婁春波 杜沛 孟凡康 季翔宇 張益豪

合成生物學(xué)是一門利用工程學(xué)原理改造和創(chuàng)造生命的學(xué)科，目前已經(jīng)在生物能源、新材料、環(huán)境污染治理、腫瘤治療等方面展現(xiàn)出了巨大的潛力，能夠在國家科技發(fā)展、產(chǎn)業(yè)升級過程中發(fā)揮重大作用，助力“中國制造 2025”。與傳統(tǒng)生物工程相比，合成生物學(xué)最大的進步在于對工程設(shè)計原理的系統(tǒng)性應(yīng)用：依據(jù)工程設(shè)計原理對天然存在的各種酶、調(diào)控分子等進行簡單化、模塊化處理，設(shè)計出具有各種基本功能的元件。人工基因線路是利用此類元件，根據(jù)類似于電子工程電路編程的思想設(shè)計的，對生命的運行過程進行的重新編程。這種對生命的重編程能夠針對多樣的需求對天然的各種功能進行優(yōu)化，甚至引入自然界中不存在的人造法則，實現(xiàn)豐富的、可設(shè)計的生物學(xué)功能，為人類健康和社會發(fā)展服務(wù)。

1 人工基因線路的起源和研究進展

自然界中存在大量的天然基因線路，是生命體用于收集和處理各種體內(nèi)生化信號和體外環(huán)境變化的動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)，其與物質(zhì)代謝、能量供給共同構(gòu)成了生命過程的3個基本要素。所有生物體均由物質(zhì)構(gòu)成，由能量驅(qū)動，并由基因線路控制物質(zhì)的代謝和能量的流動，以實現(xiàn)多樣的生理活動，如細胞分裂、個體形態(tài)發(fā)育等。同時，生物體對外界環(huán)境變化的適應(yīng)和抗逆反應(yīng)也依賴于基因線路。例如：人體細胞在血糖濃度升高時對胰島素的分泌；組織受損時啟動組織再生；大量失血時促進造血干細胞分化等。與天然基因線路不同，人工基因線路存在的目的是根據(jù)人工生命體的設(shè)計目標(biāo)，進行有針對性的控制，實現(xiàn)特定的控制邏輯，發(fā)揮類似于計算機控制芯片的功能。因此，人工基因線路是對生命進行可編程控制的具體體現(xiàn)，是合成生物學(xué)的標(biāo)志性技術(shù)。

對生命的編程如同電路編程一樣，需要使用大量工程化的元器件，如計數(shù)器、脈沖信號產(chǎn)生器、邏輯信號門、信號過濾器等，以實現(xiàn)從低級到高級，由簡單到復(fù)雜的控制。為了構(gòu)建出此類元器件，需要在傳統(tǒng)生物學(xué)多年來對生命調(diào)控法則的認識基礎(chǔ)上，按照工程化設(shè)計原理對生命系統(tǒng)進行簡單化處理，再進一步按照不同的方式進行組合而成。盡管人工基因線路與電子線路都是信號采集和處理的信息運算系統(tǒng)，兩者在很多方面又是截然不同的。基因線路的工作環(huán)境是動態(tài)生長的活體細胞，是大量各種分子的混合物，而電子線路的工作環(huán)境是固體金屬和半導(dǎo)體材料，各個元件之間很容易實現(xiàn)絕緣。這些差異決定了針對基因線路的設(shè)計與組裝必須要探索新途徑，而不是簡單地照搬照抄電子線路的成功方案。

在過去20年間，合成生物學(xué)領(lǐng)域出現(xiàn)了一批奠基性的工作，在人工基因線路設(shè)計、調(diào)控元件以及組裝方法等方面實現(xiàn)了“從0到1”的躍進。相應(yīng)地，人工基因線路也經(jīng)歷了從基本型到組合型的升級，已經(jīng)開始具備對高級的生命過程進行模擬和探索的能力。

