宋家樂,錢 波,王程強,曾 榛,吳 華,高 揚,*

(1.桂林醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院,廣西桂林 541100;2.東南大學公共衛(wèi)生學院,江蘇南京 210009;3.廣西高校預防醫(yī)學重點實驗室,廣西桂林 541100;4.揚州大學附屬蘇北人民醫(yī)院藥學部,江蘇揚州 225001)

柚子(CitrusmaximaMerr.)屬蕓香科柑橘屬喬木,是廣西、廣東和福建等我國廣大南方地區(qū)栽培面積和產量較高的經濟水果之一[1]。桂林地區(qū)的陽朔、平樂和荔浦等地均為廣西重要的柚子產地,年產量較大。近年來,植物類多酚和黃酮類物質因其具有的抗菌、抗炎、抗氧化、抗衰老和免疫調節(jié)等多種生物活性而受到科學研究的重視,并成為資源開發(fā)利用的重點[2]。在傳統(tǒng)柚子的采摘及深加工過程中,富含多酚與黃酮類物質的柚葉作為農業(yè)資源廢棄物而被丟棄,這造成了生物資源的極大浪費[3-4]。

研究發(fā)現,潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis)和克羅恩病(Crohn’s disease)等炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD),腸應激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)及腸道腫瘤的發(fā)生與患者腸道上皮組織的健康狀況存在很大關聯。腸黏膜屏障功能障礙是誘發(fā)IBD、IBS及腸道腫瘤的重要原因[5]。腸黏膜屏障是分別由腸黏膜上皮構成的機械屏障,來自腸黏膜組織所分泌的黏液和消化液所組成的化學屏障,由腸道中固有微生物菌落所構成的生物屏障,由腸道組織中免疫系統(tǒng)及其所分泌的免疫物質構成的免疫屏障等四部分所構成的具有維持腸內環(huán)境穩(wěn)定功能,阻隔外源性有害物質進入血液循環(huán)系統(tǒng)的一類具有特殊生理功能的結構[6]。因此,腸上皮細胞和細胞間緊密連接(tight junction,TJs)在防止病原微生物入侵,細菌移位等方面具有重大意義[7]。臨床IBD患者及腸道腫瘤患者的腸上皮組織中的細胞間緊密連接結構遭受破壞,上皮細胞通透性增大,腸黏膜屏障損毀嚴重[8]。改善腸上皮功能,維持細胞間緊密結構完整則有助于改善IBD、IBS及腸道腫瘤患者的臨床癥狀[9]。

當前,鮮見關于柚葉總黃酮提取物對于腸道上皮細胞高通透性保護作用的研究報道。而人結腸癌Caco-2細胞是被公認用于研究腸道屏障損傷與修復機制研究的經典細胞系,該細胞系具有與正常小腸上皮細胞類似的緊密連接、微絨毛等結構及酶系分泌功能[10]。因此,本實驗設想通過利用細菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導Caco-2細胞建立細胞高通透性模型。并以此模型來研究柚葉總黃酮是否能夠對細胞高通透性起到改善作用,同時就此探討可能的保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮柚葉 采自廣西壯族自治區(qū)平樂縣龍窩果園,并經桂林醫(yī)學院藥學院生藥學教研室鑒定;Caco-2人結腸腺癌細胞系 由桂林醫(yī)學院生物技術學院鄒先瓊教授饋贈,本實驗室保藏,細胞引種自中國科學院上海細胞資源中心;DMEM高糖型細胞培養(yǎng)液、青霉素-鏈霉素雙抗、胰蛋白酶-EDTA消化液、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、Trizol試劑、OligodT18、RNase、dNTP、MLV逆轉錄酶 美國Thermo Scientific公司;Transwell 小室(貨號354482) 美國Corning公司;ROX reference Dye、SYBR Premix Ex Taq II 日本TAKARA公司;異硫氰酸熒光素(FITC)-右旋糖酐(FD40,分子量40000 Da)、大腸桿菌脂多糖(LPS)、Hank’s平衡鹽溶液(Hank’s balanced salt solution,HBSS) 美國Sigma-Aldrich公司;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒 南京建成生物工程研究所;IL-1β、IL-8、TNF-α試劑盒 美國Cloud colon公司;蘆丁(rutin)標準品 中國藥品生物制品檢定所；無水氯化鋁、醋酸鈉和醋酸 上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；其他化學試劑 均為國產分析純。

