王 倩,張佳嬋,王昌濤,*,王守現(xiàn),趙 丹,王亞琳

(1.北京工商大學，北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京 100048;2.北京市農(nóng)林科學院植物保護環(huán)境保護研究所，北京市食用菌工程技術研究中心,北京 100097;3.云南白藥集團股份有限公司,云南昆明 650504)

據(jù)《本草綱目》記載,桑枝味苦性平,有祛風除濕、通經(jīng)活絡、化氣行水等功效。其含有多種活性成分,在降血糖、降血脂、抗氧化等方面擁有極高的應用價值[1]。燕麥麩皮簡單加工后就可富集25%的燕麥β-葡聚糖,燕麥β-葡聚糖是一種水溶性膳食纖維,在降血脂、降血糖及提高免疫力,維持腸道菌群平衡等方面表現(xiàn)優(yōu)異[2]。另外,其還可作為化妝品的有效成分,提高皮膚抗過敏能力,延緩皮膚衰老等。可廣泛用于食品、保健品、化妝品等行業(yè)。

藥食用真菌具有調節(jié)免疫、降血糖、降血壓、降膽固醇、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒等多種保健功效[3-4]。其中韓芝(Ganodermalucidum)、猴頭菌(Hericiumerinaceus)、桑黃(Phellinusigniarius)以及奧德蘑(Oudemasiellapudensas)在保健品方面具有較高的開發(fā)價值。研究表明:韓芝、猴頭菌、桑黃以及奧德蘑具有增強機體免疫能力、抗氧化方面、抗腫瘤作用等功能活性[5-11],在食品、醫(yī)藥、保健等領域受到廣泛關注。近年來,已有不少研究以桑枝或燕麥麩皮為基質栽培靈芝、猴頭菌,桑黃等藥食用真菌,但主要集中于開發(fā)新的培養(yǎng)基質,并未對其混合菌質的成分加以研究,并且對桑枝-燕麥麩皮聯(lián)合使用的研究也較少。

雙向固體發(fā)酵是以具備活性成分的物質為發(fā)酵基質,以藥食用真菌為發(fā)酵菌種,定向控制所需發(fā)酵成分[12];而且基質在為真菌提供生長代謝所需營養(yǎng)成分的同時在真菌產(chǎn)生的酶作用下,其成分得到有效的分解或轉化并與菌體及其代謝產(chǎn)物共同構成具有不同功能的新型菌質,從而使發(fā)酵具有了雙向性,達到“1+1>2”的效果。本文以桑枝和燕麥麩皮為藥性基質,利用雙向固體發(fā)酵技術,在四種不同的碳氮比條件下,發(fā)酵韓芝、猴頭菌、桑黃以及奧德蘑四種藥食用真菌,評價其生長速度,并對最終得到的藥性菌質進行活性成分含量的測定和抗氧化功效的分析,為藥食用真菌在食品保健方面的開發(fā)和利用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

韓芝、桑黃、猴頭菌、奧德蘑、桑枝、燕麥麩皮 均由北京市農(nóng)業(yè)科學研究院贈送;蘆丁 中國藥品生物制品檢定所;無水葡萄糖、苯酚、濃硫酸、氫氧化鈉、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鄰苯三酚、無水乙醇、30%雙氧水、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)北京化工廠;硫酸銅、亞硝酸鈉、硝酸鋁、酒石酸鈉、焦性沒食子酸、鄰二氮菲、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、碳酸鈉 國藥化學試劑公司;聚乙烯袋 北京半夏科技發(fā)展有限公司。

