馮 悅,馮 穎

(沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院,遼寧沈陽 110866)

多酚作為植物體內(nèi)具有良好抗氧化性的功能成分[1-2],還具有延緩衰老、抗炎、抗病毒、抗輻射、護肝、抗癌和保護心血管等生物活性[3-4]。在植物原料中,除游離酚外,還有部分酚類物質(zhì)是以與纖維素、果膠、蛋白等結(jié)合態(tài)的形式存在,這些酚類物質(zhì)即結(jié)合酚[5]。結(jié)合酚在人體內(nèi)經(jīng)酶系水解轉(zhuǎn)化為游離酚后被人體吸收,具有游離酚清除自由基、降血壓等活性[6-7]。它不能被胃和小腸消化吸收,但可在結(jié)腸中釋放并產(chǎn)生生物活性[8-9],相對于游離酚,結(jié)合酚類物質(zhì)經(jīng)腸道微生物菌群發(fā)酵作用后可能發(fā)揮更強的生物活性[10]。

目前關(guān)于植物多酚的研究報道主要停留在游離酚層面,因為以結(jié)合態(tài)形式存在,不能直接被有機溶劑萃取,因此結(jié)合酚常常被忽略,這不僅使所測定的植物多酚總量低于其實際值,而且也降低了植物多酚的實際應(yīng)用價值。開展植物結(jié)合酚提取方法的研究,對于評價植物多酚的總量及進一步利用植物結(jié)合酚進行生物活性研究具有十分重要的意義,因此成為近年來植物多酚領(lǐng)域研究的一個焦點。結(jié)合酚提取方法有堿水解、酸水解、酶水解,以堿水解的數(shù)量最多,但沒有確鑿證據(jù)評定哪種方法更好[5]。其中,徐菲等[11]采用堿法和酸法提取青稞麩皮中結(jié)合酚,發(fā)現(xiàn)酸水解得到的多酚總量(325.104 mg/100 g)遠遠高于堿水解(115.382 mg/100 g)。張金宏等[12]采用堿水解、酸水解和單寧酶水解法提取蘋果渣中結(jié)合酚,發(fā)現(xiàn)酶水解法和酸水解法比堿水解法更適合于提取蘋果渣中結(jié)合酚,單體酚總量分別為179.444、255.266和152.264 μg/g。

甘薯薯塊含有豐富的糖類、膳食纖維、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分[13-15],同時還富含綠原酸[16-17]、花色苷[18]、黃酮[19]、多糖[20]等多酚活性物質(zhì)而具有抗氧化、預防癌癥、減少慢性疾病、降低血壓、抗炎、抗菌等多種保健功能[21]。目前,關(guān)于甘薯結(jié)合酚提取工藝參數(shù)及其在不同品種中的含量分布情況缺乏,項目組前期曾采用堿水解法提取紫薯結(jié)合酚,考慮到堿水解法提取過程中需要輔助磁力攪拌不利于工業(yè)化生產(chǎn),且堿水解法得到的紫薯結(jié)合酚提取液有一定粘度,流動性較差。因此,本研究以紫薯“遼薯20”為原料,采用酸水解法將其結(jié)合酚從原料組織中釋放出來,進一步采用乙酸乙酯對其進行萃取,利用響應(yīng)面法優(yōu)化了結(jié)合酚的酸水解法提取工藝。在此基礎(chǔ)上,對12個不同甘薯品種中的游離酚和結(jié)合酚進行了提取測定。開展該研究有利于開展不同品種甘薯中結(jié)合酚的提取并明確其含量,對進一步評估不同品種甘薯多酚的總量及選取適宜品種進行結(jié)合酚生物活性的研究具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗用甘薯品種 “遼薯20”、“遼薯26”、“遼薯28”、“遼薯30”、“遼薯33” 遼寧省農(nóng)科院提供;“煙薯25”、“紫羅蘭” 購自山東泰安;“紅薯1號”、“紅薯5號”、“粘地瓜”、“本地紅”、“808” 購自大連莊河;無水乙醇、乙酸乙酯、硫酸、甲醇、福林酚試劑、氫氧化鈉、碳酸鈉 均為國產(chǎn)分析純，沈陽化學試劑廠。