1.1 基本型人工基因線路

基本型的人工基因線路是基于生物學(xué)對生命系統(tǒng)的認識，以電子工程的方式設(shè)計、模擬并構(gòu)建的基本生物控制器件，包括遺傳開關(guān)、生物振蕩器、計數(shù)器、脈沖信號產(chǎn)生器、邏輯信號門、信號過濾器等。2000年，波士頓大學(xué)的Collins課題組設(shè)計出了第一個合成生物學(xué)功能模塊——轉(zhuǎn)錄水平的雙穩(wěn)態(tài)開關(guān)。該模塊成功地在大腸桿菌中實現(xiàn)了數(shù)學(xué)模型預(yù)測的雙穩(wěn)態(tài)效應(yīng)，可以作為基本型的遺傳開關(guān)使用。同年，普林斯頓大學(xué)的Elowitz和Leibler實現(xiàn)了更為復(fù)雜的功能模塊——基因表達振蕩器。該器件利用 3個基因模塊彼此間的抑制和解抑制作用實現(xiàn)了輸出信號的規(guī)律振蕩。以上兩項工作在理論和實驗層面證明了理性設(shè)計生物元器件的可能性，對合成生物學(xué)發(fā)展有重大指導(dǎo)意義，因此被稱為“合成生物學(xué)的里程碑”。作為邏輯電路的基本元件，過去 20年間還出現(xiàn)了各種邏輯門，包括“與門”“非門”“或門”等。例如，一種“與門”利用帶有琥珀突變的T7噬菌體RNA聚合酶和能夠拯救琥珀突變的tRNA構(gòu)建的獨立輸入信號，可以整合處理環(huán)境中任意兩種信號輸入并相應(yīng)地給出下游輸出。類似的邏輯門、基因開關(guān)和振蕩器等基本型人工基因線路不僅可由原核生物中各種基礎(chǔ)調(diào)控元件拼裝，還能由更復(fù)雜的調(diào)控元件和信號傳導(dǎo)元件構(gòu)建而成，在真核生物乃至人體細胞中發(fā)揮功能。

1.2 組合型人工基因線路

利用基本型人工基因線路作為基礎(chǔ)器件，可以搭建出復(fù)雜的組合型人工基因線路，用于模擬高級的生命過程。2014年，北京大學(xué)歐陽頎課題組設(shè)計出了一種具有巴甫洛夫經(jīng)典條件反射行為的人工基因線路，在大腸桿菌中重現(xiàn)了高等生物的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的學(xué)習(xí)功能。該基因線路由2個邏輯“與門”、2個邏輯“或門”和 1個記憶模塊組成，能夠接收1個不引起輸出響應(yīng)的外界信號分子A和1個可引發(fā)輸出響應(yīng)的環(huán)境信號 B。此 2種信號組合的多次共刺激能使大腸桿菌的記憶狀態(tài)發(fā)生改變，最終使信號A能夠單獨引起輸出響應(yīng)。2012年，麻省理工學(xué)院的Voigt課題組把3個二進制邏輯“與門”組裝為1個巨大的四進制邏輯“與門”，實現(xiàn)了能夠同時感知 4種不同環(huán)境信號的人工基因網(wǎng)絡(luò)。以上兩項工作外，還由很多有用的組合型人工基因線路，如加法器、邊界識別器、多輸入的邏輯線路等。

為了實現(xiàn)更高級的控制功能，人工基因線路勢必變得越來越復(fù)雜，隨之而來的是設(shè)計難度的迅速提升。電子線路設(shè)計領(lǐng)域在20世紀(jì)遇到過類似的問題，其解決方法是基于計算機程序的自動化線路設(shè)計和模擬。因此，在 2016年，Voigt課題組開發(fā)出了一種能用于自動設(shè)計組合型復(fù)雜人工基因線路的計算機程序“Cello”（意為“cellular logic”），能根據(jù)用戶需求自動化地給出可執(zhí)行布爾邏輯運算的基因線路設(shè)計，實現(xiàn)類似于電子工程領(lǐng)域電路設(shè)計軟件的功能。該程序整合了大量轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的表征數(shù)據(jù)，生物元件組裝的經(jīng)驗，已知元件的生物學(xué)限制條件，以及邏輯線路的自動編譯工具等。用戶選擇輸入信號、輸出信號、宿主細胞等信息后，程序會從標(biāo)準(zhǔn)化生物元件的表征數(shù)據(jù)庫中挑選合適元件，從動力學(xué)區(qū)間、生物毒性等問題出發(fā)進行模擬和優(yōu)化，輸出線路的DNA序列和定量預(yù)測結(jié)果。最終，研究人員可以直接將DNA序列合成、裝載到宿主細胞中執(zhí)行功能。該程序能夠大幅提高對人工基因線路的設(shè)計效率。

