劉曉飛,張 宇,王 薇,關(guān)樺楠,張 娜,馬永強(qiáng),*,盧淑雯

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150076;2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后科研工作站,黑龍江哈爾濱 150086)

糙米是稻谷脫去外保護(hù)皮層稻殼后的穎果,發(fā)芽糙米是糙米經(jīng)過(guò)適宜的水分、溫度等外界條件發(fā)芽所得[1]。發(fā)芽糙米主要由幼芽和帶皮層的胚乳兩個(gè)部分構(gòu)成[2]。發(fā)芽糙米不僅有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,在不同的方面也有著各種功效[3-4]。發(fā)芽糙米與糙米相比,不但感官性能和風(fēng)味得以改善,而且在保留了豐富的維生素、礦物質(zhì)、膳食纖維營(yíng)養(yǎng)成分的同時(shí),更是產(chǎn)生了多種具有促進(jìn)人體健康和防治疾病的成分,如γ-氨基丁酸、六磷酸肌醇等[5],營(yíng)養(yǎng)價(jià)值大大提高[6]。發(fā)芽糙米中有更多的人體所需營(yíng)養(yǎng)成分和生理活性成分種類(lèi),具有明顯的生理活性優(yōu)勢(shì)[7],因此需要更深入研究。

但是,目前對(duì)發(fā)芽糙米的研究主要集中在發(fā)芽的工藝研究、發(fā)芽糙米中淀粉的改性以及發(fā)芽糙米為原料的各種食品制作上,對(duì)發(fā)芽糙米中γ-氨基丁酸、膳食纖維、γ-谷維素等相關(guān)的研究比較多,而對(duì)其中多糖類(lèi)物質(zhì)研究較少[8-9]。多糖的純化過(guò)程及方法與多糖的活性具有很密切的相關(guān)性,從植物中提取的粗多糖一般都含有非多糖雜質(zhì)[10]。因此需要對(duì)提取的粗多糖進(jìn)行除雜,對(duì)不同的除雜方法進(jìn)行篩選,篩選的原則是不僅要去除雜質(zhì)的效果好,更為重要的是避免除雜方法對(duì)多糖結(jié)構(gòu)和生物活性造成破壞,因此對(duì)提取出的粗多糖初步純化脫色和脫蛋白質(zhì)方法上的篩選是多糖純化的重要步驟。雖然有關(guān)植物粗多糖的純化分離的研究有很多,但還沒(méi)有針對(duì)于發(fā)芽糙米粗多糖的高效的純化和分離方法。

汪艷群等[11]發(fā)現(xiàn)酶與三氯乙酸-正丁醇結(jié)合法比傳統(tǒng)單一的脫蛋白方法去除蛋白的效果更好。歐文等[12]發(fā)現(xiàn)Sevag法對(duì)薺菜粗多糖中的蛋白去除效果更好。從植物中提取出的粗多糖中經(jīng)常含有一些色素,色素的存在會(huì)影響多糖的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的分析鑒定[13-14]。實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常用活性炭、硅藻土、大孔吸附樹(shù)脂等吸附法進(jìn)行脫色[15-16]。付學(xué)鵬等[17]比較了活性炭、過(guò)氧化氫等幾種脫色方法對(duì)植物粗多糖脫色的原理以及優(yōu)缺點(diǎn)。因?yàn)榛钚蕴康任絼┦杷啥嗫椎慕Y(jié)構(gòu)且無(wú)選擇性,采用吸附劑吸附脫色會(huì)使較多的多糖損失[18]。樹(shù)脂吸附是更高效的脫色方法,夏瑋等[19]采用了五種不同型號(hào)的大孔樹(shù)脂對(duì)桑葉粗多糖溶液進(jìn)行脫色處理,以脫色率和多糖損失率為測(cè)量指標(biāo),分析出AB-8型號(hào)大孔吸附樹(shù)脂對(duì)桑葉粗多糖的脫色效果最好。

