吳玉新,張可欣,蔣 慧,湯曉娟,徐 巖,黃衛(wèi)寧,*,李 寧,Filip Arnaut

(1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122;2.廣州焙樂道食品有限公司,廣東廣州 511400;3.焙樂道食品集團(tuán),比利時(shí)布魯塞爾 B1702)

面包具有豐富的營養(yǎng)、細(xì)膩的口感,是一種美味又健康的食品。從傳統(tǒng)意義上來說,面包是由高筋粉為主要原料,與水以及發(fā)酵劑經(jīng)過攪拌、發(fā)酵和烘焙而成。隨著人們生活水平的提高,對面包的風(fēng)味口感以及營養(yǎng)的要求越來越高,因此研發(fā)新的優(yōu)良風(fēng)味、營養(yǎng)健康的面包勢在必行。

甜酒釀在中國民間流傳已久。甜酒釀是利用酒曲中的微生物,以糊化的糯米為原料,利用酒曲中的根霉和米曲霉將糊化后的淀粉糖化,水解成低分子的糖類物質(zhì),釀酒酵母利用糖化產(chǎn)物產(chǎn)生醇類物質(zhì),給酒釀帶來獨(dú)特的風(fēng)味[1]。乳酸菌產(chǎn)生乳酸、乙酸等酸味物質(zhì),調(diào)節(jié)酒釀體系中的pH,并在酶的作用下與醇類物質(zhì)反應(yīng)生成酯類化合物,使得酒釀具有宜人的香氣[2]。甜酒釀具有營養(yǎng)豐富且風(fēng)味獨(dú)特的特點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于谷物加工產(chǎn)品中。李志建等[3]在饅頭中添加甜酒釀來改善饅頭的風(fēng)味。黃璐等[4]在面包中添加酒釀濾汁,發(fā)現(xiàn)制得的面包儲(chǔ)藏期得到延長,風(fēng)味也得到改善。但是由于酒釀中固形物含量大于50%[5],若將固形物丟棄就會(huì)造成巨大的浪費(fèi)。

因此,本文旨在研究添加不同發(fā)酵時(shí)間甜酒釀的面團(tuán)中蛋白酶和微觀結(jié)構(gòu)的變化以及面包的風(fēng)味化合物特征,探索出最佳發(fā)酵時(shí)間,以期為酒釀面包的品質(zhì)改善提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甜酒曲 廣西酒曲(GX);即發(fā)活性干酵母 樂斯福(明光)有限公司;黃油 福臨門(張家港)有限公司;小麥粉 中糧集團(tuán)有限公司;粳糯米、食鹽、白砂糖 市售;氫氧化鈉、茚三酮、甘氨酸、氯化鈉 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;羅丹明B、異硫氰酸熒光素(FITC) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;OTC冰凍切片包埋劑 徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司。

WSYH26A中式電蒸鍋 廣東美的生活電器制造有限公司;BSC-250恒溫恒濕箱、HHS-21-4電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SCION SQ 456-GC四級(jí)桿質(zhì)譜氣質(zhì)聯(lián)用儀 美國布魯克公司;75 μm CAR/PDMS 固相微萃取頭 美國Supel-co公司;CM1950冰凍切片機(jī) 德國徠卡公司;LSM710激光共聚焦顯微鏡 德國蔡司公司;SM-25攪拌缸、SPC-40SP醒發(fā)箱、SM-503電烤爐、SM302N切片機(jī) 新麥機(jī)械(無錫)有限公司;CT3質(zhì)構(gòu)分析儀 美國Brookfield公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 甜酒釀的制備 稱取250 g糯米,在自來水(500 g左右)中浸泡5 h左右,稱取浸泡后的糯米380 g,大火蒸制10 min后,在糯米表面淋少量水,再蒸制20 min,冷卻,待溫度降至36～38 ℃后,拌入甜酒曲(接種量0.5% w/w),最后放置在30 ℃,濕度85%條件下分別發(fā)酵0、24、48、72 h。