TB-214電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;JY3002電子天平 舜宇恒平科學儀器有限公司;KQ-300E數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;3-18K高速自動離心機 德國Sigma公司;HW·SY11-K電熱恒溫水浴鍋 北京市長風儀器儀表公司;UVmini-1240紫外分光光度計 SHMADZU公司;SPX-250GB智能光照培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械有限公司;FW-80高速自動粉碎機 西安儀創(chuàng)實驗室儀器設備有限公司;DHG-9030A電熱恒溫干燥箱 北京精科華瑞有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 桑枝和燕麥麩皮的預處理 首先將桑枝按料水比1∶1.2 (g/g)加水進行預濕2 d,每天手動攪拌數(shù)次并覆蓋塑料膜,保證桑枝盡可能均勻吸水進行預濕。按桑枝干料的2.2倍質量稱取預濕后的桑枝,加入表1中相應質量的燕麥麩皮,最后加入燕麥麩皮干重1.2倍的水,用玻璃棒攪拌至均勻。

1.2.2 培養(yǎng)基的配制 碳氮比,是指有機物中總碳與總氮含量的比值,一般用“C/N”表示。根據(jù)青島科標檢測研究院有限公司檢測數(shù)據(jù)知桑枝的碳含量為66%,氮含量為1%;燕麥麩皮的碳含量為43.96%氮含量為3.28%,通過計算得表1配料比。按照表1四種不同的碳氮比稱取培養(yǎng)基,裝入長為15 cm×6 cm的聚乙烯袋中,每袋150 g,加入1.48 g的食用堿,121 ℃下滅菌40 min,備用。

表1 桑枝和燕麥麩皮配比表Table 1 Ingredients ratio of mulberry and oat bran

1.2.3 平均生長速度的測定 培養(yǎng)基滅菌后每袋接入1 cm2斜面菌塊,放入培養(yǎng)箱中于28 ℃下,避光培養(yǎng)10～20 d,不同真菌生長速度不同,直至菌絲長滿培養(yǎng)基底部,發(fā)酵完全為止。每組設3個平行,濕度控制在60%左右。在菌絲開始生長處劃線記為生長起點,培養(yǎng)一段時間后在菌絲體延伸所在處再次劃線記為生長終點,測量菌絲的延伸長度,以其延伸長度記為生長速度,計算平均生長速度。

1.2.4 活性成分含量的測定 取1.2.3中的菌質于烘箱中烘干,粉碎機粉碎后過80目網(wǎng)篩即為待測樣品,其中以未接種菌塊的培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中于28 ℃下,避光培養(yǎng)10～20 d后所得菌質作為對照組。分別取2 g 樣品加入16 mL 去離子水或80%乙醇,25 ℃ 300 W下超聲提取1 h 后,在室溫下10000 r/min離心10 min,過濾后取其上清液即為水提液或醇提液,對二者進行活性成分測定。

1.2.4.1 水提液中多糖含量的測定 采用苯酚-硫酸法[13]法測定發(fā)酵后體系的多糖含量,以無水葡萄糖為標準物質,未發(fā)酵基質水提液為空白對照,含量以mg/g干物質表示;將待測樣品稀釋200倍后,取1 mL試樣于試管中,加入0.5 mL 5%苯酚溶液混勻,再加入2.5 mL濃硫酸充分混勻,5 min后封管沸水浴1 h,取出冷卻至室溫后在490 nm處測其吸光度值。以葡萄糖濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,得標準曲線方程為:y=12.403x+0.0027,R2=0.9996。將樣品所得吸光度帶入標準曲線方程中得到樣品濃度,按下式計算得出含量:含量=(樣品濃度×稀釋倍數(shù)×16)/2,1.2.4.2～1.2.4.4同。

1.2.4.2 水提液中多肽含量的測定 利用福林酚法[14]測定發(fā)酵前后體系多肽的含量,以牛血清蛋白為標準物質,未發(fā)酵基質水提液為空白對照,含量以mg/g干物質表示;將待測樣品稀釋20倍后,取1 mL試樣于試管中,加入5 mL試劑甲迅速混合在25 ℃下水浴10 min,逐管加入試劑乙混勻,25 ℃水浴反應30 min后在700 nm處測吸光度。(試劑配制:試劑甲A:5 g Na2CO3+1 g NaOH+0.125 g酒石酸鉀鈉溶于500 mL去離子水;B:0.5 g硫酸銅溶于去離子水(50份A與1份B混合均勻。試劑乙:福林酚∶去離子水=1∶1)以牛血清蛋白濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,得標準曲線方程為:y=0.5125x+0.1005,R2=0.9903。