本實(shí)驗(yàn)以脫蛋白率、脫色率和粗多糖損失率為評(píng)價(jià)指標(biāo),選出發(fā)芽糙米粗多糖脫色和脫蛋白的最佳方法,然后對(duì)經(jīng)脫色脫蛋白后的發(fā)芽糙米粗多糖進(jìn)行柱層析,比較三種柱層析填料對(duì)發(fā)芽糙米粗多糖的層析效果,篩選出最優(yōu)柱層析填料,對(duì)柱層析后的發(fā)芽糙米多糖各組分進(jìn)行分子量的測(cè)定，以期為發(fā)芽糙米粗多糖的提取、純化及分離提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粳稻為“龍粳” 產(chǎn)地:黑龍江,黑審稻2011004;纖維素酶(4萬(wàn)U/g)、木瓜蛋白酶(4萬(wàn)U/g)、果膠酶(4萬(wàn)U/g) 上海生化試劑廠;檸檬酸、磷酸氫二鈉、3,5-二硝基水楊酸、苯酚、濃硫酸 均為分析純,北京博奧拓達(dá)科技有限公司;DEAE Sepharose CL-6B、DEAE Fast Flow、DEAE Cellulose 52、Sepharose CL-6B、Sephadex G50 Pharmacia公司。

JY92-9C型微波儀 寧波新知生物科技股份有限公司;HHS-12型電熱恒溫水浴鍋 上海東星建材實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;721E型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;BS224S型電子分析天平 塞多利斯科學(xué)儀器有限公司;M288479型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 北京東方德教育科技有限公司;TGL-16G-B型臺(tái)式高速離心機(jī) 閩南星科科學(xué)儀器有限公司；SHZ-C水浴振蕩箱 上海昨非實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)芽糙米粗多糖的制備 用龔谷機(jī)去除稻子外殼得到糙米,在4 ℃避光條件下儲(chǔ)藏。用滅菌水浸泡糙米12 h,平鋪于托盤(pán)中,置于20 ℃的培養(yǎng)箱發(fā)芽24 h,將發(fā)芽糙米放于85 ℃恒溫干燥箱中滅酶處理40 min,然后55 ℃干燥24 h,粉碎過(guò)篩(80目)備用。按料液體積比1∶30加入蒸餾水,100 W超聲60 min,再放入80 ℃水浴振蕩箱中震蕩4 h,在20 ℃條件下4000 r/min、離心10 min后過(guò)濾收集上清液,按1∶3加入80%～85%的乙醇,放置24 h,在20 ℃條件下8000 r/min離心15 min,收集沉淀,冷凍干燥(-25 ℃,8 h)得發(fā)芽糙米粗多糖[20]。

1.2.2 發(fā)芽糙米多糖及蛋白質(zhì)的測(cè)定 采用苯酚-硫酸法[21]測(cè)定發(fā)芽糙米多糖的含量,制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品準(zhǔn)確稀釋合適的倍數(shù),吸取2 mL樣品溶液,分別加入1 mL的6%苯酚、5 mL濃硫酸,490 nm下測(cè)量其吸光度值,代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,計(jì)算糖含量。

采用考馬斯亮藍(lán)法[22]測(cè)定發(fā)芽糙米多糖蛋白質(zhì)的含量,制作牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取1 mL樣品溶液,精密吸取考馬斯亮藍(lán)溶液5 mL,振蕩均勻,靜置2 min后于595 nm處測(cè)定吸光度值,代入牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

1.2.3 發(fā)芽糙米粗多糖脫蛋白方法的篩選 采用三種脫蛋白的方法對(duì)發(fā)芽糙米粗多糖進(jìn)行脫蛋白,分別多次實(shí)驗(yàn),比較脫蛋白效果,得到脫蛋白三種方法最為穩(wěn)定的次數(shù)。

1.2.3.1 Sevage法脫蛋白 精確配制10 mg·mL-1的粗多糖溶液,加入其體積比1∶5的三氯甲烷-正丁醇(4∶1,v/v)溶液,振搖30 min,在20 ℃條件下8000 r/min離心10 min,上清液再加入粗多糖溶液1/5體積的三氯甲院-正丁醇(4∶1,v/v)溶液,多次重復(fù)相同脫蛋白實(shí)驗(yàn)步驟,直到無(wú)沉淀產(chǎn)生[23]。根據(jù)1.2.5計(jì)算公式計(jì)算Sevage法的粗多糖脫蛋白率、粗多糖損失率。

