量的影響Fig.4 Effects of extract temperature on the contents of polyphenols from Capsella bursa-pastoris

2.1.5 料液比對(duì)薺菜多酚提取量的影響 由圖5可知,在液料比1∶10～1∶30 (g∶mL)范圍內(nèi),隨著料液比的變化,薺菜多酚的提取量快速增加,1∶30 (g∶mL)時(shí)達(dá)到最大值。隨著溶劑的增多,增加了薺菜中多酚類物質(zhì)與溶劑的濃度差,促使了多酚類物質(zhì)的溶出;當(dāng)體系中的溶劑量過(guò)多時(shí),使得多酚類物質(zhì)在后處理濃縮過(guò)程中的損失增加[25]。故料液比選擇為1∶30 (g∶mL)。

圖5 料液比對(duì)薺菜多酚提取量的影響Fig.5 Effects of material-liquid ratio on the contents of polyphenols from Capsella bursa-pastoris

2.1.6 超聲功率對(duì)薺菜多酚提取量的影響 由圖6可知,當(dāng)超聲功率在240～280 W時(shí),薺菜多酚的提取量隨超聲功率的增大而增加,280 W時(shí)多酚的提取量達(dá)到峰值。繼續(xù)加大超聲功率,多酚的提取量緩慢降低,因?yàn)樵诟叱暪β首饔孟?多酚類的物質(zhì)成分遭到破壞,從而多酚提取量降低,故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中固定超聲功率為280 W。

圖6 超聲功率對(duì)薺菜多酚提取量的影響Fig.6 Effects of ultrasonic power on the contents of polyphenols from Capsella bursa-pastoris

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面模型的建立與分析 根據(jù)Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),得到了27組薺菜多酚的提取量如表2所示,并利用Design Expert 8.05軟件對(duì)所得到的27組數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析得方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。對(duì)表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,得到薺菜多酚的提取量(Y)為響應(yīng)值,乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)和提取溫度(D)為自變量的四元二次回歸模型為:

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design for response surface analysis and corresponding experimental data

Y=-65.03625+0.37617A+2.61217B-1.27100C+2.08833D+0.014125AB+0.016325AC+9.62500E-003AD-5.7500E-004BC-0.021325BD+0.015575CD-0.018763A2-0.031513B2-6.93750E-003C2-0.020337D2

表3 響應(yīng)面的方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis result of regression surface analysis

2.2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過(guò)分析響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ?預(yù)測(cè)得到薺菜多酚提取量的最大響應(yīng)值為Y=28.35 mg/g,即乙醇濃度為48.11%、料液比為1∶33.11 (g∶mL)、提取時(shí)間為27.40 min,提取溫度為56.84 ℃,為了便于實(shí)際操作,設(shè)定乙醇濃度為48%,料液比1∶33 (g∶mL)、提取時(shí)間為27 min,提取溫度為57 ℃,平行三次實(shí)驗(yàn)得到薺菜多酚提取量的平均值為28.33 mg/g,與模型預(yù)測(cè)值28.35 mg/g相比,其相對(duì)誤差為0.07%。以此最佳條件,評(píng)價(jià)薺菜不同部位的多酚提取量見(jiàn)表4。由表4可以看出,不同部位的薺菜多酚提取量不同,其多酚含量由高到低的順序?yàn)?薺菜葉>全草>花>根。其中人們常吃的薺菜葉中的多酚提取量最高,為充分開(kāi)發(fā)功能性薺菜食品提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

表4 不同部位薺菜多酚提取量的測(cè)定結(jié)果Table 4 Determination results of polyphenol extraction yield in different parts of Capsella bursa-pastoris

2.3 薺菜多酚的體外抗氧化活性分析

2.3.1 薺菜多酚對(duì)羥基自由基(·OH)的清除能力 采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法評(píng)價(jià)了薺菜多酚清除·OH的能力。由圖7可知,薺菜多酚具有明顯的清除·OH的能力,但清除活性弱于同濃度條件下的VC溶液。當(dāng)樣品濃度為0.21 mg/mL時(shí),VC溶液對(duì)·OH的清除率高達(dá)80.82%±0.40%,其清除IC50值為(0.08±0.01) mg/mL;而同濃度條件下薺菜多酚提取液的清除率為61.32%±0.45%,其清除IC50值為(0.17±0.01) mg/mL,說(shuō)明薺菜多酚對(duì)·OH具有較強(qiáng)的清除能力。

圖7 薺菜多酚與VC對(duì)·OH清除活性Fig.7 Scavenging ·OH activity ofCapsella bursa-pastoris polyphenols and VC

圖8 薺菜多酚與VC對(duì)清除活性Fig.8 Scavenging activity ofCapsella bursa-pastoris polyphenols and VC

2.3.3 薺菜多酚對(duì)亞硝酸鹽(NaNO2)清除能力 在弱酸性條件下,亞硝酸鹽和對(duì)氨基苯磺酸能發(fā)生重氮化反應(yīng),再與鹽酸萘乙二胺偶合生成紅色化合物,通過(guò)測(cè)定540 nm處吸光度值的變化,得到反應(yīng)液中亞硝酸鈉的含量。由圖9可知,在所測(cè)定的實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),薺菜多酚和VC溶液對(duì)亞硝基的清除率均隨其濃度的增加而增加。薺菜中的多酚提取物具有明顯的清除亞硝酸鹽能力,但其清除效果弱于同濃度條件下的VC溶液。在濃度為42 μg/mL時(shí),VC溶液對(duì)亞硝基的清除率78.76%±1.27%,其清除IC50值為(16.2±0.01) μg/mL;而薺菜多酚提取液的清除率為75.05%±1.23%,其清除IC50值為(18.9±0.02) μg/mL。表明薺菜多酚具有一定的清除亞硝酸鹽活性。

圖9 薺菜多酚與VC對(duì)NaNO2清除活性Fig.9 Scavenging NaNO2 activity ofCapsella bursa-pastoris polyphenols and VC

2.3.4 薺菜多酚的還原能力 由圖10可知,在測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),薺菜多酚的還原力隨著質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)且量效關(guān)系顯著,但弱于同濃度條件下VC溶液的還原能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明薺菜多酚具有一定的還原能力,證明薺菜多酚提取液是一種良好的自由基清除劑,具有一定的抗氧化活性。

圖10 薺菜多酚和VC的還原能力Fig.10 Reduction ability of Capsellabursa-pastoris polyphenols and VC

3 結(jié)論

薺菜多酚提取的最佳工藝條件為:乙醇濃度為48%,超聲提取時(shí)間為27 min,提取溫度為57 ℃,料液比為1∶33 (g∶mL),得到薺菜多酚的提取量為(28.33±0.08) mg/g。在此最佳工藝條件下,測(cè)定了薺菜葉、花、根的多酚提取量分別為(30.95±0.04)、(27.52±0.14)、(20.42±0.03) mg/g。

本研究不足之處在于對(duì)薺菜多酚的抗氧化評(píng)價(jià)為體外活性評(píng)價(jià)模型,下一步應(yīng)采用細(xì)胞或小鼠等體內(nèi)模型評(píng)價(jià)其抗氧化性,為其生理學(xué)活性的合理解釋提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。