1.2.2 甜酒釀pH及總可滴定酸度(TTA)測定 根據(jù)王益姝等[6]的方法測定不同發(fā)酵時(shí)間的甜酒釀的pH和TTA。分別稱取不同發(fā)酵時(shí)間(0、24、48、72 h)的甜酒釀10 g,量取90 mL的蒸餾水,放入攪拌子,置于磁力攪拌器上攪拌均勻靜置10 min后測定pH。隨后用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定至pH為8.6時(shí)消耗NaOH的毫升數(shù)即為TTA。

1.2.3 甜酒釀面團(tuán)和面包的制備 制備總粉質(zhì)量為300 g的小麥面團(tuán)體系,加入酵母4.5 g、鹽3 g、糖18 g和水165 g,放入攪拌缸中攪拌,先慢速(60 r/min)攪拌2 min,再快速(120 r/min)攪拌4 min。而后將12 g的黃油倒入攪拌缸中,先慢速攪拌1 min至面團(tuán)將黃油全部吸收,再快速攪拌3 min至面筋網(wǎng)絡(luò)形成。面團(tuán)靜置松弛5 min,經(jīng)切割、搓圓后再靜置5 min,整型后放入醒發(fā)箱(溫度38 ℃,相對濕度85%)中醒發(fā)65 min,最后放入烤箱中上火170 ℃,下火210 ℃烘焙21 min。甜酒釀面包則用發(fā)酵48 h的10%甜酒釀代替小麥粉制作。

1.2.4 甜酒釀面團(tuán)的面筋蛋白與超微結(jié)構(gòu)

1.2.4.1α-氨基態(tài)氮的測定 稱取1.25 g凍干粉(未添加酵母的醒發(fā)前后的面團(tuán)凍干所得),加入25 mL 1 mol/L的NaCl溶液,震蕩搖勻,離心(18000×g,4 ℃,30 min)取上清液,參考Thiele等[7]的方法用茚三酮測定上清液中可提取α-氨基態(tài)氮的含量,以甘氨酸為標(biāo)樣制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.3366x+0.0638,R2=0.9996),并進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。

1.2.4.2 甜酒釀面團(tuán)超微結(jié)構(gòu) 根據(jù)1.2.3的配方制備面團(tuán),為排除酵母產(chǎn)氣的影響,故不添加酵母[8]。通過激光共聚焦顯微鏡觀察面團(tuán)的超微結(jié)構(gòu),用剪刀剪取2 g左右的面團(tuán)于冷凍切片的托盤上,用Leica膠將面團(tuán)完全包裹,在-20 ℃冰箱中凍藏約4～5 h至內(nèi)部面團(tuán)凍實(shí),在冰凍切片機(jī)上切片處理,切取20 μm的薄片。根據(jù)Silva等[9]描述的方法,以丙酮為溶劑,配制0.25%(w/w)的異硫氰酸熒光素(FITC)和0.025%的羅丹明B熒光染料。將染色液覆蓋到切片上靜置2 min后,用蒸餾水脫色,吸去多余水分,蓋上載玻片,在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察。設(shè)置目鏡的放大倍數(shù)為10×,物鏡放大倍數(shù)為20×。FITC和羅丹明B的激發(fā)/發(fā)射波長分別為488/518 nm和568/625 nm。

1.2.5 甜酒釀面包的比容與香氣化合物分析

1.2.5.1 甜酒釀面包風(fēng)味測定 用鑷子夾取面包芯,稱取5 g樣品置于樣品瓶中,插入已老化的75 μm Car/PDMS萃取頭,在60 ℃恒溫水浴中頂空萃取40 min,隨后進(jìn)樣,于250 ℃解吸3 min,同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)。

氣相色譜條件[10-11]:DB-WAX毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),載氣為He,流速0.8 mL/min,起始溫度40 ℃,3 min后以5 ℃/min升溫至90 ℃,隨后以10 ℃/min升溫至230 ℃,保持7 min。

