張國廣,沈 琳,黃冰晴,賴燕華,周 梅,鄒金美

(1.閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,福建漳州 363000;2.菌物產(chǎn)業(yè)福建省高校工程研究中心,福建漳州 363000)

龍眼(DimocarpuslongyanLour)俗名桂圓,是無患子科龍眼屬植物,屬于亞熱帶果樹,在中國和東南亞一些國家,如越南、泰國、菲律賓等國廣泛栽培。在中國主要分布于廣東、廣西、福建、臺灣和海南等省,云南、貴州和四川等省也有少量栽培。龍眼核是龍眼果實的種仁,其重量約占龍眼果實鮮重的17%[1],是龍眼果實加工中的主要廢棄物。

龍眼核富含淀粉和蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)成分,其淀粉含量在38.5%～60%之間,蛋白質(zhì)含量5.59%～7.4%,還原糖含量10.2%～14.13%,脂類含量在2.47%以上[2-3],是具有開發(fā)利用價值的生物質(zhì)營養(yǎng)資源。龍眼核也富含多酚類、黃酮類和多糖等活性物質(zhì),其提取物具有抗菌、抗氧化、抗癌、抗蟲等生物活性[1,4-9]。很多酚類和黃酮類物質(zhì)能夠賦予食用資源抗菌和抗氧化等保健功能,但該類物質(zhì)也賦予了食材的苦味和澀味等,甚至部分酚類或黃酮類成分長期食用可能會有一定的毒副作用,盡管有研究對龍眼核的毒理學(xué)進(jìn)行了探討,在動物飼喂試驗期內(nèi)(13周)沒有觀察到龍眼核的毒性效應(yīng)[10]。但因龍眼核口感澀苦,適口性較差,作為食用或飼用資源加以利用的報道并不多見[11],在局部地區(qū)作為一種中藥有少量的利用[12-13],其余多被焚燒或被丟棄,造成生物資源的浪費。用真菌發(fā)酵中草藥或工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生的廢棄物,以改善藥物療效或提高加工廢棄物的食用或藥用價值的研究表明，真菌發(fā)酵中藥材后可以改變其活性或藥用成分,具有減毒和增加相關(guān)療效的效果[14-16],真菌發(fā)酵普通食材也可以增加其活性成分[17-18]。本研究擬探討用靈芝發(fā)酵含有龍眼核的固體基質(zhì)后的主要活性成分含量變化及其抗氧化活性變化,為開發(fā)基于龍眼核的功能性食用或飼用菌質(zhì)營養(yǎng)資源提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

龍眼核 購買自福建科人公司;高粱和小麥 購自糧食市場;靈芝菌種 學(xué)院菌物實驗室保存;馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基 杭州濱和微生物試劑公司;蘆丁、齊墩果酸 標(biāo)準(zhǔn)品,中國食品藥品檢定研究院;沒食子酸 Sigma公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、2,4,6-三(2-吡啶基)-1,3,5-三嗪(TPTZ)、3-(2-吡啶基)-5,6-雙(4-磺苯基)-1,2,4-三嗪二鈉鹽(Ferrozine) 梯希愛上?；晒?總抗氧化測定試劑盒 南京建成生物公司;其它試劑 市售分析純。

Multiskan Go全波長酶標(biāo)儀 Thermo Scientific公司;AR124CN 電子分析天平 奧豪斯公司;UV-1100分光光度計 上海美譜達(dá)公司;JY99-IIDN超聲波細(xì)胞粉碎儀 寧波新芝公司;TGL-20M冷凍離心機(jī) 長沙湘儀公司;PE-400S破碎機(jī) 廣州旭朗機(jī)械設(shè)備公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 靈芝固體發(fā)酵龍眼核 PDA培養(yǎng)基按照說明書配制,配制后121 ℃高壓滅菌20 min,在超凈工作臺內(nèi)倒入直徑9 cm玻璃平板，制成PDA固體培養(yǎng)平板。超凈工作臺內(nèi)從靈芝母種中挑取約1 cm見方的小塊，放置在PDA培養(yǎng)平板中間,28 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),待菌絲基本長滿平板后備用。

小麥清洗后用清水浸泡24 h,撈至沸水中煮至小麥粒中無白心,撈出攤晾至小麥粒表面無明顯水分,將小麥粒裝入500 mL玻璃瓶中，裝至瓶高三分之二處，封口后126 ℃高壓滅菌2 h,得到小麥粒固體培養(yǎng)基，冷涼至室溫后，在超凈臺內(nèi)將長滿菌絲的靈芝菌種平板接種至小麥粒固體培養(yǎng)基中,一個活化的靈芝菌種平板接種一瓶小麥粒固體培養(yǎng)基。接種后,于28 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),待瓶中菌絲長滿小麥粒固體培養(yǎng)基后備用。