1.2.4.3 醇提液中黃酮含量的測定 用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法[15]測定發(fā)酵前后體系的黃酮含量,以蘆丁為標準物質,未發(fā)酵基質醇提液為空白對照,含量以mg/g干物質表示;取稀釋2.5倍后的待測樣品溶液2 mL于10 mL容量瓶中,加入3 mL 30%乙醇溶液,隨后加入5% NaNO2溶液0.3 mL,搖勻后靜置6 min,再加入0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液,搖勻靜置6 min后加入4 mL 1 mol/L的NaOH溶液,加水定容至10 mL,搖勻放置15 min。在510 nm下測定吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,得標準曲線方程為:y=5.8x+0.032,R2=0.9996。

1.2.4.4 醇提液中多酚含量的測定 按福林酚法[16]測定發(fā)酵前后體系的多酚的含量,以沒食子酸為標準物質,未發(fā)酵基質醇提液為空白對照,含量以mg/g干物質表示。取稀釋5倍后的待測樣品溶液1 mL于10 mL容量瓶中,然后依次加入1 mL蒸餾水,0.5 mL福林酚溶液,1.5 mL 26.7% Na2CO3溶液,去離子水定容至10 mL,搖勻。室溫下反應2 h,760 nm處測定其吸光度。以沒食子酸濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,得標準曲線方程為:y=1.473x-0.1074,R2=0.9909。

1.2.5 抗氧化能力測定 以1.2.4中得到的提取液對DPPH自由基和羥自由基的清除率作為其抗氧化能力的衡量標準,清除率越高,抗氧化能力越強。以未發(fā)酵基質的水提液與醇提液為空白對照,結果以百分比表示。

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力測定 采用分光光度法[17]進行測定,取1.5 mL待測液與1.5 mL 2×10-4mol/L的DPPH溶液混勻記為A1管;取1.5 mL待測物溶劑與1.5 mL 2×10-4mol/L的DPPH溶液混勻記為A2管;取1.5 mL待測物溶劑與1.5 mL待測液混勻記為A2管,反應30 min后在517 nm處分別測定其吸光度。其清除率按下式計算。

清除率I(%)=(A2+A3-A1)×100/A2

不過筆者并不贊同過多地將“探究性”融入作文考察當中，對照這六條標準，江蘇高考作文題在“探究性”方面是弱的。但其實反面想想，難道江蘇不正因如此，才成就了其獨特的“個性”嗎？江蘇高考語文一向提倡與贊揚記敘文文體，希望在高考作文中挖掘出優(yōu)秀的記敘文，而因為在命題中“探究性”與“思辨色彩”的相對不強，才給了記敘文書寫一定的“喘息空間”。如果作文材料思辨色彩過于濃厚，連命題人都想讓學生去寫議論文了，學生哪還能寫出優(yōu)秀的記敘文來呢？

1.2.5.2 羥自由基清除能力測定 羥自由基清除率則是采用鐵氧化鄰二氮菲法[18]進行測定。取0.5 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲于試管中,1 mL 0.15 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH=7.4),0.5 mL蒸餾水,充分混合。加入0.5 mL 0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液,混勻后加0.5 mL 0.01%雙氧水,于37 ℃水浴60 min,在536 nm測吸光度,所得數(shù)值為損傷吸光度A1。以0.5 mL水替代損傷管中0.01% H2O2,操作同損傷管,得到未損傷吸光度A2,樣品管以0.5 mL樣品液代替0.01% H2O2,操作同損傷管,得到樣品管吸光度A3。清除率計算如下:清除率(%)=(A3-A1)×100/(A2-A1)