2 人工基因線路的應(yīng)用

目前，人工基因線路已經(jīng)在基礎(chǔ)科研和實際應(yīng)用兩方面發(fā)揮了重要作用。在基礎(chǔ)科研領(lǐng)域，合成生物學(xué)對天然的生物系統(tǒng)進行干擾、重建乃至再創(chuàng)的能力已經(jīng)成為生物學(xué)家探索生命的強大工具，能夠用于研究復(fù)雜生物的運行規(guī)律。在實際應(yīng)用領(lǐng)域，人工基因線路也已經(jīng)在代謝工程、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、能源等領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力，極大推動了這些領(lǐng)域的發(fā)展。

2.1 “建物致知”――人工基因線路在基礎(chǔ)科研中的應(yīng)用

利用人工的基因線路元件，可以實現(xiàn)對天然的基因線路的重編程，構(gòu)建超越進化法則的人造生命過程，用于探索傳統(tǒng)生物學(xué)難以研究的一些基本科學(xué)問題。這種方法被稱為“建物致知”。目前，該方法已經(jīng)為生命起源、生物進化、生命網(wǎng)絡(luò)調(diào)控等方面的研究開啟了更加廣闊的空間。

例如，細胞在應(yīng)激調(diào)控中會專一性地利用某種特定的調(diào)控拓撲網(wǎng)絡(luò)。因此，可以通過替換拓撲網(wǎng)絡(luò)中某些特定的元件對該網(wǎng)絡(luò)進行重編程，從而深入了解天然基因線路的某些特性。2009年，美國加州理工大學(xué)Elowitz課題組在枯草芽孢桿菌中構(gòu)建了一個“先正后負”的人工負反饋基因線路，替換了天然的“先負后正”的負反饋網(wǎng)絡(luò)。他們發(fā)現(xiàn)，這種人工負反饋網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生的感受態(tài)響應(yīng)持續(xù)時間短、噪聲小，而天然負反饋網(wǎng)絡(luò)的感受態(tài)持續(xù)時間長短不一，分布特別寬。這一發(fā)現(xiàn)揭示了一種生命體在適應(yīng)環(huán)境方面的生存策略，即利用放大基因表達噪聲來適應(yīng)環(huán)境的多變和不確定性。

相比于細菌，高等生物的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)更加復(fù)雜，也存在更多的未知領(lǐng)域，能夠賦予“建物致知”研究方法更大的發(fā)揮空間。早在2003年，美國加州大學(xué)舊金山分校的 Lim課題組在研究酵母細胞對環(huán)境信號的響應(yīng)策略時，通過對兩種完全不同的信號通路——有性生殖響應(yīng)和高滲透壓響應(yīng)的重編程，成功實現(xiàn)了對兩種輸入信號和輸出信號的嫁接，以此證明了MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的支架蛋白是空間上區(qū)域化的信號節(jié)點。同時，該工作還證明了只要將基于支架蛋白的層次性信號——蛋白磷酸化反應(yīng)整合在一起，就能獲得完全依賴于蛋白質(zhì)相互作用的、可重新編程配置的人工信號通路。類似的調(diào)控拓撲替換和信號通路嫁接工作還有很多，比如人工改變了調(diào)控順序的lambda噬菌體開關(guān)，被嫁接了輸入和輸出信號的雙組分調(diào)控系統(tǒng)等。這些研究不僅加深了人們對天然基因線路生理學(xué)功能的認識，而且為基因線路的從頭設(shè)計提供了高質(zhì)量的基本調(diào)控元件。

