甘芝霖,倪元穎

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系,北京 100083;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)

植物精油具有較強(qiáng)的抑制或殺死微生物的特性[1-3],尤其以生姜、八角茴香等為代表的香辛料類精油可以作為天然防腐劑應(yīng)用于食品加工過程中微生物污染的控制[4-5]。

孜然(CuminumcyminumL.)又名安息茴香或孜然芹,芳香氣味濃烈、口感獨(dú)特,是一種常見的香辛料和調(diào)味品,同時(shí)也是一種藥食同源植物[6],其精油具有抗氧化等功效作用[7]。近年來,國(guó)內(nèi)外對(duì)孜然精油(cumin essential oil,CEO)的抑菌活性也有一些報(bào)道,研究結(jié)果表明,孜然精油對(duì)細(xì)菌、霉菌、酵母菌均有一定的抑制作用[8-10]。但是,大多數(shù)研究只停留在定性分析方面,缺乏理論深度。有關(guān)孜然精油對(duì)微生物生長(zhǎng)曲線、殺菌曲線的影響鮮有報(bào)道,其抑菌機(jī)制尚不清楚,需要更深入的研究和探討。

本文以大腸桿菌等8種細(xì)菌作為供試菌種,首先通過牛津杯實(shí)驗(yàn)、最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測(cè)定篩選出孜然精油抑制作用最強(qiáng)的兩種細(xì)菌,然后繪制生長(zhǎng)曲線和殺菌曲線,進(jìn)一步探究其抑菌活性,最后通過細(xì)胞膜相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定、透射電鏡和掃描電鏡對(duì)菌體形態(tài)變化進(jìn)行觀察,探討其抑菌作用機(jī)理,為孜然精油在食品防腐中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

孜然(21-6新孜2號(hào)) 產(chǎn)自新疆和田地區(qū),由新疆農(nóng)科院提供,貯藏于4 ℃冷庫中;金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,ATCC6538)、福氏志賀氏菌(Shigellaflexneri,ATCC12022)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae,ATCC13883)、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae,ATCC49619)、腸炎沙門菌(Salmonellaenteritidis,ATCC13076)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis,ATCC6633)、單增李斯特(Listeriamonocytogenes,ATCC19115)、大腸桿菌(Escherichiacoli,ATCC25922) 上海瑞楚生物科技有限公司;丙酮分析純 北京化工廠;葡萄糖 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(LB)、水解酪蛋白肉湯培養(yǎng)基(MHB)、腦心浸出液培養(yǎng)基(BHI) 北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司。

DL-CJ-1F型試驗(yàn)醫(yī)用型潔凈工作臺(tái) 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;BS223S型電子天平 德國(guó)Sartorious公司;ZYpureEDlc-100-UP型超純水機(jī) 北京中揚(yáng)永康環(huán)?？萍加邢薰?YX0602型自動(dòng)蒸汽滅菌機(jī) 山東新華機(jī)械股份有限公司;DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;T6型新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;DW-HL388型86 ℃立式超低溫冷凍儲(chǔ)存箱 中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司;EC215電導(dǎo)率儀 美國(guó)Hanna公司;TGL-16M型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 湖南省湘儀集團(tuán);FEI Quanta 200型掃描電鏡 捷克FEI公司;H-7650B型透射電鏡 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 孜然精油的制備 首先采用超臨界二氧化碳萃取法得到孜然油樹脂(深棕色粘稠狀液體,得率13.56%)[11],然后利用分子蒸餾技術(shù)對(duì)其進(jìn)行純化,制備得到孜然精油(金黃色液體,流動(dòng)性良好,得率25.97%)[12]。用80%的丙酮溶液配制200 μg/mL的孜然精油母液,在4 ℃條件下避光儲(chǔ)存待用。

1.2.2 培養(yǎng)基配制和菌液制備 各種供試菌株分別用合適的培養(yǎng)基進(jìn)行活化和培養(yǎng)。分別稱取LB、MHB和BHI三種培養(yǎng)基粉末32、24和49 g,加入1000 mL蒸餾水中,加熱煮沸溶解,分裝后于121 ℃高壓滅菌15 min備用。