質(zhì)譜條件:電離方式為EI,放射電流80 μA,電子能量70 eV,界面溫度250 ℃,離子源溫度200 ℃。全掃描進(jìn)行采集,掃描范圍為質(zhì)荷比15～300。通過GC-MS分析軟件系統(tǒng)完成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理。

1.2.5.2 甜酒釀面包的比容測定 面包烘烤后在室溫下冷卻2 h,采用菜籽置換法[12]測定面包的比容,計(jì)算公式如下:

式(1)

1.2.5.3 感官評(píng)定 采用九分嗜好法對空白面包(WB)和甜酒釀面包(FRB)進(jìn)行感官鑒評(píng)[11]。評(píng)分小組由20名(10名女性,10名男性)受到感官鑒評(píng)專業(yè)訓(xùn)練的人員組成,從9分到1分表示從喜歡到不喜歡。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Excel 2013對數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算整理、Origin 9.1繪制圖表、SPSS 16.0分析數(shù)據(jù)之間的顯著性差異,p<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜酒釀發(fā)酵過程中pH和TTA變化

由于在甜酒釀發(fā)酵早期,酒曲中的霉菌代謝產(chǎn)生琥珀酸、乙酸以及蘋果酸等有機(jī)酸[14],所以甜酒釀的pH不斷下降,在18 h后基本穩(wěn)定在4.0左右,達(dá)到面團(tuán)發(fā)酵劑的適宜pH。隨著有機(jī)酸的不斷積累,TTA也逐漸在20 h時(shí)增至7.98并趨于穩(wěn)定。pH和TTA能顯著影響酒釀發(fā)酵液中的蛋白酶和淀粉酶等的酶活[15],使面團(tuán)具有較好的加工品質(zhì),并最終影響面包品質(zhì)[16]。當(dāng)發(fā)酵至48 h后,甜酒釀的TTA基本趨于穩(wěn)定,這與Wu等[17]的測定結(jié)果相似。

圖1 甜酒釀發(fā)酵過程中pH與TTA的變化Fig.1 Changes of pH and TTA value during fermentation of fermented glutinous rice

2.2 甜酒釀面團(tuán)的蛋白水解程度與超微結(jié)構(gòu)

2.2.1 不同發(fā)酵時(shí)間甜酒釀對面團(tuán)蛋白水解程度的影響 蛋白酶是面包發(fā)酵過程中的關(guān)鍵酶之一,少量的蛋白酶有利于面團(tuán)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定,過量的蛋白酶則會(huì)對面團(tuán)產(chǎn)生負(fù)面影響。通過游離α-氨基態(tài)氮的含量表征含甜酒釀面團(tuán)中蛋白水解程度,Thiele等[7]及Loponen等[18]均采用這種方法來測定酸面團(tuán)中蛋白質(zhì)的水解程度。如圖2所示,各實(shí)驗(yàn)組面團(tuán)中的α-氨基態(tài)氮含量在醒發(fā)后差異變大,除發(fā)酵0 h甜酒釀面團(tuán)(FRD)外,所有面團(tuán)在醒發(fā)后α-氨基態(tài)氮含量都得到增加,這與Huang等[15]的研究結(jié)果相似。在甜酒釀中,酒曲中的霉菌除了有較強(qiáng)的淀粉水解和蛋白質(zhì)水解活性[19],隨著甜酒釀發(fā)酵時(shí)間的延長,霉菌的菌絲和孢子開始自溶,也會(huì)釋放蛋白酶[20]。因此,推測添加了不同發(fā)酵時(shí)間的甜酒釀的面團(tuán)在醒發(fā)后,蛋白質(zhì)水解程度顯著增加,一部分的蛋白質(zhì)水解有利于將糯米中的蛋白質(zhì)分解成小分子的氨基酸,形成一種可以包含更多氣體的結(jié)構(gòu)。但是過量的蛋白酶則會(huì)降解小麥蛋白,弱化面筋,對面包質(zhì)構(gòu)產(chǎn)生負(fù)面影響,所以優(yōu)選出最佳蛋白酶酶活的發(fā)酵時(shí)間尤為重要[20]。