MP2002電子天平 上海舜宇恒科學儀器有限公司;350粉碎機 浙江省永康市金穗機械制造廠;TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器責任有限公司;HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;DHG-9070A恒溫干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;新陽LG0.2型真空冷凍干燥機 新陽速動設(shè)備制造有限公司;CG21G冷凍離心機 日立有限公司;PB-10型pH計 北京賽多利斯科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料處理及游離酚提取 參照文獻[22]方法進行。甘薯洗凈去皮后迅速切成1 m3左右小塊,經(jīng)冷凍干燥后以植物粉碎機粉碎過40目篩。取10 g甘薯凍干粉,以250 mL體積分數(shù)為 60%的乙醇溶液于50 ℃水浴鍋中水浴2 h提取游離酚,然后以4 ℃,8000 r/min離心25 min,離心后棄去上清液,收集殘渣,按上述步驟重復提取2～3次至上清液檢測不出游離酚為止,將殘渣于50 ℃真空干燥至恒重后密封置于4 ℃冰箱中冷藏保存。

1.2.2 結(jié)合酚提取 參照文獻[12]方法進行。取已充分提取游離酚后的干燥薯渣1 g,置于錐形瓶中,加入H2SO4溶液,置于水浴鍋中水解,水解結(jié)束后以8000 r/min離心25 min,保留上清液棄去殘渣,將上清液用NaOH溶液中和至pH為7,加入等體積乙酸乙酯進行萃取,重復萃取2次,合并萃取液,以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45 ℃下濃縮蒸干,加入50%甲醇溶液超聲溶解并定容至10 mL容量瓶中。

1.2.3 結(jié)合酚提取的單因素實驗 以結(jié)合酚提取量為考察指標,分別以H2SO4體積分數(shù)、水解時間、液料比、水解溫度為考察對象進行單因素實驗,考察每個因素對甘薯結(jié)合酚提取量的影響。

1.2.3.1 H2SO4體積分數(shù)的篩選 液料比40∶1 (mL/g)、水解時間15 h、溫度為50 ℃的條件下,考察體積分數(shù)分別為5%、10%、15%的H2SO4水溶液對甘薯結(jié)合酚提取量的影響。

1.2.3.2 水解時間的篩選 以體積分數(shù)為10%的H2SO4溶液為水解液,在液料比40∶1 (mL/g)、溫度為50 ℃的條件下,考察水解時間分別為5、10、15、20、25 h時對甘薯結(jié)合酚提取量的影響。

1.2.3.3 液料比的篩選 以體積分數(shù)10%的H2SO4溶液為水解液,在水解時間為25 h、水解溫度為50 ℃的條件下,考察液料比分別為20∶1、40∶1、60∶1、80∶1、100∶1 mL/g時對甘薯結(jié)合酚提取量的影響。

1.2.3.4 水解溫度的篩選 以體積分數(shù)10%的H2SO4溶液為水解液,在液料比40∶1 (mL/g)、水解時間為25 h的條件下,考察水解溫度分別為30、40、50、60、70 ℃時對甘薯結(jié)合酚提取量的影響。

1.2.4 結(jié)合酚提取的響應(yīng)面試驗 以體積分數(shù)10%的H2SO4溶液為水解液,以結(jié)合酚提取量為考察指標,以水解時間、水解溫度、液料比為編碼因素,使用Design-Expert 8.05,設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面試驗。試驗因素水平及編碼如表1所示。

表1 試驗因素水平及編碼Table 1 Factors and levels used in response surface methodology

1.2.5 多酚含量測定

1.2.5.1 標準曲線的制作 參考Mary[23]方法,精確稱取沒食子酸0.1 g，用蒸餾水配制成1 mg/mL溶液,分別吸取該溶液0.0、0.3、0.5、1.0、1.2、1.5 mL于10 mL刻度試管中,蒸餾水定容搖勻。然后從各濃度溶液中吸取0.5 mL加入到10 mL離心管中,分別用蒸餾水定容到5 mL,再加入0.5 mL福林酚試劑,搖勻,加入0.5 mol/L碳酸鈉溶液1 mL,搖勻。放置1 h,以空白來調(diào)零,于725 nm下測定吸光度,平行測定三次。

標準曲線回歸方程:y=4.927x-0.0212,R2=0.99921,式中:y代表待測樣品在725 nm處的吸光度,x代表待測樣中多酚的質(zhì)量濃度(mg/mL)。

1.2.5.2 樣品中游離酚與結(jié)合酚含量的測定 取對應(yīng)樣液0.5 mL,參照上述標準曲線制作方法進行測定,通過標準曲線計算其多酚類化合物的質(zhì)量濃度,進而計算提取量。提取量計算公式如下:

1.2.6 12個品種甘薯游離酚與結(jié)合酚的含量測定 按1.2.1進行12個品種甘薯原料的處理和游離酚的提取,按1.2.2和1.2.4實驗確定的最優(yōu)工藝參數(shù)進行結(jié)合酚的提取,按1.2.5進行提取液中游離酚和結(jié)合酚含量的測定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