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、志賀氏菌于37 ℃下,在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,然后轉(zhuǎn)接到MHB培養(yǎng)基于37 ℃下培養(yǎng)24 h,進(jìn)行二次活化。最后,按照1%的比例(v/v)將上述菌液加入到新的MHB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),采用活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定菌數(shù),使菌液濃度達(dá)到107CFU/mL。

沙門氏菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、李斯特菌于37 ℃下,在BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,然后轉(zhuǎn)接到MHB培養(yǎng)基于37 ℃下培養(yǎng)24 h,進(jìn)行二次活化。最后,按照1%的比例(v/v)將上述菌液加入到新的MHB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),采用活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定菌數(shù),使菌液濃度達(dá)到107CFU/mL。

以上菌株均在搖床中以100 r/min的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3 牛津杯法測(cè)定抑菌譜 參考文獻(xiàn)[13]方法略作修改,按照菌種配制相應(yīng)的固體培養(yǎng)基,高溫高壓滅菌后以每個(gè)大約10 mL的體積倒入平板中,培養(yǎng)基凝固后,加入50 μL菌懸液,然后用涂布棒輕輕涂勻,放置10 min后,用鑷子(無菌)夾取高壓蒸汽消毒且被烘干的牛津杯(內(nèi)徑6 mm,外徑7.8 mm,高10 mm),輕輕放置于已經(jīng)涂布菌液的培養(yǎng)基上,小心加壓,使其盡量與培養(yǎng)基之間無空隙,每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)放置三個(gè)牛津杯作為平行,分別在不同的牛津杯內(nèi)緩慢加入50 μL樣品液,其中孜然精油的濃度為0.1 mg/mL,以無菌蒸餾水和丙酮分別為空白對(duì)照和溶劑對(duì)照。然后將培養(yǎng)皿小心放入4 ℃冰箱中,待樣品液擴(kuò)散12 h后,將平板倒置放入37 ℃培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24 h后,用游標(biāo)卡尺測(cè)量透明抑菌圈的直徑大小。在該實(shí)驗(yàn)中,抑菌圈直徑越大,代表藥物的抑菌能力越強(qiáng)。

1.2.4 最小抑菌濃度(MIC)與最小殺菌濃度(MBC)的測(cè)定 MIC的測(cè)定根據(jù)文獻(xiàn)[14]中的液體試管二倍稀釋法略作修改。取8支無菌試管,從1～8進(jìn)行標(biāo)號(hào),1～6號(hào)為樣品管,7號(hào)管為溶劑對(duì)照,8號(hào)管用無菌蒸餾水作空白對(duì)照。1～6號(hào)每管加入1 mL無菌培養(yǎng)液,然后向1號(hào)管中加入1 mL濃度為200 μg/mL的孜然精油溶液,混勻后,吸取1 mL加入到2號(hào)管中,按照上述步驟依次稀釋,到6號(hào)管時(shí),從其中吸取1 mL棄掉。7號(hào)管中加入1 mL 80%丙酮溶液,8號(hào)管中加入1 mL無菌水。接著,每管統(tǒng)一加入1 mL濃度為107CFU/mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液,搖勻后加上滅過菌的硅膠塞,在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)過后用肉眼觀察各個(gè)試管,試管中培養(yǎng)液澄清的濃度即為最小抑制濃度(MIC)。然后分別取100 μL MIC(包括MIC)以上的濃度的試管內(nèi)培養(yǎng)液,接種LB固體培養(yǎng)基上,在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察平板,沒有菌落生長(zhǎng)的最低濃度即為受試菌種的最小殺菌濃度(MBC),選出孜然精油抑制作用最強(qiáng)的兩種細(xì)菌。

1.2.5 對(duì)微生物生長(zhǎng)曲線抑制作用 孜然精油對(duì)大腸桿菌和志賀氏菌的生長(zhǎng)曲線抑制作用的測(cè)定方法按照文獻(xiàn)[15]略作修改,具體如下:將以上兩種供試細(xì)菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,以2%的接種比例(v/v)加入到新的MHB培養(yǎng)基中,根據(jù)1.2.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果中孜然精油對(duì)大腸桿菌和志賀氏菌的MIC值設(shè)置濃度,以不加精油組作為對(duì)照組。在37 ℃下,以100 r/min在振蕩搖床中培養(yǎng)24 h,每隔2 h,取一定量的菌液用分光光度計(jì)測(cè)定其吸光值(OD),波長(zhǎng)為600 nm。然后以培養(yǎng)時(shí)間(h)為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),繪制孜然精油對(duì)大腸桿菌和志賀氏菌抑制作用的生長(zhǎng)曲線。