2 結果與分析

2.1 碳氮比對菌絲生長速度的影響

碳氮比是藥食真菌生長的重要因素。真菌菌絲的生長經(jīng)歷的延滯期、迅速生長期和衰退期三個階段[19],不同階段的生長速度不同,對碳氮比的要求不同。圖1為四種藥食用真菌菌絲在四種不同碳氮比下的生長狀態(tài)。經(jīng)測定和統(tǒng)計得到表2。從表2可以看出,不同的菌種對碳氮比的要求不同。隨著碳氮比的增大,韓芝菌絲體潔白濃密度相當,平均生長速度無顯著變化(p>0.05),但整體生長速度普遍高于其他三種真菌(p<0.05);猴頭菌生長速度隨碳氮比的增大呈上升趨勢,在碳氮比為50∶1 (g/g)時,平均生長速度高達(2.75±0.24) mm(p<0.05),但是菌絲生長的潔白濃密度略低于其它碳氮比;桑黃在碳氮比為20∶1 (g/g)時生長速度顯著低于其他碳氮比,且碳氮比30∶1～50∶1 (g/g)時生長速度無顯著差異;奧德蘑在考察碳氮比范圍內生長速度無顯著性差異。

表2 碳氮比對四種真菌菌絲生長速度的影響Table 2 Effects of C/N ratio on mycelial growth rates of four edible fungi

圖1 碳氮比對四種藥食用真菌(韓芝A,猴頭菌B,桑黃C,奧德蘑D)菌絲生長速度的影響Fig.1 Effects of C/N ratio on mycelial growth rate of four edible fungi(Ganoderma lucidum A,Hericium erinaceus B,Phellinus igniarius C,Oudemasiella radiate D)注:A、B、C、D每個圖中的碳氮比從左到右依次為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 g/g。

菌絲的生長是靠菌絲尖端的生長點及其自身分解的基物酶,將大分子的物質分解成小分子的物質進入體內的。本次實驗發(fā)現(xiàn),高碳氮比時,四種菌種的生長速度較快,有利于大分子物質分解進入體內。而宋愛榮等[20]證明較高的氮含量對菌絲的生長有益,該結論與本實驗結果不符。這可能與桑枝的特殊活性成分有關,鄒湘月[21]等研究發(fā)現(xiàn)在液態(tài)培養(yǎng)基中添加桑枝水提物對桑黃生物量的增長有顯著促進作用。說明菌絲體的生長應為多種物質共同作用的結果。

2.2 碳氮比對發(fā)酵菌質活性成分含量的影響

2.2.1 碳氮比對發(fā)酵菌質多糖含量的影響 碳氮比對發(fā)酵菌質多糖含量的影響見圖2,從圖2中可以看出,對照組多糖含量隨碳氮比的增加而減小,這與基質中燕麥麩皮比例的降低有關;大部分實驗組多糖含量高于相應對照組,是因為微生物菌絲體也富含多糖類物質,微生物生長將大分子淀粉類物質分解成小分子多糖,并逐漸轉化為自身營養(yǎng)物質,從而使多糖更易被提取和檢測[22]。并且,隨著碳氮比的增加,四種真菌發(fā)酵后多糖的含量均有降低趨勢但高于對照組。

圖2 碳氮比對四種藥食用真菌多糖含量的影響Fig.2 Effects of C/N ratio on polysaccharide contents of four edible fungi

除韓芝外,猴頭菌、桑黃和奧德蘑菌質隨著碳氮比的增加,其水提液中多糖含量呈下降趨勢。韓芝在碳氮比為20∶1～40∶1 (g/g)呈下降趨勢,在碳氮比為50∶1 (g/g)時多糖含量稍有上升,可能為在此碳氮比下基質中多糖已滿足其菌絲體生長所需營養(yǎng),自身生命代謝活動導致多糖含量增加;四種真菌在碳氮比為20∶1 (g/g)時,多糖含量最高,其中桑黃和奧德蘑最高可分別達到(132.80±1.16)和(111.22±4.83) mg/g干物質,約為發(fā)酵前水平的2倍,這與秦俊哲等[23]利用中藥渣為培養(yǎng)基培養(yǎng)靈芝得到的靈芝菌絲中多糖和氨基酸含量均比子實體提高2倍以上的結論相似。這是因為,隨著碳氮比的增大,微生物因生長而分解基質中的糖類物質,從而使多糖含量降低,此推論符合表2所得結果:隨著碳氮比的增加,微生物生長速度呈上升趨勢。