通過Excel 2007對測定值進行統(tǒng)計和計算,應(yīng)用SPSS 19.0軟件對測定數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘薯結(jié)合酚提取單因素試驗分析

2.1.1 H2SO4體積分數(shù)對結(jié)合酚提取量的影響 酸水解主要是通過破壞糖苷鍵來釋放結(jié)合酚,高濃度的酸腐蝕性強,通常采用體積分數(shù)在10%左右的硫酸進行水解[11-12,24],因此,本文選取了5%、10%、15%三個體積分數(shù)的硫酸水溶液進行甘薯結(jié)合酚的酸水解釋放。由圖1可知,H2SO4溶液體積分數(shù)由5%升至10%時,結(jié)合酚提取率增加差異顯著(p<0.05),且10%時達到最大,繼續(xù)提高H2SO4溶液濃度,結(jié)合酚提取量反而降低,說明H2SO4體積分數(shù)的增加促進了糖苷鍵的斷裂利于結(jié)合酚的釋放,但體積分數(shù)繼續(xù)增大會使釋放出來的結(jié)合酚被破壞分解,導致結(jié)合酚提取量降低,因此,H2SO4溶液體積分數(shù)選擇10%,進行后續(xù)優(yōu)化試驗。

圖1 H2SO4體積分數(shù)對結(jié)合酚提取量的影響Fig.1 Effect of H2SO4 volume fraction on the extraction yield of bound phenol

2.1.2 水解時間對結(jié)合酚提取量的影響 以節(jié)約能源為原則,將本次試驗考察時間控制在25 h以內(nèi),由圖2可知,隨著水解時間的增加,結(jié)合酚提取量逐漸增大,25 h達最大,說明提取時間的增加使得更多的結(jié)合酚被酸水解釋放出來,但20 h后結(jié)合酚提取量增加已無顯著差異,說明提取液中結(jié)合酚的濃度已趨于飽和。

圖2 水解時間對結(jié)合酚提取量的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on the extraction yield of bound phenol注:不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。

2.1.3 液料比對結(jié)合酚提取量的影響 由圖3可知,結(jié)合酚的提取量隨著液料比的增大而增加(20∶1～40∶1 mL/g),可能因為溶劑用量的增大有助于結(jié)合酚的水解與多酚的浸出,當液料比為40∶1 (mL/g)時,結(jié)合酚提取量達到最大值,繼續(xù)提高液料比,提取量開始降低,可能由于液料比的不斷增加的同時增大了與空氣的接觸從而使多酚氧化,故提取量呈下降趨勢。因此選擇40∶1 (mL/g)為最佳液料比。

圖3 液料比對結(jié)合酚提取量的影響Fig.3 Effect of liquid-to-solid ratioon the extraction yield of bound phenol

2.1.4 水解溫度對結(jié)合酚提取量的影響 由圖4可知,隨著水解溫度的增加,結(jié)合酚提取率逐漸提高,增加到60 ℃時,提取量獲得最大。盧婉容等[25]研究不同溫度對木瓜皮結(jié)合酚水解率的影響,結(jié)果表明適當?shù)厣邷囟瓤稍黾咏Y(jié)合酚的含量,提高溫度可以加速糖苷鍵等化學鍵的斷裂,從而使結(jié)合酚更易被水解,提高其含量。繼續(xù)增加水解溫度至70 ℃后,結(jié)合酚提取率降低,可能是酚類物質(zhì)由于溫度過高發(fā)生分解。因此在實際操作中選擇60 ℃較為適宜。

圖4 水解溫度對結(jié)合酚提取量的影響Fig.4 Effect of temperature on the extraction yield of bound phenol

2.2 紫薯結(jié)合酚提取響應(yīng)面試驗及結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)模型的建立與分析 本實驗利用Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計響應(yīng)面方案,優(yōu)化并找出多因素系統(tǒng)中最佳提取條件。利用Design-Expert8.05軟件對表2中各個條件下實驗數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸擬合,通過回歸模型參數(shù)估計值得到關(guān)于結(jié)合酚提取量的回歸方程如下:

表2 響應(yīng)面分析設(shè)計及實驗結(jié)果Table 2 Program and experimental results of RSA

Y=0.21+0.023×A+0.018×B-0.025×C+0.04775×A×B-0.00048×A×C+0.023×B×C-0.016×A2-0.033×B2-0.038×C2

由表3結(jié)果可知,變量模型p<0.01,達到極顯著水平,回歸方程失擬檢驗p>0.05,失擬值差異不顯著,R2=0.9587,表明 95.87% 的數(shù)據(jù)可以用此方程解釋[26]。通過響應(yīng)面的設(shè)計,所得模型充分擬合實驗數(shù)據(jù),即此試驗方法是可靠的。方差分析結(jié)果表明,方程的一次項水解時間(A)和水解溫度(B)和液料比(C)對響應(yīng)值結(jié)合酚提取率影響極顯著;BC(水解溫度、液料比)對響應(yīng)值的影響極顯著,二次項A2對響應(yīng)值的影響顯著,B2、C2對響應(yīng)值的影響極顯著,由此可知,響應(yīng)值是受多種因素相互影響的結(jié)果,而不是簡單的線性關(guān)系。