EYELA N-1001S真空旋轉蒸發(fā)儀 東京理化器械株式會社;Biotek Elx808酶標儀 美國伯騰儀器有限公司;ND2000超微量核酸蛋白測定儀、3110型二氧化碳細胞培養(yǎng)箱 美國Thermo Scientific公司;AL204電子分析天平 梅特勒-托利多公司上海有限公司;電熱恒溫水浴鍋HWS-28 上海一恒科學儀器有限公司;FLUOstar OPTIMA熒光酶標儀 德國BMG公司;MERS00002 Millicell-ERS上皮跨膜細胞電阻儀 美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 柚葉總黃酮提取物的制備 雙蒸水沖洗新鮮柚葉除雜后,真空冷凍干燥。凍干柚葉經粉碎后過60目篩備用。取柚葉粉(10 g)加入300 mL乙醇(80%,V/V)后,在80 ℃條件下提取6 h[2]。濾液經3000×g離心15 min后棄渣收集上清液,50 ℃真空減壓旋轉蒸發(fā)后,制成柚葉總黃酮提取物。

1.2.2 提取物中總黃酮含量測定 采用氯化鋁比色法測定提取物中總黃酮含量。在10 mL的標準比色管中分別加入0.0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL的蘆丁溶液(0.4 mg/mL),隨后加入2.0 mL的氯化鋁溶液(0.1 mol/L)和3.0 mL的醋酸鈉-醋酸溶液(pH5.4),避光反應30 min后,分別測定420 nm處吸光度,算得標準曲線(Y=6.342X-0.035,R2=0.995)。計算出提取物中黃酮含量為11.54 mg rutin/g,總黃酮提取物置于-80 ℃儲存待用。

1.2.3 細胞的培養(yǎng)與實驗分組 Caco-2人結腸腺癌細胞用DMEM培養(yǎng)液(含10%的FBS與1%青-鏈霉素雙抗液)置于37 ℃、5% CO2環(huán)境下濕化培養(yǎng)。細胞貼壁長至80%時,胰蛋白酶-EDTA液按比例消化傳代,取指數期細胞用于實驗。以DMEM培養(yǎng)液(含LPS:2 μg/mL)處理細胞24 h制備細胞模型。模型細胞以柚葉總黃酮提取物(0、10、50、100、150 μg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)24 h并進行后續(xù)實驗。正常組為未經過任何處理的正常Caco-2細胞。

1.2.4 乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)水平及細胞存活率的測定 所有細胞按1.2.3中所述分組進行處理后,首先收集96培養(yǎng)板中培養(yǎng)基上清液,采用比色試劑盒按照說明書操作要求進行LDH酶活性測定。細胞生存率測定時,在已移除培養(yǎng)基的96培養(yǎng)板中加入100 μL含MTT試劑(終質量濃度:0.5 mg/mL)的細胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h。待培養(yǎng)結束后棄上清液,每孔加入100 μL的DMSO試劑避光振蕩30 min,測定OD490 nm后按公式:細胞生存率(%)=OD樣品組/OD正常組×100來計算細胞生存率。

1.2.5 細胞因子白介素(interlukin-1β,IL-1β),IL-8和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)分泌水平測定 細胞接種至培養(yǎng)板,并依照前述1.2.3中所述濃度進行樣品處理。待實驗終點時,4 ℃下收集培養(yǎng)上清液,按照ELISA測定試劑盒說明步驟操作測定IL-1β、IL-8和TNF-α水平(單位以pg/mL表示)。

1.2.6 細胞膜通透性水平測定 實驗前測定跨上皮細胞電阻(trans epithelial electrical resistance,TEER),選取屏障完整的細胞(TEER≥100 Ω.cm2)用于實驗。細胞接種至Transwell小室中并依1.2.3所述處理。移除Transwell小室內外的培養(yǎng)液,HBSS液(pH7.4)沖洗細胞3次,37 ℃孵育30 min后測量TEER值,待TEER值穩(wěn)定后記錄數據。此外,在Transwell小室頂端腔內加入100 μL的HBSS液(含有終濃度為1 mg/mL的FD-40),37 ℃孵育2 h,收集側腔內溶液,使用FLUOstar OPTIMA熒光酶標儀測定熒光強度(激發(fā)波長480 nm,發(fā)射波長530 nm)。