1.2.6 活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定時(shí)間-殺菌曲線 孜然精油對(duì)大腸桿菌和志賀氏菌的時(shí)間-抑菌曲線的測(cè)定方法按照文獻(xiàn)方法略作修改[16],具體如下:將以上兩種供試細(xì)菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(培養(yǎng)時(shí)間均為10 h),取一定量菌液接種于MHB培養(yǎng)基之中使其濃度達(dá)到108CFU/mL。根據(jù)1.2.4確定的孜然精油的MIC值,配制二者濃度分別為MIC、2×MIC的培養(yǎng)基,在37 ℃下、100 r/min振蕩搖床中培養(yǎng)24 h,分別在0、2、4、6、8、12、16、20、24 h處取1 mL菌液進(jìn)行梯度稀釋,用LB培養(yǎng)基進(jìn)行計(jì)數(shù),以不加精油組作為對(duì)照組。然后以培養(yǎng)時(shí)間(h)為橫坐標(biāo),各時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的平均菌落數(shù)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo),繪制時(shí)間-殺菌曲線。

1.2.7 細(xì)胞膜滲透性測(cè)定 參照文獻(xiàn)[15]中的方法研究孜然精油對(duì)微生物細(xì)胞膜滲透性的影響,以相對(duì)電導(dǎo)率為指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。按照1.2.5繪制的生長(zhǎng)曲線,將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的大腸桿菌、志賀氏菌菌液在4 ℃下,10000 r/min下離心10 min,棄掉上清液,收集菌體,然后用5%的葡萄糖溶液對(duì)菌體進(jìn)行反復(fù)清洗,直到其電導(dǎo)率接近5%的葡萄糖溶液,由此獲得等滲細(xì)胞。根據(jù)1.2.4所得孜然精油的MIC值,加入到50 mL 5%的葡萄糖溶液中,測(cè)定其電導(dǎo)率并記為L(zhǎng)1。將加入兩種藥物的等滲細(xì)胞溶液,在37 ℃下培養(yǎng)6 h,每隔1 h測(cè)定其電導(dǎo)率記為L(zhǎng)2。等滲細(xì)胞溶液在沸水中加熱5 min作為對(duì)照,記為L(zhǎng)0。通過公式(1)計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率,并繪制時(shí)間-相對(duì)電導(dǎo)率變化曲線。

相對(duì)電導(dǎo)率(%)=(L2-L1)×100/L0

式(1)

1.2.8 掃描電子顯微鏡(SEM)觀察 以1.2.5所述方法加入孜然精油對(duì)大腸桿菌、志賀氏菌進(jìn)行處理,分別于4 ℃、10000 r/min下離心10 min,棄去上清液后收集菌體。首先用含有3%戊二醛的0.1 mol/L PBS緩沖液(pH約7.2)在室溫下固定5 h。然后用PBS緩沖液對(duì)其洗滌3次,再用含有1%的四氧化鋨的PBS緩沖液在室溫下固定1 h。然后用25%、50%、75%和100%的乙醇,依次按照順序各脫水一次,每次約10 min。然后用50%、70%、90%和100%的乙酸異戊酯逐級(jí)取代乙醇,每級(jí)置換約3 min。臨界點(diǎn)干燥之后將樣品用雙面導(dǎo)電膠粘貼在樣品臺(tái)上,離子濺射噴金,厚度約1 μm。處理后的樣品可在加速電壓12 kV下觀察,選擇典型視野采集圖像。

1.2.9 透射電子顯微鏡(TEM)觀察 以1.2.5所述方法對(duì)大腸桿菌、志賀氏菌進(jìn)行加藥處理,分別于4 ℃、10000 r/min離心10 min,棄去上清液后收集菌體。首先用含有3%戊二醛的0.1 mol/L PBS緩沖液(pH約7.2)在室溫下固定5 h。然后用PBS緩沖液(同上)對(duì)其洗滌3次,在用含有1%的四氧化鋨的PBS緩沖液(同上)在室溫下固定1 h。接著,用30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇依次按照順序各脫水一次,每次約20 min,然后再用無水丙酮脫水3次,每次30 min。將脫水后的樣品嵌入到環(huán)氧樹脂812中于45 ℃處理24 h,然后聚合到斯珀?duì)枠渲?含有1.5%硬化劑DMP-30的環(huán)氧樹脂812)于65 ℃處理72 h。用超波切片機(jī)將以上樣品切成約50 nm的薄片,1%磷鎢酸染色后,在透射電鏡下觀察并采集圖片。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均做三次重復(fù),用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,用Origin 8.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 孜然精油抑菌作用定性分析