2.2.2 碳氮比對發(fā)酵菌質多肽含量的影響 碳氮比對發(fā)酵菌質多肽含量的影響見圖3,隨碳氮比的增加,韓芝菌質水提液中的多肽含量始終高于對照組,隨著碳氮比的增加,多肽含量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢,碳氮比為30∶1 (g/g)和40∶1 (g/g)時多肽含量較低;說明此碳氮比下韓芝將菌質中的多肽分解轉化為小分子氮源,以滿足自身生長需要,這也符合表2中韓芝在碳氮比為30∶1 (g/g)和40∶1 (g/g)時生長較快的結論。

圖3 碳氮比對四種藥食用真菌多肽含量的影響Fig.3 Effects of C/N ratio on polypeptide contents of four edible fungi

猴頭菌、桑黃和奧德蘑菌質多肽含量隨碳氮比的增加而均呈下降趨勢,分別由(92.57±5.55)、(133.15±4.24)、(127.84±3.42) mg/g干物質,降低至(21.07±1.41)、(29.50±1.26)和(21.07±1.30) mg/g干物質;并且在較低碳氮比時,三種真菌的多肽含量高于對照組水平,其中在碳氮比為20∶1 (g/g)時,桑黃和奧德蘑多肽含量遠高于對照組,隨碳氮比的增長多肽含量逐漸低于對照組,可能是碳氮比增大,菌絲體大量生長,分解代謝氨基酸產(chǎn)生乙酰輔酶A,參與三羧酸循環(huán),而氮元素含量較低,真菌維持自身生長所需多肽含量大于自身代謝所合成多肽量,使總體多肽含量降低。郭霞[24]在對桑黃的發(fā)酵過程中也發(fā)現(xiàn)氮源被大量利用參與菌絲和胞外多糖的合成,本實驗結論與其相符。

2.2.3 碳氮比對發(fā)酵菌質黃酮含量的影響 碳氮比對發(fā)酵菌質黃酮含量的影響見圖4,從圖4中可知,韓芝在碳氮比為30∶1～50∶1 (g/g)時,黃酮含量高于對照組;猴頭菌在碳氮比在20∶1～40∶1 (g/g)時黃酮含量高于對照組,且隨碳氮比的增長逐漸降低;桑黃黃酮含量在碳氮比為30∶1 (g/g)時最高達(1.34±0.01) mg/g干物質;奧德蘑黃酮含量則隨碳氮比的增加整體呈下降趨勢,由(1.86±0.08) mg/g干物質下降至(0.66±0.01) mg/g干物質,下降了約2/3。

圖4 碳氮比對四種藥食用真菌黃酮含量的影響Fig.4 Effects of C/N ratio on flavonoids contents of four edible fungi

2.2.4 碳氮比對發(fā)酵菌質多酚含量的影響 碳氮比對發(fā)酵菌質多酚含量的影響見圖5。從圖5中可知,在碳氮比大于20∶1 (g/g)時,除韓芝外,其它三種真菌多酚含量均低于對照組;韓芝菌質多酚含量隨碳氮比的增長總體呈先下降后增長趨勢,在碳氮比為30∶1 (g/g)時達到最低,為(12.85±0.56) mg/g干物質;猴頭菌與桑黃多酚含量趨勢均為先下降后趨于平緩,奧德蘑多酚含量隨碳氮比的增加先增長后下降最終趨于平緩,在碳氮比為30∶1 (g/g)時含量達到最高;與對照組相比猴頭菌、桑黃和奧德蘑在碳氮比為50∶1 (g/g)時,多酚濃度在發(fā)酵后分別下降了(6.57±0.18)、(6.78±0.25)和(5.64±0.47) mg/g干物質,下降了約1/3。