1.2.7 qRT-PCR法檢測細胞中相關因子的mRNA轉錄水平 qRT-PCR法檢測細胞中相關因子的mRNA轉錄水平。使用Trizol試劑提取細胞總RNA,ND2000超微量核酸測定儀檢測提純后的RNA濃度用于后續(xù)實驗。取總RNA(2 μg)加入dNTPs(1 μL)、OligodT18引物(1 μL)、MMLV逆轉錄酶(1 μL)、RNases抑制劑(1 μL)及5×Buffer(10 μL)逆轉錄成cDNA。取適量cDNA(2 μL)用qRT-PCR法檢測閉鎖蛋白(Occludin)、緊密連接蛋白-1(claudin-1)、封閉小帶蛋白(ZO-1)和肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)的表達量。在總反應體系中(20 μL)加入對應引物(10 μmol/L)各1 μL、2×SYBR Premix Ex Taq II(10 μL)、50×ROX reference Dye(0.4 μL)和滅菌雙蒸水(5.6 μL),充分混勻后置于Quant Studio TM 6 Flex PCR儀中進行反應。擴增反應條件為95 ℃ 30 s,95 ℃ 25 s,55 ℃ 25 s,72 ℃ 50 s,共40個循環(huán),72 ℃延伸5 min。每個基因cDNA樣本平行擴增3次,取Ct值均數,依公式計算目的基因表達量[F=2(檢測樣品中基因的Cr值-檢測樣品中持家基因的Cr值)/2(空白樣品中基因的Cr值-空白樣品中持家基因的Cr值)]。相關基因的引物序列如下所述:IL-1β(上游:5′-GAATGACGCCCTCAATCAAAGT-3′,下游:5′-TCATCTTGGGCAGTCACATACA-3′),IL-8(上游:5′-CCTGAACCTTCCAAAGATGGC-3′,下游:5′-TTCACCAGGCAAGTCTCCTCA-3′),TNF-α(上游:5′-GAGGCCAAGCCCTGGTATG-3′,下游:5′-CGGGCCGATTGATCTCAGC-3′),Occludin(上游:5′-CTTCCAATGGCAAAGTGAATGAATGA-3′,下游:5′-TACCACCGCTGCTGTAACGAG-3′),claudin-1(上游:5′-CCAGGTACGAATTTGGTCAGG-3′,下游:5′-TGGTGTTGGGTAAGAGGTTGT-3′),ZO-1(上游:5′-GAGCCTAATCTGACCTATGAACC-3′,下游:5′-TGAGGACTCGTATCTGTATGTGG-3′),MLCK(上游:5′-CAACAGGGTCACCAACCAGC-3′,下游:5′-GCCTTGCAGGTGTACTTGGC-3′),GAPDH(上游:5′-CCATTTGATGTTAGCGGGATCTC-3′,下游:5′-TGGTCTACATGTTCCAGTATGACT-3′)。

1.3 數據處理與統(tǒng)計分析

本研究中,所有實驗均重復3次,結果以均值(means)±標準偏差(SD)表示。實驗數據運用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析與統(tǒng)計處理,p<0.05為具有統(tǒng)計差異。

2 結果與分析

2.1 柚葉總黃酮提取物對LPS所致Caco-2細胞生存率和細胞LDH釋放水平的影響

人結腸癌Caco-2細胞經LPS(2 μg/mL)處理后,細胞的生存率較正常組細胞相比下降至43.86%(圖1)。受損細胞的生存率隨柚葉總黃酮提取物處理濃度的增加呈逐漸升高之趨勢,并呈現出顯著的劑量效應關系(p<0.05)。高濃度(100和150 μg/mL)的柚葉總黃酮提取物處理后,受損細胞的生存率分別升高至71.3%和86.1%。

細胞遭受外界強烈的應激刺激導致細胞膜損傷后,在正常生理情況下穩(wěn)定存在于細胞內部的功能酶LDH能夠直接從細胞內部溢出。因此,LDH是常用于評估細胞損傷發(fā)生程度的生物指標之一[10]。與正常細胞相比,LPS處理導致細胞中LDH的溢出量較正常組細胞增加4.29倍(圖1)。而柚葉總黃酮提取物處理能夠顯著降低受損細胞中LDH的外溢水平,且抑制效果存在顯著的劑量效應關系(p<0.05)。高濃度柚葉總黃酮提取物(100和150 μg/mL)處理受損細胞后,細胞中LDH溢出水平較未經柚葉總黃酮處理過的模型細胞中LDH的溢出水平分別降低38.7%和57.9%。