2.2 人工基因線路的實際應(yīng)用

計算機芯片是各種電器中不可缺少的核心設(shè)備，控制著電器的各種功能，同時帶來“智能化”的響應(yīng)。與之類似，人工基因線路作為各種合成生物學(xué)應(yīng)用的可編程控制組件，往往能夠?qū)崿F(xiàn)一些傳統(tǒng)技術(shù)難以實現(xiàn)的、“智能化”的控制方式。

在腫瘤治療領(lǐng)域，CAR-T技術(shù)已經(jīng)展現(xiàn)出了有目共睹的治療效果，但也在T細胞激活水平調(diào)節(jié)、靶向特異性、信號通路調(diào)控等方面存在提升的空間。針對這些問題，波士頓大學(xué)的 Wong課題組提出了一種新型的CAR-T設(shè)計方案——“SUPRA CAR”，被諸多科技媒體稱為新一代的CAR-T療法，引起了廣泛關(guān)注。SUPRA CAR方案通過將CAR-T固定式的細胞外scFV單鏈抗體與細胞內(nèi) CD3z信號結(jié)構(gòu)域拆分為由亮氨酸拉鏈（Leucine-Zipper）這種通用結(jié)構(gòu)連接的兩部分，分別實現(xiàn)了對兩部分的模塊化設(shè)計和可編程性，為人工基因線路設(shè)計創(chuàng)造了可能?；谠摲桨冈O(shè)計的人工基因線路能夠?qū)Χ喾N抗原信號產(chǎn)生邏輯響應(yīng)，并且調(diào)控不同免疫細胞類型的信號通路。通過合適的線路設(shè)計，還實現(xiàn)了調(diào)節(jié) T細胞激活反應(yīng)強度，以減輕治療的副作用。

此外，在代謝工程領(lǐng)域，人工基因線路也展現(xiàn)出了“智能化”控制的潛力，提供了更好的解決方案?；诩毦后w感應(yīng)功能設(shè)計的人工基因線路能夠根據(jù)細菌數(shù)量對目的基因表達進行動態(tài)調(diào)節(jié)，使對細菌生長有負面影響的基因在細菌達到一定數(shù)量之后再表達，規(guī)避了傳統(tǒng)發(fā)酵過程中微生物生長和發(fā)酵產(chǎn)物生產(chǎn)的矛盾，實現(xiàn)了對發(fā)酵過程“先生長，再生產(chǎn)”的動態(tài)調(diào)控，同時也避免了使用昂貴的誘導(dǎo)劑。

3 人工基因線路設(shè)計的挑戰(zhàn)

使用人工基因線路執(zhí)行控制功能時，需要將該線路裝載到不同的底盤生物中。不同領(lǐng)域的應(yīng)用對底盤生物需求的多樣性要求人工基因線路對底盤生物的適應(yīng)性。為了達到此目標(biāo)，需要對人工基因線路進行“模塊化”設(shè)計?！澳K化”是合成生物學(xué)元件的核心屬性之一，設(shè)計目標(biāo)是將生物系統(tǒng)拆解為功能上相互獨立的模塊，并保證模塊間的拼裝不會導(dǎo)致模塊功能的改變。模塊化設(shè)計能使構(gòu)建的生物系統(tǒng)像電子系統(tǒng)一樣進行規(guī)模擴展和尺度放大，因此合成生物學(xué)領(lǐng)域的大量工作都注重模塊化元件的開發(fā)。然而，事實遠比設(shè)想中復(fù)雜。基因回路并不能嚴(yán)格地和宿主細胞隔離，而是與細胞的生理狀態(tài)耦合形成一個整體，人工基因線路會對細胞生理產(chǎn)生一些不可預(yù)知的干涉性影響，而這些干涉性影響也使理論上“模塊化”的生物元件和基因線路失去了可預(yù)測性，不再“模塊化”。這就導(dǎo)致在一種生物中精細刻畫過的元件性質(zhì)并不能在另一種生物中直接成立，因為元件一旦脫離了刻畫時的細胞生理狀態(tài)，其行為就有可能偏離預(yù)期。如果不能克服這個問題，合成生物元件就不能像電子元件一樣使用簡單元件逐步搭建復(fù)雜線路，而是需要耗費大量時間和精力對單個底盤生物中的元件進行點對點的優(yōu)化。目前，人工基因線路的設(shè)計挑戰(zhàn)主要表現(xiàn)在兩個方面：① 人工基因元件過表達引發(fā)細胞生長壓力和細胞毒性；② 細胞體內(nèi)存在一些會影響人工基因線路功能的特殊生理機制。