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間甜酒釀面團(tuán)發(fā)酵前后可提取α-氨基態(tài)氮含量Fig.2 Extractable α-amino nitrogen content in dough before and after fermentation with fermentedglutinous rice in different fermentation time注:圖中不同小寫字母代表醒發(fā)前或醒發(fā)后不同發(fā)酵時(shí)間的差異顯著性(p<0.05)，圖5同。

2.2.2 不同發(fā)酵時(shí)間甜酒釀對面團(tuán)超微結(jié)構(gòu)的影響 圖3描述了在激光共聚焦顯微鏡下添加不同發(fā)酵時(shí)間甜酒釀的面團(tuán)超微結(jié)構(gòu),其中FITC將淀粉顆粒染成綠色,羅丹明B將面筋蛋白染為紅色。如圖3A所示,空白面團(tuán)中面筋蛋白以膜狀形態(tài)存在,結(jié)構(gòu)完整,黑色孔洞少;而淀粉顆粒均勻鑲嵌、包裹在面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中,起到支撐蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的作用,圖中兩組分結(jié)合均勻且致密,但引入甜酒釀之后,尤其是加入發(fā)酵0 h的甜酒釀(圖3B),其阻礙了面團(tuán)中面筋網(wǎng)絡(luò)的形成,這與甜酒釀對面筋的稀釋作用和對二硫鍵的破壞作用均有關(guān)。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,糯米中的蛋白質(zhì)部分降解,蛋白與淀粉的致密結(jié)構(gòu)得以疏松,有利于氣體進(jìn)入到面團(tuán)中[21]。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間延長至48 h時(shí),其面團(tuán)(圖3D)微觀結(jié)構(gòu)中的黑色孔洞的面積最小,且相比于其他甜酒釀組,其結(jié)構(gòu)更為完整,淀粉顆粒與蛋白質(zhì)的更加均勻。但當(dāng)發(fā)酵時(shí)間延長至72 h時(shí),蛋白酶酶活性高,面團(tuán)過度酸化導(dǎo)致小麥面筋降解,阻礙了面筋網(wǎng)絡(luò)的形成,不利于面團(tuán)持氣[15]。

圖3 不同面團(tuán)的激光共聚焦超微結(jié)構(gòu)圖(200×)Fig.3 CLSM images of different doughs(200×)注:不添加發(fā)酵酒釀的面團(tuán)(A),添加發(fā)酵0 h(B),24 h(C),48 h(D)和72 h(E)酒釀的面團(tuán)。第一列為淀粉和面筋網(wǎng)絡(luò);第二列為面筋網(wǎng)絡(luò);第三列為淀粉;方塊代表面筋蛋白,三角形代表孔洞,圓圈代表淀粉顆粒。

小麥面粉中的麥谷蛋白和麥醇溶蛋白形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)能夠使氣體截留[22],糯米粉中醇溶蛋白含量較低,不能形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),且其淀粉顆粒較小,與蛋白質(zhì)結(jié)合緊密[23],糯米的引入會(huì)對小麥面團(tuán)結(jié)構(gòu)造成不良影響,但通過添加適當(dāng)發(fā)酵時(shí)間的酒釀,面團(tuán)品質(zhì)得以改善。