由表1可得,溶劑對(duì)照和空白對(duì)照組在所有供試菌種的培養(yǎng)基上均沒有抑菌圈的出現(xiàn),說明丙酮對(duì)供試菌種并沒有抑制作用,因此丙酮在本實(shí)驗(yàn)中可以被當(dāng)做樣品溶劑使用。8種細(xì)菌中,孜然精油的抑菌圈從大到小依次為志賀氏菌>大腸桿菌>枯草芽孢桿菌>金黃色葡萄球菌>沙門氏菌>肺炎鏈球菌>肺炎克雷伯菌>李斯特菌。抑菌圈<13 mm為低度抑菌,13～19 mm為中度抑菌,>19 mm為高度抑菌[17],可以判斷,孜然精油對(duì)大腸桿菌和志賀氏菌這兩種革蘭氏陰性菌具有高度抑制作用,對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌具有中度抑制作用,而對(duì)肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌和李斯特菌表現(xiàn)出低度抑制作用。與以往研究相比較[18-19]孜然精油抑菌圈測(cè)量結(jié)果對(duì)比,可以發(fā)現(xiàn)由于產(chǎn)地、品種以及提取方式的不同,孜然精油對(duì)同一個(gè)菌株產(chǎn)生的抑菌圈大小不相同,即表現(xiàn)出的抑菌作用不同。

表1 孜然精油抑菌活性定性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Qualitative test results of the antimicrobial activity of CEO

孜然精油對(duì)供試菌種的MIC和MBC如表1所示。8種細(xì)菌中,孜然精油對(duì)大腸桿菌和志賀氏菌的抑制作用最強(qiáng)(MIC均為25 μg/mL,MBC均為50 μg/mL)。李大強(qiáng)[20]研究得出,孜然精油對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC分別為123和246 mg/mL,均高于本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果;而在Oroojalian等[21]的研究中,孜然精油對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC分別為3和0.75 mg/mL,與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果同樣存在差異,這進(jìn)一步說明了孜然精油受產(chǎn)地、種類、提取方式的影響,其抑菌活性等功能性質(zhì)亦有所不同。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,孜然精油對(duì)革蘭氏陰性菌(大腸桿菌和志賀氏菌)作用明顯強(qiáng)于其他供試菌株,因此,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取大腸桿菌、志賀氏菌進(jìn)行深入研究。

2.2 對(duì)微生物生長(zhǎng)曲線抑制作用

孜然精油對(duì)大腸桿菌和福氏志賀氏菌的生長(zhǎng)曲線抑制作用如圖1所示,兩種菌的正常生長(zhǎng)曲線均在8～10 h開始進(jìn)入穩(wěn)定期。相比于溶劑對(duì)照組變化明顯,MIC組的OD值基本趨于0呈一條直線,說明孜然精油可以有效抑制大腸桿菌和福氏志賀氏菌的繁殖。

圖1 孜然精油對(duì)大腸桿菌和福氏志賀氏菌的生長(zhǎng)曲線抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of CEO on the growth curve of E. coli and S.flexneri

2.3 活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定時(shí)間-殺菌曲線

通過活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定孜然精油對(duì)大腸桿菌、福氏志賀氏菌的時(shí)間-殺菌曲線如圖2所示。溶劑對(duì)照組的大腸桿菌和福氏志賀氏菌在培養(yǎng)了12 h后,其從各自初始對(duì)數(shù)值分別上升了4.22和2.33;以MIC劑量的孜然精油作用于大腸桿菌24 h后,其對(duì)數(shù)值相比于初始值上升了1.43,雖然不能完全抑制其生長(zhǎng),但在一定程度上延長(zhǎng)了其延滯期。2×MIC的孜然精油作用于大腸桿菌24 h后,其對(duì)數(shù)值下降了0.96。而當(dāng)兩個(gè)劑量的孜然精油作用于福氏志賀氏菌24 h后,活菌數(shù)量均有所下降,分別下降了0.36和0.42個(gè)對(duì)數(shù)值。以上結(jié)果還說明孜然精油的抑菌性存在劑量-作用依賴關(guān)系。