3.1 人工基因線路過表達引發(fā)細胞生長壓力和細胞毒性

細胞利用有限的資源完成營養(yǎng)物質(zhì)攝取、能量代謝、DNA復(fù)制、細胞分裂等諸多生理過程。為了優(yōu)化自身的生長，細胞需要根據(jù)環(huán)境平衡分配這些資源。當(dāng)人工基因線路的加入打破了這種平衡，就可能引發(fā)細胞生長壓力（burden），影響細胞的正常生長。細胞的生長壓力主要表現(xiàn)在兩個方面，① 人工基因線路在蛋白表達過程中占用了底盤細胞的RNA聚合酶和核糖體，以及相關(guān)的輔酶、能量等資源。② 過量表達蛋白還可能引起細胞的應(yīng)激反應(yīng)，激活一些細胞應(yīng)激途徑如ppGpp等。除了生長壓力，人工基因線路還可能帶來細胞毒性（toxicity）。與生長壓力不同，細胞毒性產(chǎn)生的原因是人工基因線路調(diào)控過程中的脫靶效應(yīng)對底盤細胞的正常生理活動產(chǎn)生的干擾，而非由于對細胞內(nèi)基礎(chǔ)資源的占用。

當(dāng)?shù)妆P細胞因為生長壓力或細胞毒性而生長減緩時，會反過來對其內(nèi)部人工基因線路的可預(yù)測性和遺傳穩(wěn)定性產(chǎn)生負面影響。例如，基于 TetR家族阻遏蛋白設(shè)計的元件中，一些阻遏蛋白可能會與底盤細胞基因組上非特異靶位點的結(jié)合，從而影響底盤細胞的生長，同時也降低了這些元件的可預(yù)測性。此外，在細胞培養(yǎng)過程中，人工基因線路的序列可能產(chǎn)生各種隨機突變。通常這些突變帶來的影響非常小，但如果某種突變體為其所在的細胞帶來了生長優(yōu)勢，就會很快占據(jù)群落的主體，使人工基因線路在群體層次上失效。例如，一種基于群體感應(yīng)設(shè)計的、控制細胞群體大小的元件在傳代培養(yǎng)3～6 d后，就由于逃脫調(diào)控的突變體發(fā)生大量增殖而失效。

許多已經(jīng)廣泛使用的優(yōu)質(zhì)元件也因為自身的細胞毒性限制了其發(fā)揮和推廣。例如，CRISPRi-dCas9（CRISPR interference-dCas9）調(diào)控系統(tǒng)被認為是優(yōu)秀的可編程的調(diào)控元件，目前已被廣泛用于基因線路的構(gòu)建。然而，隨著dCas9表達量升高，細胞生長會出現(xiàn)明顯的遲滯。一些研究者認為該毒性來源于CRISPR的脫靶效應(yīng)。因而在 CRISPRi-dCas9的實際使用過程中，研究者需要耗費大量精力來平衡轉(zhuǎn)錄調(diào)控開關(guān)的正面影響與其對細胞生長的負面影響。合成生物學(xué)的元件設(shè)計最終要針對下游應(yīng)用問題進行調(diào)整，而下游應(yīng)用需要宿主細胞健康、快速生長，因此元件的細胞毒性將是合成生物學(xué)走向應(yīng)用的瓶頸問題之一。