圖5 碳氮比對四種藥食用真菌多酚含量的影響Fig.5 Effects of C/N ratio on polyphenols contents of four edible fungi

發(fā)酵菌質多酚含量低于對照組的原因,可能在破壁過程中木質素等大分子酚類物質在多種酶的作用下被轉化利用合成了其它物質,因分解速率高于合成速率而呈現(xiàn)降低狀態(tài)。此外,真菌在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生自由基,自由基隨真菌代謝大量積累,可能使多酚含量降低。Nitayapat等[28]在使用香菇類真菌發(fā)酵橘子渣時也發(fā)現(xiàn)多酚含量急劇下降。魏龍[29]在靈芝-當歸雙向發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn),在發(fā)酵后的菌質中新檢測出了9種化合物;此外發(fā)酵后有8種物質含量明顯升高、8種物質含量明顯降低,表明發(fā)酵基質在真菌的多種酶作用下進行了復雜的分解、轉化與合成。敢小雙[26]也表示靈芝在生長過程中代謝掉了原來的一些物質,使其含量減少或消失。

2.3 碳氮比對發(fā)酵菌質抗氧化活性的影響

2.3.1 碳氮比對發(fā)酵菌質DPPH清除率的影響 實驗結果表明:發(fā)酵后水提液對于DPPH自由基幾乎無清除能力。而發(fā)酵后醇提液與空白對照相比均有較好的清除能力,韓芝的自由基清除能力隨碳氮比的增大先增強后減弱,在碳氮比為40∶1 (g/g)的時候達到了最大,最高清除率達到96.9%。實驗結果與魏龍[29]發(fā)現(xiàn)靈芝當歸雙向發(fā)酵中,隨著當歸添加量的增加,發(fā)酵菌質的DPPH自由基清除能力均呈先上升后下降趨勢的結果相似,說明韓芝的DPPH自由基清除率變化與發(fā)酵基質變化有很大關系。其它三種真菌發(fā)酵后的DPPH自由基清除能力均高于空白對照,并且隨碳氮比的增長變化不大。實驗結果表明,在發(fā)酵過程中,真菌代謝產(chǎn)生的酶將桑枝-燕麥麩皮中的有效成分充分的釋放出來,并且自身產(chǎn)生了活性物質,使其抗氧化能力大大的上升。

圖6 碳氮比對四種藥食用真菌發(fā)酵后醇提液的DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Effects of C/N ratio on DPPH· scavenging rate of origin and fermented ethanol extract of four edible fungi

2.3.2 碳氮比對發(fā)酵菌質羥自由基清除率的影響 在水提液(圖7)碳氮比小于30∶1 (g/g)時,四種真菌發(fā)酵后羥自由基清除能力相比于對照組均有提升,說明真菌水提液具有一定的抗氧化能力。高開顯[30]研究了靈芝發(fā)酵桑枝苦參的功效及成分變化,結果顯示苦參經(jīng)靈芝發(fā)酵后,其水提取物清除羥自由基能力顯著提高;而碳氮比大于30∶1 (g/g)后,除韓芝外,其它三種真菌發(fā)酵后羥自由基清除能力均低于對照組,隨碳氮比的增加,基質中燕麥麩皮含量減小,而發(fā)酵后菌質自由基清除能力也在減小;可能碳氮比較大時,真菌通過代謝將多糖和多肽轉化成了其他物質,從而使得水提液的抗氧化能力減弱。

圖7 碳氮比對四種藥食用真菌發(fā)酵后水提液的羥自由基清除率的影響Fig.7 Effects of C/N ratio on hydroxyl radical scavenging rate of fermented water extracting solution of four edible fungi