圖1 柚葉總黃酮提取物對LPS處理后的Caco-2細胞生存率和細胞內LDH釋放水平的影響Fig.1 Effects of PLTFE on cell viability and LDH levels in LPS treated intestinal Caco-2 cells 注:不同字母不同表示組間差異顯著(p<0.05);圖2～圖5同。

2.2 柚葉總黃酮提取物對LPS處理Caco-2細胞中IL-1β、IL-8、TNF-α分泌水平的影響

異常升高的IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等炎細胞因子是導致腸組織細胞間緊密連接丟失、細胞上皮屏障損傷及IBD、IBS等消化道疾病的主要原因之一[11-14]。LPS(2 μg/mL)刺激能夠顯著增加Caco-2細胞中IL-1β、IL-8和TNF-α的分泌(p<0.05)(圖2)。經不同濃度柚葉總黃酮提取物干預后,細胞內IL-1β、IL-8和TNF-α異常升高的分泌水平均得到顯著抑制(p<0.05)。100和150 μg/mL的高濃度柚葉總黃酮提取物,能使損傷細胞中IL-1β的分泌水平較LPS模型細胞中IL-1β水平分別降低36.53%和45.03%,IL-8的分泌水平分別降低39.66%和51.13%。而在TNF-α分泌水平方面,柚葉總黃酮提取物(100和150 μg/mL)能夠使TNF-α水平較LPS模型細胞中TNF-α水平分別降低46.47%和53.80%。

圖2 柚葉總黃酮提取物對LPS處理Caco-2細胞中IL-1β、IL-8和TNF-α分泌水平的影響Fig.2 Effects of PLTFE on IL-1β,IL-8 and TNF-α levels in LPS treated intestinal Caco-2 cells

2.3 柚葉總黃酮提取物對LPS處理Caco-2細胞中IL-1β、IL-8與TNF-α的mRNA轉錄水平的影響

LPS(2 μg/mL)處理能夠顯著刺激Caco-2細胞中IL-1β、IL-8和TNF-α的mRNA轉錄(圖3)。不同濃度的柚葉總黃酮提取物處理細胞后,細胞內IL-1β、IL-8和TNF-α的mRNA轉錄水平均得到顯著抑制(p<0.05)。較未經過柚葉總黃酮提取物處理的LPS模型組細胞而言,高濃度柚葉總黃酮提取物(100和150 μg/mL)能夠分別有效降低LPS模型細胞中IL-1β的轉錄水平至28.45%和41.77%,IL-8轉錄水平至22.43%和26.73%。同時,柚葉總黃酮提取物還能顯著抑制LPS模型細胞中TNF-α的轉錄水平至30.12%和35.85%。而抑制IL-1β、IL-8和TNF-α等的過度表達,能夠降低腸道組織中的炎性水平,減緩高炎癥環(huán)境下導致腸上皮細胞間細胞緊密連接丟失的發(fā)生[12-14]。

圖3 柚葉總黃酮提取物對LPS處理Caco-2細胞中IL-1β、IL-8和TNF-α的mRNA轉錄水平影響Fig.3 Effects of PLTFE on IL-1β,IL-8 and TNF-α mRNA expression in LPS treated intestinal Caco-2 cells

2.4 柚葉總黃酮提取物對LPS處理Caco-2細胞的膜通透性影響

反映腸上皮屏障模型離子通透性改變情況的跨上皮細胞電阻(TEER)值,是用于檢測腸上皮細胞單層屏障功能變化的經典指標之一[15]。LPS處理顯著造成Caco-2細胞TEER值的降低(圖4)。給予不同濃度柚葉總黃酮能夠顯著提升模型細胞的TEER值(p<0.05)。柚葉總黃酮提取物(10、50、100和150 μg/mL)處理后,細胞的TEER值分別較未經處理的LPS組TEER值升高1.07倍、1.20倍、1.63倍和1.95倍。此外,反映腸屏障細胞模型大分子物質透過能力的異硫氰酸熒光素(FITC)-右旋糖酐(FD-40)透過率,同樣也是反映細胞間緊密連接和細胞單層屏障功能的常用指標之一[16]。FD-40的數值與腸上皮屏障模型細胞的通透性成正相關[17]。如圖4所示,LPS處理顯著造成Caco-2細胞的通透性增高,模型細胞的FD-40透過水平在經柚葉總黃酮處理后均呈顯著下降趨勢(p<0.05)。其中,柚葉總黃酮提取物(10、50、100和150 μg/mL)處理組中細胞的FD-40水平分別較LPS組細胞的FD-40透過水平降低6.14%、18.13%、28.15%和39.04%。