3.2 細胞內(nèi)的一些特殊生理機制會影響人工基因線路的功能

細胞內(nèi)存在的一些生理機制也可能會對元件的功能產(chǎn)生意料之外的影響，如排隊效應(yīng)（queueing-up effect）和追溯效力（retroactivity）。合成生物元件和底盤細胞共同利用細胞內(nèi)的酶、核糖體等有限資源，資源競爭會導(dǎo)致設(shè)計上本互不相關(guān)的基因線路元件產(chǎn)生功能上的干涉。例如，帶有LAA蛋白降解標(biāo)簽的黃色熒光蛋白、青色熒光蛋白在同一大腸桿菌中過量表達時，可能過載細胞內(nèi)的 ClpXP降解機器，使得兩種不同的熒光蛋白不得不排隊進入 ClpXP的降解通道，從而使兩種不相關(guān)的蛋白降解過程產(chǎn)生干涉。這一機制被稱為排隊效應(yīng)。與此類似，細胞內(nèi)核糖體的數(shù)量不足時，mRNA的翻譯也會出現(xiàn)對核糖體的競爭，從而導(dǎo)致不相關(guān)的mRNA翻譯產(chǎn)生排隊效應(yīng)。追溯效力是指信號通路下游的系統(tǒng)給上游系統(tǒng)帶來信號反饋，從而影響上游系統(tǒng)功能的效應(yīng)。具體而言，人工基因線路中一個基因被調(diào)控的程度，可能會被其他接受同類調(diào)控的基因的個數(shù)所影響，類似于一個電阻兩端的電壓差依賴于其他并聯(lián)電阻的數(shù)目一樣。排隊效應(yīng)和追溯效力都會給人工基因線路的功能帶來嚴(yán)重影響，但設(shè)計時卻很難被面面俱到地考慮到，因此為人工基因線路的可預(yù)測設(shè)計帶來挑戰(zhàn)。

4 結(jié)論與展望

人工基因線路設(shè)計、調(diào)控元件工具箱以及組裝方法的開發(fā)在過去十幾年間經(jīng)歷了巨大的發(fā)展，然而人工基因線路與底盤細胞的各種相互作用卻阻礙了人工設(shè)計的生命系統(tǒng)的復(fù)雜度進一步提升。為了突破這個瓶頸，需要關(guān)注一些合成生物學(xué)領(lǐng)域的基本工程科學(xué)問題，如細胞生理系統(tǒng)對人工基因線路的影響及相關(guān)元件設(shè)計原則等，來獲得對未來人工基因線路研究方向的啟發(fā)。我們認為，未來研究應(yīng)重點關(guān)注以下問題：① 注重元件在不同培養(yǎng)條件下功能和行為的刻畫，并對實驗結(jié)果表述和定量方式進行標(biāo)準(zhǔn)化，便于數(shù)據(jù)的整合和分享；② 開發(fā)基于轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組等多層次的高通量技術(shù)，降低獲取合成生物的全局表型數(shù)據(jù)庫的金錢和時間成本，并做針對性的數(shù)據(jù)挖掘，為理解元件—宿主相互作用的產(chǎn)生機制提供數(shù)據(jù)支持；③ 根據(jù)需要開發(fā)新型的全細胞模型，用于描述資源分配等細胞生理規(guī)律，增強人工合成生物系統(tǒng)的預(yù)測性；④ 研發(fā)元件—宿主隔離技術(shù)和策略，總結(jié)消除兩者相互作用影響的設(shè)計原則。相關(guān)方面的深入研究將使我們真正實現(xiàn)人工生命系統(tǒng)設(shè)計的精準(zhǔn)化，促進合成生物學(xué)成果在應(yīng)用領(lǐng)域的高效轉(zhuǎn)化。

（摘自《中國科學(xué)院院刊》2018年第11期）