對于醇提液(圖8),韓芝發(fā)酵后羥自由基清除能力隨碳氮比的增大而增大,猴頭菌則先增大后減小,桑黃先減小后增大,而奧德蘑則呈不斷減小趨勢。醇提液羥自由基清除結果基本符合黃酮的變化趨勢,推測醇提液中對羥自由基有清除能力的活性物質為黃酮[31]。

圖8 碳氮比對四種藥食用真菌發(fā)酵后醇提液的羥自由基清除率的影響Fig.8 Effects of C/N ratio on hydroxyl radical scavenging rate of fermented ethanol extracting solution of four edible fungi

3 討論與結論

隨碳氮比的增加,韓芝、奧德蘑菌絲體生長速度未見顯著變化,猴頭菌與桑黃菌絲體生長速度明顯增長(p<0.05)。發(fā)酵后混合菌質活性成分含量明顯變化,當碳氮比為20∶1 (g/g)時,桑黃和奧德蘑多糖含量最高達到(132.8±1.16)和(111.22±4.83) mg/g干物質,多肽含量明顯增加,桑黃和奧德蘑多肽含量增加了一倍多;黃酮含量也有明顯增長。而多酚整體含量下降,在碳氮比為50∶1 (g/g)時,猴頭菌、桑黃和奧德蘑的多酚含量在發(fā)酵后下降了約1/3。不同的碳源[32]與氮源[33]對不同的菌絲體生長與代謝的影響有明顯差異。例如乳糖最適合靈芝菌體的生長、胞內多糖及靈芝酸的合成,而蔗糖則最有利于靈芝胞外多糖的合成[34]。藥食用真菌生長發(fā)育不同階段所需碳氮比不同。一般較低的碳濃度有利于菌絲體生長,促進碳源向菌絲體轉化,反之則有利于底物轉化為產(chǎn)物。Park等[35]發(fā)現(xiàn)碳氮比不僅影響許多生物代謝合成速率,對真菌菌絲體生長和胞外聚合物產(chǎn)量也有影響,并通過實驗證明較高的碳氮比對菌絲體生長和胞外聚合物生產(chǎn)有益。Babitskaia等[36]也發(fā)現(xiàn)當碳氮比為18∶1 (g/g)時,最適宜靈芝胞內多糖的合成,而碳氮比為25∶1 (g/g)時,胞外多糖產(chǎn)量最高。

目前公認通過真菌發(fā)酵可以提升發(fā)酵底物的抗氧化性,Divate[37]發(fā)現(xiàn)烏靈參的抗氧化活性受到發(fā)酵底物的顯著影響,并且不同的底物可能具有不同的抗氧化機制。高濃度的酚類和類黃酮化合物可能有助于烏靈參的抗氧化活性。Liu等[38]研究通過發(fā)酵技術,說明了游離酚和肽的變化對脫脂小麥胚芽總抗氧化性能的協(xié)同作用。謝麗源等[39]對23株不同靈芝菌株的主要活性物質多糖、多酚、黃酮、三萜含量進行測定,研究表明四種活性物質含量與各抗氧化測定方法間相關系數(shù)低,證明靈芝的抗氧化能力貢獻并不完全來自這四類物質。本實驗中發(fā)酵菌質醇提液對DPPH自由基有較強的清除能力,在碳氮比為40∶1 (g/g)時,韓芝DPPH自由基清除率最高達到96.9%;四種真菌對于羥自由基的清除也有較明顯的提升。本文中不同碳氮比的發(fā)酵基質下,同一菌種發(fā)酵后菌質的抗氧化能力不同;相同碳氮比發(fā)酵基質下不同菌種發(fā)酵后菌質的抗氧化能力也有明顯差異。綜合推測,發(fā)酵后菌質的抗氧化能力受多方面因素的影響,包括發(fā)酵基質、發(fā)酵菌種以及發(fā)酵條件等。就活性物質而言,雖然發(fā)酵后菌質多酚含量明顯下降,但其DPPH自由基和羥自由基清除能力明顯上升,判斷發(fā)酵后菌質主要依靠為多糖、多肽以及黃酮等多種物質協(xié)同作用達到抗氧化效果。