1.2.3.2 三氯乙酸法脫蛋白 精確配制10 mg·mL-1的粗多糖溶液,將20%的三氯乙酸和粗多糖溶液1∶1混合,振搖30 min后,冰箱放置過(guò)夜,在20 ℃條件下8000 r/min離心10 min離心,取上清液,用1 mg·mL-1氫氧化鈉溶液調(diào)至中性[24],根據(jù)1.2.5計(jì)算公式計(jì)算三氯乙酸法的多糖脫蛋白率、粗多糖損失率。

1.2.3.3 酶-Sevage法脫蛋白 精確配制10 mg·mL-1的粗多糖溶液,調(diào)pH為6,加入粗多糖溶液體積2%的木瓜蛋白酶,在水浴溫度37 ℃酶解24 h,反應(yīng)完全后從37 ℃ 3 min加熱升溫至80 ℃使酶失活,在20 ℃條件下8000 r/min離心10 min離心,上清液經(jīng)Sevage法脫蛋白,反復(fù)多次,直到無(wú)明顯的蛋白產(chǎn)生為止[25],根據(jù)1.2.5計(jì)算公式計(jì)算酶-Sevage法的多糖脫蛋白率、粗多糖損失率。

1.2.4 發(fā)芽糙米粗多糖脫色方法的篩選

1.2.4.1 活性炭吸附法脫色 活性炭經(jīng)重蒸水清洗過(guò)濾,干燥(120 ℃,8 h)冷卻備用。取粗多糖配制成2 mg·mL-1的粗多糖溶液30 mL,加入1.5%的活性炭,置于恒溫45 ℃下脫色2 h,脫色可反復(fù)進(jìn)行,直至顏色澄清透明或吸光值不再變化,檢測(cè)其粗多糖含量[26],根據(jù)1.2.5計(jì)算公式計(jì)算活性炭法粗多糖的脫色率、粗多糖損失率。

1.2.4.2 過(guò)氧化氫氧化法脫色 取粗多糖配制成2 mg·mL-1的粗多糖溶液30 mL,用氨水調(diào)節(jié)pH至9,加入l mL、30%的H2O2,恒溫45 ℃下脫色6 h,脫色可反復(fù)進(jìn)行,直至顏色澄清透明或吸光值不再變化[27],根據(jù)1.2.5計(jì)算公式計(jì)算過(guò)氧化氫氧化法粗多糖的脫色率、粗多糖損失率。

1.2.4.3 大孔樹(shù)脂吸附法脫色 由于發(fā)芽糙米粗多糖為弱極性,所以本研究選用AB-8大孔樹(shù)脂。精密稱取經(jīng)預(yù)處理的優(yōu)選樹(shù)脂20 mL,濕法裝柱,柱下端塞入脫脂棉并壓平,待柱內(nèi)樹(shù)脂穩(wěn)定后,將4 BV的2 mg·mL-1的粗多糖溶液以2 BV的速度進(jìn)行脫色,待樣品液完全進(jìn)入柱內(nèi)后,用2倍上樣體積的蒸餾水進(jìn)行沖洗,收集脫色后液濃縮至上樣體積[28],測(cè)定并根據(jù)1.2.5計(jì)算公式計(jì)算大孔樹(shù)脂吸附法粗多糖的脫色率、粗多糖損失率。