圖2 孜然精油對(duì)大腸桿菌、福氏志賀氏菌的時(shí)間-殺菌曲線Fig.2 Time-kill curves showing the Inhibitory effect of CEO on the growth curve of E. coli,S. flexneri

由圖2還可以看出,兩種細(xì)菌的快速增殖期在0～14 h左右,孜然精油在此時(shí)間段內(nèi)可以有效抑制微生物的生長(zhǎng)。刁文睿[22]、陶翠等[23]和Yakob[24]的研究顯示,公丁香精油、油樟葉揮發(fā)油和羅勒精油對(duì)細(xì)菌的抑制作用在0～12 h之內(nèi),與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

2.4 細(xì)胞膜電導(dǎo)率的測(cè)定

電導(dǎo)率的測(cè)定可以判斷細(xì)胞膜通透性改變的情況。孜然精油以MIC劑量作用于兩種供試菌后,其相對(duì)電導(dǎo)率如圖3所示。與各自溶劑對(duì)照組相比,MIC劑量組的相對(duì)電導(dǎo)率都有了明顯提升,其中對(duì)福氏志賀氏菌影響相對(duì)較大,作用時(shí)間4 h后可以提高13%以上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩種供試菌受到精油作用后,細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化,有可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)組分泄露,進(jìn)而導(dǎo)致微生物死亡、生長(zhǎng)被抑制。有關(guān)報(bào)道顯示[25-27],肉桂、八角茴香等植物精油作用于細(xì)菌后,微生物的電導(dǎo)率都有明顯上升,說明微生物細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變,進(jìn)而導(dǎo)致一些蛋白質(zhì)、糖類、金屬離子和小分子物質(zhì)等被釋放出來,使得微生物生長(zhǎng)受阻,與本文的研究結(jié)果相似。

圖3 大腸桿菌、福氏志賀氏菌生長(zhǎng)過程中受到孜然精油作用的相對(duì)電導(dǎo)率Fig.3 Relative electrical conductivity of growth matrix of E.coli,S.flexneri with CEO

2.5 掃描電子顯微鏡結(jié)果

如圖4A和圖4B，大腸桿菌在精油組和對(duì)照組中的形態(tài)有明顯的差異。溶劑對(duì)照組中的大腸桿菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,呈飽滿的長(zhǎng)桿狀,表面光滑。精油處理后,部分菌體的形態(tài)發(fā)生改變,皺縮呈不規(guī)則形狀,而且可以看到部分菌體被裂解成聚合在一起的絲狀或片狀溶解物,說明細(xì)胞膜被破壞,導(dǎo)致細(xì)胞被裂解死亡。

圖4 大腸桿菌(A、B)和福氏志賀氏菌(C、D)的SEM圖(3000×)Fig.4 SEM images of E. coli(A and B)and S. flexneri(Cand D)(3000×)

如圖4C和圖4D，與大腸桿菌的SEM結(jié)果相似,溶劑對(duì)照組的菌體結(jié)構(gòu)完整,呈飽滿的短桿狀,表面光滑。精油處理后,菌體發(fā)生皺縮,部分菌體被裂解成碎片。說明孜然精油同樣破壞了福氏志賀氏菌的細(xì)胞膜,細(xì)胞內(nèi)部組分泄露,導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

本文的結(jié)果存在多個(gè)文獻(xiàn)支持,實(shí)驗(yàn)藥物抑菌作用也是通過改變微生物細(xì)胞膜的通透性、破壞細(xì)胞壁,導(dǎo)致細(xì)胞裂解死亡。在Gao等[28]的研究中,迷果芹種子精油對(duì)大腸桿菌有一定的抑制作用,起作用的產(chǎn)生也是細(xì)胞膜通透性發(fā)生了明顯變化,通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的形態(tài)出現(xiàn)褶皺的現(xiàn)象,表面變得粗糙,并伴隨有細(xì)胞碎片的產(chǎn)生。