2.3 不同發(fā)酵時(shí)間甜酒釀面包的風(fēng)味與比容

2.3.1 不同發(fā)酵時(shí)間甜酒釀對面包風(fēng)味特性的影響 在面包的制作中,影響面包風(fēng)味的因素主要有:原料、發(fā)酵過程、降解作用和熱反應(yīng),這四種因素影響面包風(fēng)味化合物的成分及含量[24-25]。本研究通過GC-MS方法測定了小麥面包和不同發(fā)酵時(shí)間甜酒釀面包的揮發(fā)性風(fēng)味化合物,其種類、保留時(shí)間和相對含量如表1所示,分類統(tǒng)計(jì)如圖4所示。不同發(fā)酵時(shí)間的甜酒釀對面包的風(fēng)味物質(zhì)的種類和相對含量的影響不同。從表1中可以看出,添加發(fā)酵48 h的酒釀所制備的面包的總峰面積最大,且其中具有強(qiáng)烈葡萄玫瑰香氣的壬酸乙酯、具有清甜玫瑰樣花香的苯乙醇以及具有特殊杏仁香氣的苯甲醛均是在發(fā)酵48 h酒釀面包中相對含量最大。其中除了添加0 h發(fā)酵酒釀的面包外,異戊醇在所有風(fēng)味物質(zhì)中所占的相對含量最高,分別為32.68%、30.77%和29.30%。異戊醇具有蘋果白蘭地香氣[26]，閾值較低,僅為250 μg/kg,故其對面包風(fēng)味的影響很大[27]。從表1中可以明顯看出,在添加有酒釀的面包中,苯乙醇相對含量較高,分別為8.86%、12.66%、18.18%和12.01%,雖然其含量不如異戊醇,但其閾值非常低,僅為80 μg/kg[28],故其極易被人類嗅知。

表1 小麥面包和不同發(fā)酵時(shí)間酒釀面包中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成及相對含量Table 1 Composition and relative content of volatile flavor compounds of wheat bread and breadwith fermented glutinous rice with different fermentation time

續(xù)表

根據(jù)酯類、醇類、酮類、酸類、烴類、醛類以及雜環(huán)芳類,將所有的風(fēng)味化合物進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)。酯類物質(zhì)一般具有奶油香、花香和果香等令人愉快的味道[6]。但是在0 h的酒釀面包中,乳酸乙酯占酯類相對含量的65.98%,前人的研究中可以發(fā)現(xiàn),乳酸乙酯的嗅覺閾值為128.08 μg/mL,所以較難被人類嗅知[27]。在添加發(fā)酵48 h酒釀的面包中,辛酸乙酯是酯類中相對含量最高的,占酯類相對含量的35.53%,且其嗅覺閾值只有0.01287 μg/mL[28],所以添加48 h酒釀的面包其風(fēng)味更為宜人。

通過圖4可以更直觀地看出各風(fēng)味物質(zhì)在各大類之間的差別。面包中的酵母和甜酒釀中帶入的酵母會(huì)利用可發(fā)酵的糖作為碳源進(jìn)行發(fā)酵,產(chǎn)生大量醇類物質(zhì)[29]。醇類物質(zhì)同樣會(huì)給面包帶來宜人的風(fēng)味,并且大量存在于面包中,各組面包中醇類物質(zhì)的相對含量分別為20.85%、62.92%、63.41%和60.06%,這是由于酒曲中的釀酒酵母利用糯米發(fā)酵,產(chǎn)生大量的醇類物質(zhì),同時(shí),酒釀發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生還原糖,有利于面包酵母的生長,這也解釋了在添加0 h酒釀的面包中醇類物質(zhì)含量不如其他發(fā)酵組的面包。結(jié)合表1和圖4的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),添加48 h酒釀的面包的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量相對較高,風(fēng)味也明顯優(yōu)于其他各組。

圖4 小麥面包以及不同發(fā)酵時(shí)間的酒釀面包中揮發(fā)性化合物統(tǒng)計(jì)Fig.4 Statistics of volatile flavor compounds in wheat bread and breads with fermented glutinous rice with different fermentation time注:不同字母代表同種物質(zhì)在不同發(fā)酵時(shí)間相對含量差異顯著性(p<0.05)。