1.2.5 發(fā)芽糙米粗多糖提取率、脫色率、脫蛋白率和損失率的計(jì)算

粗多糖提取率(%)=(粗提液中總糖含量(mg/mL)×粗提液總體積(mL))/發(fā)芽糙米粉末質(zhì)量(mg)×100

粗多糖脫色率(%)=(脫色前A400-脫色后A400)/脫色前A400×100

粗多糖脫蛋白率(%)=(脫蛋白前A595-脫蛋白后A595)/脫蛋白前A595×100

粗多糖損失率(%)=(脫蛋白(脫色)前多糖A490-脫蛋白(脫色)后A490)/脫蛋白(脫色)前A490

1.2.6 發(fā)芽糙米粗多糖層析純化三種填料的篩選 將溶脹好的凝膠DEAE-Sepharose 52取出后,加水與凝膠體積比例為1∶3,攪拌混勻凝膠后,35 ℃,30 kHz超聲10 min去除氣泡,濕法裝柱(Φ26 mm×300 mm),用水洗脫過(guò)夜[29]。將粗多糖樣品溶解在蒸餾水中,將其配為濃度為20 mg/mL多糖溶液,在20 ℃條件下用離心機(jī)8000 r/min離心10 min,取4 mL上清液上樣,流速換成5 mL/min,每管收集5 mL,用蒸餾水洗脫收集30管后,再用0.1、0.2、0.3 mol/L的NaCl分別進(jìn)行梯度洗脫,每個(gè)梯度依次接收30管,用苯酚-硫酸跟蹤檢測(cè)含糖管A490,做出梯度洗脫曲線,對(duì)發(fā)芽糙米進(jìn)行層析純化[30]。按照洗脫曲線收集各個(gè)主峰,Sephadax G50脫鹽柱進(jìn)行脫鹽,采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,80 ℃,50 r/min,濃縮至1/3體積后真空冷凍、-60 ℃,12 h干燥備用。

相同實(shí)驗(yàn)步驟操作DEAE-Sepharose Cl-6B、DEAE Fast Flow這兩種填料,通過(guò)洗脫曲線比較哪種填料的層析效果好。選擇實(shí)驗(yàn)效果好的填料作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)柱層析的填料對(duì)發(fā)芽糙米進(jìn)行層析純化。按照洗脫曲線收集各個(gè)主峰,Sephadax G50脫鹽柱進(jìn)行脫鹽,濃縮后真空冷凍干燥(-60 ℃,12 h)備用。

1.2.7 發(fā)芽糙米多糖純度鑒定及其分子量的測(cè)定

1.2.7.1 紫外光譜分析 稱取適量經(jīng)純化的各個(gè)組分多糖樣品,配制成濃度為1 mg/mL的溶液,把去離子水作為對(duì)比,在600～150 nm處做全波長(zhǎng)掃描檢測(cè)[31]。

1.2.7.2 高效凝膠過(guò)濾色譜(HPGPC)測(cè)定分子量 準(zhǔn)確稱量經(jīng)柱層析分離純化后的發(fā)芽糙米水洗多糖和鹽洗多糖各 1 mg,溶于1 mL去離子水里,采用高效凝膠滲透色譜進(jìn)行純度鑒定和分子量測(cè)定[32]。檢測(cè)條件[33]:GPC 色譜儀型號(hào):LC-10A 型HPLC;檢測(cè)器:示差檢測(cè)器RID-10A;進(jìn)樣器:自動(dòng)進(jìn)樣器 SIL-10AD;系統(tǒng)軟件:SHIMADZU CLASS-VP;色譜柱:UltrahydrogelTMLinear 7.8 mm×300 mm實(shí)驗(yàn)條件:流動(dòng)相:超純水;流速:0.5 mL/min;柱溫:40 ℃;柱操作壓力:1.6 MPa;樣品濃度:1 mg/mL;進(jìn)樣量:20 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:采用硫酸-苯酚法測(cè)定葡萄糖在波長(zhǎng)490 nm處的吸光度值,縱坐標(biāo)為吸光度值(y),葡萄糖濃度值(x)為橫坐標(biāo),得出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果如圖1所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=0.129x-0.124,擬合系數(shù)R2=0.998,表明葡萄糖含量與吸光度值呈良好的線性關(guān)系(葡萄糖濃度0～0.05 mg/mL)。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Glucose standard curve

牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定葡萄糖在波長(zhǎng)595 nm處的吸光度值,縱坐標(biāo)為吸光度值(y),牛血清蛋白濃度值(x)為橫坐標(biāo),得出牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果如圖2所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=0.122x-0.117,擬合系數(shù)R2=0.998,表明牛血清蛋白含量與吸光度值呈良好的線性關(guān)系(牛血清蛋白濃度0～100 mg/mL)。