將購買的龍眼核清洗后,于鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)60 ℃烘干,用破碎機(jī)破碎成直徑4 mm左右的顆粒狀,使用高粱和龍眼核顆粒兩種材料制備固體培養(yǎng)基,設(shè)置高粱和龍眼核的重量比分別為100∶0、70∶30、30∶70和0∶100的4種培養(yǎng)基,即分別包含重量百分比為0%、30%、70%和100%龍眼核的4種固體培養(yǎng)基,采用上述真菌麥粒菌種培養(yǎng)基的制作方法對兩種材料進(jìn)行處理后，混合或單獨裝入500 mL玻璃瓶內(nèi)，裝料至瓶高三分之二處,126 ℃高壓滅菌2 h后,取出冷涼至室溫后接入上述準(zhǔn)備好的靈芝麥粒固體菌種,菌種接種量5%,每種培養(yǎng)基均同時設(shè)置不接菌對照組。

接菌組和對照組均放入28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),間隔24 h觀察一次,接種菌玻璃瓶表面觀察到靈芝菌絲長滿玻璃瓶后,再繼續(xù)培養(yǎng)7～10 d,將接菌組玻璃瓶和對應(yīng)的對照組基質(zhì)瓶取出，放置到鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，60 ℃烘至徹底干燥后粉碎備用。100%龍眼核組中靈芝菌絲生長最慢,2個月左右菌絲才長滿全瓶。

1.2.2 提取物的制備 以60%乙醇為提取溶劑,采用超聲波輔助法提取1.2.1靈芝發(fā)酵所制備的固體基質(zhì)和其對照組的有效成分,超聲波破碎程序設(shè)置為：破碎5 s、間歇5 s,提取30 min,超聲頻率40 Hz、超聲功率800 W,溫度60 ℃。提取物最后定量為：以發(fā)酵或未發(fā)酵的基質(zhì)質(zhì)量計0.1 g/mL,共計制備8種不同的提取物,為方便表述分別用字母編號表示(表1)。

表1 8種提取物的字母編號Table 1 Alphabet code of 8 kinds of extracts

1.2.3 提取物中糖、多酚類、黃酮類和總?cè)坪康臏y定 采用苯酚-硫酸法測定提取物中糖含量[19],以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,測得的標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程為y=16.234x - 0.0142,R2=0.989;

采用福林酚法測定提取物中多酚類物質(zhì)含量[4],以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品,測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=1.6369x+0.0143,R2=0.9984;

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法測定提取物中黃酮類含量[20],以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=1.0626x+0.0082,R2=0.9946;

采用香草醛-高氯酸顯色法測定提取物中總?cè)莆镔|(zhì)含量[21],以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品,測得的標(biāo)準(zhǔn)線性方程為y=11.556x - 0.013,R2=0.9983。

1.2.4 總抗氧化能力的測定 8種接種靈芝或未接種靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基提取物總抗氧化能力測定方法，按試劑盒說明書提供的方法進(jìn)行,總抗氧化能力(T-AOC)定義為：在37 ℃時,每分鐘每毫升樣品液使反應(yīng)體系的520 nm波長處吸光度值每增加0.01時,為一個總抗氧化能力單位(U)。

1.2.5 總還原力的測定和清除DPPH自由基能力測定 將A、B、C、D、A′、B′、C′和D′ 8種提取物分別配成濃度為0.001、0.002、0.005、0.01、0.1 g/mL的測試液。

總還原力測定采用鐵氰化鉀還原法測定,操作步驟參照文獻(xiàn)[20];

DPPH自由基清除能力的測試方法參考文獻(xiàn)[19]步驟進(jìn)行。

1.2.6 ABTS自由基清除能力的測定 參考文獻(xiàn)[4]步驟并修改使之適用于酶標(biāo)儀測定:稱取ABTS 3 mg,溶解于0.735 mL純水中;稱取過硫酸鉀1 mg,溶解于1.43 mL純水中;取0.4 mL ABTS與0.4 mL 過硫酸鉀溶液混勻,黑暗、室溫靜置12 h,取出后稀釋30倍左右,使其吸光值落在0.8左右;酶標(biāo)板每5孔為一組共取兩組,依次加入0.16 mL ABTS工作液,然后在一組5孔中加入0.04 mL固體基質(zhì)提取物(A),另外一組5孔中分別加入0.04 mL 60%乙醇為(A0),微型渦旋儀上輕微振蕩10 s,混勻,靜置6 min后,在酶標(biāo)儀中734 nm波長下測定各孔的吸光值;按以下公式計算清除率:

1.2.7 Fe3+還原抗氧化能力的測定 采用FRAP法測定,參考文獻(xiàn)[4]并修改使之適用于酶標(biāo)儀:由0.3 mol/L pH3.6 的乙酸鈉緩沖液、10 mmol/L TPTZ溶液(TPTZ溶液采用40 mmol/L HCl溶解)和20 mmol/L三氯化鐵以體積比10∶1∶1混勻,現(xiàn)配現(xiàn)用;取150 μL上述混勻FRAP試劑于酶標(biāo)管中,加入15 μL 60%乙醇和5 μL不同濃度的提取物,將反應(yīng)混合物在37 ℃下孵育30 min,用酶標(biāo)儀于593 nm波長下測定各板孔的吸光值。吸光值越高，表明對Fe3+的還原能力越強(qiáng)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

樣品測定采用3個重復(fù)。實驗結(jié)果用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,運用Origin 6.1軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖類、多酚類、黃酮類和三萜類物質(zhì)測定結(jié)果

由表2可知，A、B、C、D 4種未接靈芝發(fā)酵處理的提取物中,隨著基質(zhì)中龍眼核含量的增加,糖含量顯著增加(p<0.05),可能是因為龍眼核中小分子糖類含量較高粱中的多,所以在用60%乙醇提取時，溶解在溶劑中的糖類物質(zhì)較多,在A′、B′、C′、D′ 4種接靈芝菌發(fā)酵基質(zhì)的提取物中,糖含量均比未接菌顯著性增加(p<0.05),可能是靈芝生長過程中，能夠分解利用基質(zhì)中的營養(yǎng)物質(zhì),在菌體構(gòu)建過程中重新產(chǎn)生可溶解于60%乙醇中的糖類。

表2 8種提取物中幾種活性物質(zhì)測定結(jié)果Table 2 Determination results of several active components in 8 kinds of extracts

A、B、C、D 4種未接菌基質(zhì)的提取物中,隨基質(zhì)中龍眼核含量的增加,多酚類物質(zhì)含量顯著性增加(p<0.05),而在接菌的A′、B′、C′、D′ 4種基質(zhì)的提取物中,除A′組外,B′、C′和D′組多酚類物質(zhì)含量與對應(yīng)的B、C和D組多酚類含量相比，都顯著性降低(p<0.05),可能是靈芝在其菌絲生長過程中，能分泌相應(yīng)的酶，分解利用龍眼核中的大量多酚類物質(zhì)。鄒禮根等[22]在用靈芝發(fā)酵綠茶中也發(fā)現(xiàn),靈芝能顯著性降低茶葉中的茶多酚含量。A′組多酚類含量顯著高于未接菌的A組(p<0.05),可能是靈芝在純高粱培養(yǎng)基生長過程中，菌絲會產(chǎn)生一些多酚類物質(zhì),未接靈芝的A組中多酚類含量在8個試驗組中最低(表2)。

在8種基質(zhì)中，黃酮類物質(zhì)的變化趨勢和多酚類物質(zhì)的變化趨勢基本一致(表2),可能在靈芝菌絲的生長過程中,能分泌某些酶，從而分解或利用龍眼核中的黃酮類物質(zhì),靈芝菌絲生長中也會在菌體內(nèi)產(chǎn)生一些新的黃酮類物質(zhì)。張平等[14]在使用靈芝發(fā)酵枇杷葉時，也發(fā)現(xiàn)枇杷葉的黃酮類物質(zhì)顯著性下降。

未接靈芝菌的A、B、C、D 4種提取物中,總?cè)坪侩S基質(zhì)中龍眼核含量的增加基本呈現(xiàn)小幅度增加趨勢(表2),在接菌的C′和D′ 2種提取物中,總?cè)坪颗c對應(yīng)的C和D組比有所下降,但差異不顯著(p>0.05),說明龍眼核自身含有三萜類物質(zhì),靈芝菌絲生長中能夠分解利用龍眼核的三萜類物質(zhì);而純高粱基質(zhì)經(jīng)過靈芝發(fā)酵后的A′與對照A組比,三萜類物質(zhì)含量顯著性增加(p<0.05),說明靈芝菌絲體構(gòu)建過程中有三萜類物質(zhì)的生成[23]。

2.2 總抗氧化能力分析

由圖1可知，A、B、C、D 4種未接靈芝發(fā)酵的基質(zhì)提取物，其總抗氧化活性隨基質(zhì)中龍眼核含量的增加而增強(qiáng),其總抗氧化活性的變化可能與其多酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)含量的遞增有關(guān)[4];與B、C、D提取物相比,接入靈芝發(fā)酵的B′、C′和D′ 總抗氧化能力減小,可能與靈芝對龍眼核發(fā)酵后使得基質(zhì)中的多酚和黃酮類物質(zhì)含量降低有關(guān),A′組比未接菌A組的總抗氧化活力略強(qiáng),可能與靈芝接種高粱后，在生長過程中產(chǎn)生的活性物質(zhì)有關(guān)[17]。