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

2.2.2 響應(yīng)曲面分析 由圖5a和圖5b可看出,無論水解溫度和液料比如何變化,結(jié)合酚提取量均隨時間的增加呈現(xiàn)先增加而后平緩的趨勢,說明水解時間與水解溫度、水解時間與液料比之間無交互作用影響。由圖5c可看出,水解溫度對結(jié)合酚提取量的影響受液料比交互作用的影響,當液料比較小時,結(jié)合酚提取量隨水解溫度升高呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢,而當液料比較大時,結(jié)合酚提取量則呈現(xiàn)先增加而后平緩的趨勢。

圖5 各因素交互作用對結(jié)合酚提取量影響的響應(yīng)曲面和等高線圖Fig.5 Responsive surfaces and contour plots for each factor interaction effect on the amount of bound phenol extraction

2.2.3 驗證試驗 以響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳工藝參數(shù)結(jié)合,得到水解時間為21.33 h,水解溫度為62.67 ℃,液料比為34.67∶1 (mL/g)時,預測提取率最大值可達0.220 g/100 g。根據(jù)實際操作條件調(diào)整參數(shù),即水解時間22 h,水解溫度62 ℃,液料比35∶1 (mL/g)進行結(jié)合酚酸水解提取,實際測得結(jié)合酚提取量為(0.212±0.004) g/100 g,達到預測值的96.36%,說明了回歸模型的可靠性。

2.3 12個不同品種甘薯游離酚和結(jié)合酚的含量測定分析

由表4差異顯著性分析結(jié)果可知,不同品種甘薯游離酚和結(jié)合酚含量變化范圍較寬,分別為(0.14～1.63) g/100 g和(0.05～0.28) g/100 g。差異顯著性分析表明各品種游離酚和結(jié)合酚含量之間存在著顯著性差異(p<0.05)。經(jīng)計算,甘薯游離酚含量大于結(jié)合酚,平均含量分別為0.61和0.15 (g/100 g)。在12個測試品種中,3號“紫羅蘭”和4號“遼薯20”游離酚和結(jié)合酚含量均較高。張文婷等[27]測得徐薯34、徐紫8號和商薯19等12個供試甘薯品種薯塊曬干樣的游離酚含量變化范圍在(1.74～6.16) mg/g,說明不同品種甘薯間游離酚含量變化范圍較寬,從不同肉色甘薯游離酚含量平均值大小情況看以紫肉甘薯最高,與本文研究結(jié)論基本一致。而關(guān)于不同甘薯品種間結(jié)合酚含量差異的文獻尚缺乏報道,從本文研究表明,其含量差異結(jié)果同游離酚類似,存在變化范圍寬、紫肉甘薯中含量高的現(xiàn)象。據(jù)研究報道[28],紫薯的營養(yǎng)成分含量較普通甘薯要高,本文的研究結(jié)果為以紫肉甘薯進一步作為游離酚和結(jié)合酚提取的良好原料提供了理論依據(jù)。

表4 12個不同品種甘薯游離酚和結(jié)合酚的含量測定結(jié)果Table 4 Content determination results of free and bound phenol in 12 varieties of sweet potatos

3 結(jié)論

本研究表明,甘薯結(jié)合酚酸水解法提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為:水解時間22 h,水解溫度62 ℃,液料比35∶1 (mL/g),實際提取量為(0.212±0.004) g/100 g,達到預測值的96.36%,說明本優(yōu)化工藝具有可行性,可用于指導工業(yè)化生產(chǎn)。

通過對12種不同品種甘薯游離酚和結(jié)合酚含量的測定,表明不同甘薯品種之間游離酚和結(jié)合酚含量分別在(0.14～1.63) g/100 g和(0.05～0.28) g/100 g之間,含量差異顯著且分布范圍較廣,其中,紫肉品種甘薯相比杏黃和淺黃肉色品種甘薯來說,具有更高的游離酚和結(jié)合酚含量,為選取富含游離酚和結(jié)合酚的甘薯品種進一步進行生物活性的研究及資源深度開發(fā)利用提供了科學依據(jù)。