圖2 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of bovine serum albumin

2.2 發(fā)芽糙米粗多糖脫蛋白工藝的研究

Sevage法和酶-Sevage法去除蛋白質(zhì)的原理都是利用有機(jī)溶劑,使流離的蛋白變性成為不溶物,但粗多糖中含有糖蛋白,需要有機(jī)溶劑多次處理才能達(dá)到較好地去除蛋白的效果。由圖3、圖4可知,對(duì)發(fā)芽糙米粗多糖的脫蛋白處理次數(shù)越多,粗多糖的損失率越大,Sevage法經(jīng)過(guò)4次處理后,盡管脫蛋白率已達(dá)到82.6%,但此時(shí)粗多糖已經(jīng)損失過(guò)半,粗多糖得率較低,Sevage法反復(fù)處理次數(shù)較少時(shí),脫蛋白效果不明顯,因此本試驗(yàn)確定Seavge法對(duì)發(fā)芽糙米粗多糖溶液反復(fù)處理4次,此時(shí)粗多糖損失率為52%。酶-Sevage法經(jīng)過(guò)2次處理后,蛋白脫除效果比較好,粗多糖損失也較少,采用此方法去除蛋白明顯,因此本試驗(yàn)確定酶-Seavge法對(duì)發(fā)芽糙米粗多糖溶液處理2次。通過(guò)比較Seavge法(4次)、三氯乙酸法、酶-Sevage法(2次)三種脫蛋白方法,結(jié)果如圖5所示,三種方法去除蛋白效果明顯,粗多糖損失也明顯。三氯乙酸法與Sevage法蛋白脫除率分別為84.17%和81.28%,盡管兩種方法脫蛋白效率較好但粗多糖損失也較多,且Sevage法反復(fù)多次,操作麻煩且耗時(shí),并耗費(fèi)大量的有機(jī)試劑,不僅污染環(huán)境其成本也大。三氯乙酸法在酸性條件下與蛋白質(zhì)作用同時(shí),一定程度上通過(guò)酸水解作用也破壞了多糖的結(jié)構(gòu),不利于后續(xù)多糖結(jié)構(gòu)分析和活性測(cè)定。酶Sevage法相對(duì)以上兩種脫蛋白方法，在保證脫蛋白率較高的情況下，粗多糖損失率較少。綜合評(píng)價(jià)脫蛋白效果與粗多糖損失,確定酶-Sevage法作為發(fā)芽糙米粗多糖的初步純化方法。

圖3 Sevage法脫蛋白Fig.3 Deproteinization with the Sevage method

圖4 酶-Sevage法脫蛋白Fig.4 Deproteinization with the enzyme-Sevage method

圖5 不同脫蛋白方法結(jié)果Fig.5 Results of different deproteining methods

2.3 發(fā)芽糙米多糖脫色工藝的研究

由圖6可知,活性炭吸附脫色法的脫色率為88.44%,但會(huì)造成很多的粗多糖損失,這是因?yàn)榛钚蕴吭诿撋耐瑫r(shí)也會(huì)吸附大量的粗多糖,且存在脫色后溶液中的炭殘?jiān)y以完全去除的缺點(diǎn)。過(guò)氧化氫法脫色率較高,但由于過(guò)氧化氫是氧化性較強(qiáng)的氧化劑,過(guò)氧化氫氧化作用很有可能改變多糖的鏈狀結(jié)構(gòu),從而影響粗多糖的活性。AB-8大孔樹(shù)脂是弱極性樹(shù)脂,對(duì)弱極性的有機(jī)化合物具有較強(qiáng)的吸附能力,對(duì)極性大的多糖類(lèi)物質(zhì)吸附力弱。發(fā)芽糙米粗多糖溶液經(jīng)AB-8大孔樹(shù)脂吸附色素后,脫色率為86.57%,粗多糖損失率為28.96%。三種脫色方法對(duì)粗多糖的脫色效果明顯,粗多糖損失也明顯。雖然脫色率比活性炭吸附法脫色率稍低,但粗多糖損失率相比大幅度降低,綜合比較大孔樹(shù)脂脫色效果較好。說(shuō)明發(fā)芽糙米粗多糖中所含的色素物質(zhì)極性與AB-8樹(shù)脂的極性相近,故脫色效果較佳。

圖6 不同脫色方法結(jié)果Fig.6 Results of different decoloring methods

由于大孔吸附樹(shù)脂法脫色具有操作簡(jiǎn)便、條件溫和、脫色效果佳、色素可回收等優(yōu)點(diǎn),綜合考慮脫色效果與粗多糖損失兩者的效應(yīng),AB-8大孔樹(shù)脂吸附法是發(fā)芽糙米粗多糖最佳脫色方法。