圖1 8種不同提取物總抗氧化能力測定結(jié)果Fig.1 Determination results of total antioxidant capacity of 8 different extracts

2.3 總還原力分析

由圖2可知，8種提取物在所設(shè)定的濃度范圍0.001～0.1 g/mL內(nèi)，隨著濃度的升高,總還原力呈上升的趨勢。三種包含30%、70%和100%龍眼核的B′、C′和D′與未發(fā)酵的B、C和D相比，總還原能力下降,可能是靈芝發(fā)酵后菌質(zhì)內(nèi)的酚類和黃酮類物質(zhì)含量下降所致;純高粱接入靈芝發(fā)酵組A′總還原力相對A組有所提高,可能與靈芝菌絲生長中產(chǎn)生的具有還原能力的物質(zhì)有關(guān)[17-18]。

圖2 8種不同提取物的總還原力測定結(jié)果Fig.2 Determination results of total reducing capacity of 8 different extracts

2.4 清除DPPH自由基能力比較

由圖3可知，8種提取物在所設(shè)定的濃度范圍0.001～0.1 g/mL內(nèi)，隨著濃度的升高,DPPH自由基的清除能力呈上升的趨勢。C、D組未經(jīng)過靈芝發(fā)酵的基質(zhì)，其DPPH自由基清除能力較強(qiáng),設(shè)定的最低濃度清除能力能夠達(dá)到80%以上,經(jīng)過靈芝發(fā)酵后DPPH自由基清除能力均有下降,可能是靈芝發(fā)酵后龍眼核內(nèi)的多酚類和黃酮類物質(zhì)含量下降所致;A′組DPPH自由基清除能力相對A組有較大的增強(qiáng),可能與靈芝菌絲生長中產(chǎn)生的活性物質(zhì)有關(guān)[17-18]。

圖3 8種不同提取物清除DPPH自由基能力結(jié)果Fig.3 Determination results of scavenging DPPH ability of 8 different extracts

2.5 ABTS自由基清除能力的測定結(jié)果

由圖4可知，8種基質(zhì)的提取物在所設(shè)定的濃度范圍0.001～0.1 g/mL內(nèi)，隨著濃度的提高，ABTS自由基的清除率呈現(xiàn)上升的趨勢。含有相同重量百分比龍眼核的培養(yǎng)基質(zhì)接菌培養(yǎng)后提取物對ABTS清除率較未接菌處理組的清除能力下降,可能與靈芝發(fā)酵后基質(zhì)內(nèi)多酚類和黃酮類物質(zhì)含量的下降有關(guān)[24]。A′組ABTS自由基清除能力相對A組有所提高,可能與靈芝菌絲在高粱中生長產(chǎn)生的活性物質(zhì)有關(guān)[17-18]。

圖4 8種不同提取物ABTS自由基清除能力Fig.4 Determination results of scavenging ABTS ability of 8 different extracts

2.6 Fe3+還原能力的測定結(jié)果

由圖5可知，6種包含有龍眼核的基質(zhì)提取物在所設(shè)定的濃度范圍0.001～0.01 g/mL內(nèi)，隨著各自濃度的升高，其Fe3+還原能力呈現(xiàn)上升的趨勢,不含龍眼核的A和A′組無論有無靈芝的發(fā)酵，對Fe3+還原能力均較弱;未使用靈芝發(fā)酵的B、C、D組和靈芝發(fā)酵的B′、C′、D′組相比，對Fe3+的還原能力更強(qiáng)。

圖5 8種不同提取物Fe3+還原能力Fig.5 Determination results of Fe3+ reduction ability of 8 different extracts

3 討論與結(jié)論

本研究中龍眼核經(jīng)過靈芝固體發(fā)酵后,發(fā)酵龍眼核提取物中的糖的含量顯著性增加(p<0.05),多酚類和黃酮類物質(zhì)含量較未發(fā)酵的對照組顯著性降低(p<0.05),說明靈芝生長中能夠利用或分解培養(yǎng)基質(zhì)中的酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)[14-15,22],靈芝發(fā)酵中草藥的研究也表明，靈芝發(fā)酵能顯著改變中藥材中的活性成分,起到減毒增效的作用[15-16]?？寡趸芰z測結(jié)果表明，靈芝固體發(fā)酵龍眼核后的提取物仍然保持了一定的抗氧化活性,說明靈芝發(fā)酵龍眼核后產(chǎn)生的菌質(zhì)兼具了營養(yǎng)和保健兩種屬性。靈芝對高粱的發(fā)酵表明，發(fā)酵后(A′組)增加了高粱的抗氧化活性,該結(jié)果也和猴頭菌[17]和靈芝[18]發(fā)酵普通食材可以增加食材的保健成分和保健效果的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果為龍眼核的食用或飼用資源的拓展利用提供了實驗依據(jù)。