2.6 透射電子顯微鏡結(jié)果

如圖5A和圖5B，大腸桿菌在精油組和溶劑對(duì)照組中的形態(tài)有明顯的差異。溶劑對(duì)照組中的大腸桿菌呈圓形,細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整,胞壁和胞質(zhì)結(jié)合緊密,細(xì)胞質(zhì)密度均勻。精油處理后,部分菌體的形態(tài)發(fā)生改變,呈不規(guī)則形狀,部分細(xì)胞的細(xì)胞壁遭到破壞,細(xì)胞質(zhì)聚合溶解,使細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)空腔。

圖5 大腸桿菌(A和B)和福氏志賀氏菌(C和D)TEM圖(6000×)Fig.5 TEM images of E. coli(A and B)and S. flexneri(C and D)(6000×)

如圖5C和圖5D，和大腸桿菌結(jié)果相似,福氏志賀氏菌在精油組和溶劑對(duì)照組中的形態(tài)有明顯的差異。溶劑對(duì)照組中的福氏志賀氏菌呈橢圓形,細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整,胞壁和胞質(zhì)結(jié)合緊密,細(xì)胞質(zhì)密度均勻。精油處理后,菌體形態(tài)發(fā)生改變,收縮呈不規(guī)則形狀,部分細(xì)胞的細(xì)胞壁遭到破壞,細(xì)胞質(zhì)聚合溶解,使細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)空腔,并有細(xì)胞溶解現(xiàn)象出現(xiàn)。

Diao等[16]發(fā)現(xiàn),公丁香精油作用于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌之后,TEM觀察下,細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊,菌體內(nèi)胞質(zhì)萎縮固化、出現(xiàn)空洞。黃德峰[29]研究發(fā)現(xiàn),菊科中草藥植物精油作用于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌等之后,TEM觀察下,菌體形態(tài)發(fā)生變化、細(xì)胞壁膜發(fā)生皺縮、破損、胞內(nèi)內(nèi)容物溢出,細(xì)胞器模糊不清,胞內(nèi)形成了大的空泡。

綜上所述,孜然精油具有廣譜抑菌性,對(duì)細(xì)菌有一定的抑制作用,在8個(gè)供試菌種,對(duì)大腸桿菌、福氏志賀氏菌的抑制效果相對(duì)較好。抑菌作用的機(jī)理都是通過改變細(xì)胞膜的通透性,使得細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,細(xì)胞內(nèi)的組分泄露流出,導(dǎo)致細(xì)胞裂解死亡。與研究報(bào)道的孜然精油抑菌作用相比[10,19,31],本實(shí)驗(yàn)中的孜然精油對(duì)同一菌種的抑制能力,比如抑菌圈的大小、MIC和MBC等指標(biāo)并不一致,這可能與孜然的產(chǎn)地和品種、精油的提取方式及供試菌株的來源及活力都有很大的關(guān)系。

3 結(jié)論

通過牛津杯實(shí)驗(yàn)對(duì)孜然精油的抑菌譜進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對(duì)8種供試菌均有一定的抑制作用。對(duì)比不同菌株抑菌圈直徑大小發(fā)現(xiàn),孜然精油對(duì)大腸桿菌和志賀氏菌有較好的抑制作用。

最小抑制濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中,孜然精油對(duì)大腸桿菌和福氏志賀氏菌的抑制作用最強(qiáng)(MIC均為25 μg/mL,MBC均為50 μg/mL),與牛津杯實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。

孜然精油能顯著提高大腸桿菌、福氏志賀氏菌的相對(duì)電導(dǎo)率(p<0.05),通過改變細(xì)胞膜的滲透性對(duì)微生物起到抑制作用。其中,福氏志賀氏菌的相對(duì)電導(dǎo)率最高,達(dá)到13%以上。

掃描電鏡和透射電鏡下,發(fā)現(xiàn)孜然精油可以使菌體的形態(tài)發(fā)生改變,細(xì)胞普遍出現(xiàn)皺縮、不規(guī)則的凸起,甚至被裂解成碎片,部分細(xì)胞的細(xì)胞壁遭到破壞,細(xì)胞質(zhì)聚合溶解,使細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)空腔,從而說明了其抑菌活性的機(jī)理是改變了細(xì)胞膜的通透性,使得菌體發(fā)生形態(tài)變化,細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏,導(dǎo)致細(xì)胞死亡。