2.4 柱層析填料的篩選

三種柱層析填料對(duì)發(fā)芽糙米粗多糖層析純化過(guò)柱洗脫曲線如圖7所示。

圖7 (A)DEAE-Cellulose 52,(B)DEAE Fast Flow,(C)DEAE Cl-6B洗脫曲線Fig.7 Stepwise elution curve of crude Polysaccharides on(A) DEAE-Cellulose 52,(B)DEAE Fast Flow,(C)DEAE Cl-6B chromatography column

由DEAE-Cellulose 52洗脫曲線可知,洗脫出三種多糖組分,第一個(gè)峰由蒸餾水洗脫得到,其含量為8.38%,經(jīng)不同濃度的NaCl梯度洗脫,得到兩個(gè)峰,含量分別14.11%和4.25%,洗脫后的多糖組分和含量都相對(duì)較少,峰2無(wú)明顯的出峰時(shí)間間隔。且各個(gè)洗脫峰沒(méi)很好的分離開(kāi)來(lái)，所以DEAE-Cellulose 52凝膠柱對(duì)糙米粗多糖的分離效果不好。因此不能選用此填料對(duì)糙米粗多糖進(jìn)行分離純化。

由DEAE Fast Flow洗脫曲線可知,第一個(gè)峰型對(duì)稱并且很明顯,但其他的洗脫峰錯(cuò)綜復(fù)雜,峰型不對(duì)稱,并且峰與峰之間無(wú)明顯的間隔,無(wú)法判斷洗脫下來(lái)幾種多糖組分,所以DEAE Fast Flow凝膠柱對(duì)發(fā)芽糙米粗多糖的分離效果不好。因此不能選用此填料對(duì)糙米粗多糖進(jìn)行分離純化。

通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)DEAE-Sepharose CL-6B層析柱對(duì)發(fā)芽糙米粗多糖的分離純化效果最好,多糖通過(guò)陰離子交換柱后因多糖所帶電荷性質(zhì)不同,分離得到五個(gè)洗脫峰,峰型狹窄對(duì)稱,證明DEAE Sepharose CL-6B凝膠柱對(duì)發(fā)芽糙米粗多糖具有較好的分離效果。第一個(gè)峰由蒸餾水洗脫得到,其含量為32.82%,經(jīng)不同濃度的NaCl梯度洗脫,得到四個(gè)峰,含量分別9.91%、8.15%、7.42%和1.92%,由于0.4 mol/L的NaCl洗脫下來(lái)的多糖含量較少,因此只收集含前三個(gè)主峰的試管中的洗脫液,對(duì)收集后的洗脫液減壓濃縮后,上Sephadex G50層析柱進(jìn)行脫鹽,收集脫鹽后的各組分多糖真空冷凍干燥。

2.5 發(fā)芽糙米多糖純度鑒定及其分子量的測(cè)定

如圖8所示,根據(jù)紫外光分析可知,在吸光度在220、260和280 nm處都沒(méi)有明顯的峰值,說(shuō)明不含有蛋白和核酸這兩種物質(zhì)[19]。再采用高效凝膠滲透色譜檢測(cè)其相對(duì)分子量,線性回歸方程為:lg Mw=-0.1421tR+13.2451,式中:Mw為平均分子質(zhì)量(kD);tR為保留時(shí)間(min);決定系數(shù)R2為0.9981。根據(jù)線性回歸方程計(jì)算結(jié)果如下:水洗多糖組分的平均分子量為1.47×105g/mol,鹽洗多糖組分的平均分子量為9.62×105、5.59×106和3.15×105Da。

圖8 水洗多糖組分紫外光譜Fig.8 The UV spectra of fraction from Polysaccharides in distilled water

3 結(jié)論

經(jīng)2次酶-Sevage法脫蛋白效果較好且粗多糖損失率低,脫蛋白率為74.36%,粗多糖損失率為14.09%。大孔樹(shù)脂AB-8對(duì)發(fā)芽糙米粗多糖脫色效果最佳,脫色率為86.57%,粗多糖損失率為28.96%。對(duì)發(fā)芽糙米粗多糖進(jìn)行柱層析的最佳填料為DEAE-Sepharose CL-6B。水洗多糖組分的平均分子量為1.47×105Da,鹽洗多糖組分的平均分子量分別為9.62×105、5.59×106、3.15×105Da。