2.3.2 不同發(fā)酵時(shí)間甜酒釀對面包比容的影響 在面包配方中添加不同發(fā)酵時(shí)間的酒釀制備面包,測定所制得面包的比容,如圖5。由圖5可知,除添加72 h發(fā)酵酒釀組比容較小以外,其他幾組面包的比容均沒有顯著差異(p>0.05)。這說明在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的少量蛋白酶對糯米的淀粉蛋白網(wǎng)絡(luò)具有有利的影響,持氣能力增強(qiáng),甜酒釀發(fā)酵過程中霉菌水解淀粉產(chǎn)生的還原糖有利于酵母菌的生長,在面包醒發(fā)過程中產(chǎn)生更多的氣體。但是當(dāng)添加的甜酒釀發(fā)酵時(shí)間達(dá)到72 h,面包的比容大幅度下降,說明過量的蛋白酶將小麥蛋白水解,使得面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到破壞,比容大幅度減小。綜合而言,添加發(fā)酵48 h的酒釀的面包,效果最佳。

圖5 含不同發(fā)酵時(shí)間甜酒釀面包比容Fig.5 Specific volume of bread with fermented glutinous rice of different fermentation time

2.3.3 不同發(fā)酵時(shí)間甜酒釀對面包感官評(píng)分的影響 采用九分嗜好法對添加不同發(fā)酵時(shí)間的甜酒釀的面包進(jìn)行感官鑒評(píng),如圖6所示。從圖6中可以看出,添加24、48 h甜酒釀的面包的外觀得分相對較高。在色澤方面,添加48、72 h的甜酒釀的面包得分一樣高,這可能是由于甜酒釀發(fā)酵時(shí)間增加,積累的還原糖的含量不斷增多,加劇了烘焙過程中的美拉德反應(yīng),使得面包呈金黃色,更為誘人,所以更受歡迎。在風(fēng)味得分中,同樣是添加48 h和72 h的甜酒釀的面包得分較高,隨著酒釀發(fā)酵時(shí)間的延長,得分越高,當(dāng)發(fā)酵至48 h時(shí),感官評(píng)分達(dá)到最大,這表明隨著時(shí)間的增加,風(fēng)味物質(zhì)不斷積累,越來越受到人們的喜愛?？傮w而言,添加48 h發(fā)酵酒釀的面包的質(zhì)量最好,這也與整體可接受度的分?jǐn)?shù)結(jié)果一致。因此,48 h為甜酒釀的最佳發(fā)酵時(shí)間。

圖6 小麥面包及含不同發(fā)酵時(shí)間甜酒釀面包感官分析Fig.6 Sensory evaluation of bread with fermented glutinous rice of different fermentation time

3 結(jié)論

本文研究了不同發(fā)酵時(shí)間的甜酒釀對面團(tuán)特性及面包烘焙特性的影響。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加,甜酒釀的pH迅速下降,至18 h左右趨于穩(wěn)定,發(fā)酵48 h后,甜酒釀的TTA基本趨于穩(wěn)定。從酒釀面團(tuán)的超微結(jié)構(gòu)中可以發(fā)現(xiàn),添加發(fā)酵48 h的面團(tuán)的面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較好,少量的蛋白酶有利于減弱無麩質(zhì)糯米對面團(tuán)面筋的弱化作用。發(fā)酵酒釀的加入使得面包的風(fēng)味明顯提升,尤其是添加發(fā)酵48 h酒釀的面包,醇類和酯類物質(zhì)的含量明顯增加,醇類物質(zhì)相對含量高達(dá)63.41%,酯類物質(zhì)相對含量為8.82%,尤其是辛酸乙酯、壬酸乙酯以及異戊醇,賦予面包更濃郁的花香和果香。除含有72 h酒釀外的面包,比容沒有顯著性(p>0.05)差異。在感官鑒評(píng)中,含48 h酒釀的面包獲得最高的分?jǐn)?shù),成為最受歡迎的面包。本研究為甜酒釀面包的生產(chǎn)提供一定理論依據(jù)。