圖4 柚葉總黃酮提取物對LPS處理Caco-2細胞TEER與FD-40透過水平的影響Fig.4 Effects of PLTFE on TEER and FD-40 flux levels in LPS treated intestinal Caco-2 cells

2.5 柚葉總黃酮提取物對LPS處理Caco-2細胞中Occludin、claudin-1、ZO-1和MLCK的mRNA轉錄水平影響

相鄰腸上皮細胞間緊密連接所形成的環(huán)帶狀蛋白復合體,是構成腸上皮屏障的基本單位,腸上皮屏障的重要生理功能在于參與調控物質的跨上皮運輸,維持細胞間的構造的穩(wěn)定及負責細胞間的相互通訊等[18]。Occludin、claudin-1與ZO-1都是構成TJ結構的重要組成部分[19]。LPS處理造成Caco-2細胞中Occludin、claudin-1和ZO-1的mRNA轉錄水平呈顯著下降趨勢(圖5)。LPS組細胞與正常組細胞相比較發(fā)現,Occludin、claudin-1和ZO-1的mRNA轉錄水平分別下降67.30%,42.63%和55.86%。而給予柚葉總黃酮提取物處理后,受損細胞中Occludin、claudin-1和ZO-1的mRNA轉錄水平均顯著回升。特別是100和150 μg/mL的高濃度柚葉總黃酮提取物處理后,Occludin轉錄水平較LPS模型細胞分別提升了1.62倍和1.97倍;claudin-1轉錄水平較LPS模型細胞分別提升了1.37倍和1.49倍;ZO-1轉錄水平較LPS模型細胞分別提升了1.81倍和2.04倍。屬于鈣調素激酶的MLCK在參與調控細胞間TJ結構的過程中也起著非常重要的作用。當外界刺激導致MLCK自身被激活后,MLCK能夠迅速通過磷酸化肌球蛋白輕鏈(MLC),動員其參與肌動蛋白收縮,使細胞骨架發(fā)生重排[20]。而細胞骨架的重排又能直接引發(fā)細胞TJ結構的異常,造成細胞間隙的直接開放,最終導致細胞間通透性增高[21]。如圖5示,相比正常細胞組中MLCK的mRNA轉錄水平而言,LPS處理后的Caco-2細胞中MLCK的轉錄水平顯著升高(p<0.05)。相反,模型細胞中經過柚葉總黃酮提取物處理后,MLCK的mRNA轉錄水平均得到抑制。高濃度柚葉總黃酮提取物(100與150 μg/mL)能夠顯著抑制MLCK的mRNA轉錄水平(抑制率為13.31%和23.82%)。適當調控腸上皮細胞中MLCK的活化程度,對于維持腸上皮細胞屏障以及維持細胞間緊密連接的正常具有非常重要的作用[22]。

圖5 柚葉總黃酮提取物對LPS處理Caco-2細胞中細胞間緊密連接相關因子的mRNA轉錄水平的影響Fig.5 Effects of PLTFE on tight junction related factors mRNA expression in LPS treated intestinal Caco-2 cells

3 結論

本研究利用LPS構建Caco-2腸上皮細胞高通透性細胞模型,主要研究了柚葉總黃酮提取物對模型細胞發(fā)生高通透性的改善效果。研究結果提示,柚葉總黃酮提取物首先能有效抑制LPS處理所造成的細胞損傷,提升受損細胞的生存率,并抑制損傷細胞內LDH的外溢。同時,柚葉總黃酮提取物能有效抑制LPS所導致模型細胞中IL-1β、IL-8和TNF-α等炎性細胞因子分泌,并抑制這些炎性細胞因子的mRNA轉錄。柚葉總黃酮提取物的處理還能改善模型細胞膜高通透性的發(fā)生,而在細胞通透性關聯TJ相關因子調控方面,柚葉總黃酮提取物能夠顯著上調受損細胞中緊密連接相關因子(Occludin、claudin-1和ZO-1)的mRNA轉錄,并顯著降低MLCK的mRNA高轉錄。綜合上述實驗結果,柚葉總黃酮提取物對LPS所致Caco-2細胞發(fā)生高通透性的保護作用可能與其具有較強的抗炎作用效果,及其對細胞緊密連接相關因子的mRNA轉錄水平的調控能力存在一定的關系。而在今后的研究中,課題組將以負責調控細胞緊密連接蛋白表達的MLCK信號通路作為研究重點,并對該通路活化過程中各上、下游信號分子的調控作用展開深入研究。