王 楚,張 倩,李 陽,牛 宇,楊 埔,牛 偉,張麗珍,*

(1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太原 030006;2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟(jì)研究所,山西太原 030006;3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,山西太原 030031)

甜櫻桃(PrunusaviumL.)又名大櫻桃、車?yán)遄?、西洋櫻?為薔薇科(Rosaceae)櫻桃屬(Cerasus)植物,原產(chǎn)歐洲和西亞,19世紀(jì)70年代從歐洲傳入中國[1-2]。甜櫻桃是中國增長最快的栽培和消費(fèi)水果之一[3-5]。山西因地處黃土高原東部,土層深厚、光照充足,氣候獨(dú)特、晝夜溫差大,生產(chǎn)的櫻桃甜度大、口感好,正逐漸發(fā)展成為甜櫻桃的中晚熟品種的主產(chǎn)地。甜櫻桃果實(shí)有非常高的營養(yǎng)價(jià)值,生物活性成分也極其豐富,包括維生素C、花青素、槲皮素、黃烷-3-醇、黃烷醇和羥基肉桂酸鹽等[6],具有較強(qiáng)的抗氧化能力,在預(yù)防疾病和維持人體健康方面起著非常重要的作用[7-8]。

新鮮的甜櫻桃果實(shí)皮薄、柔軟多汁、營養(yǎng)豐富,加上采收時(shí)氣溫較高,空氣濕度大,為各類病原微生物的生長提供了有利的溫度和濕度條件[9]?？諝鉂穸容^高容易導(dǎo)致櫻桃發(fā)生裂果的現(xiàn)象,形成微創(chuàng)口,更容易感染病原菌,采后不耐貯運(yùn),據(jù)報(bào)道每年因微生物侵染引起甜櫻桃采后損失高達(dá)50%以上[10]。目前國內(nèi)外對甜櫻桃真菌性病害研究尚少,且對病害的防治策略尚不明確。

為明確引起山西地區(qū)甜櫻桃采后腐爛的病原菌種類,本研究針對產(chǎn)自山西省櫻桃種植地的甜櫻桃果實(shí)在低溫貯藏過程中的病原微生物,對其進(jìn)行分離純化,在形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上,結(jié)合基因序列進(jìn)行分析,從分子水平上將菌株鑒定到屬種,以期為甜櫻桃采后貯藏保鮮提供一定的科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅瑪瑙甜櫻桃 山西省農(nóng)科院櫻桃種植基地;Tris飽和酚、氯仿 生工生物工程(上海)股份有限公司;異丙醇 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;70%乙醇 天津市化學(xué)試劑三廠;Master Mix酶、核酸染色劑 全式金生物技術(shù)有限公司;硫酸鎂 天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司;蔗糖、硫酸亞鐵 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;硝酸鈉 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;氯化鉀、磷酸氫二鉀 天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心;瓊脂粉、PDA粉 北京索萊寶科技有限公司;蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;保鮮盒 臺(tái)州黃巖捷旺模具有限公司。

BXM-30R不銹鋼立式壓力蒸汽滅菌、BSP-150生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;FK-A 組織搗碎機(jī) 常州國宇儀器制造有限公司;G50研磨儀 佛山市順德區(qū)冠宇達(dá)有限公司;BCM-1000A超凈工作臺(tái) 蘇凈安泰;OLYMPUSDP73正置熒光顯微鏡 東京都涉谷區(qū)幡之谷生產(chǎn);Neofuge13臺(tái)式高速離心機(jī)、T960 PCR擴(kuò)增儀 力康生物醫(yī)療科技控股集團(tuán);DYCP-31DN電泳儀 北京市六一儀器廠;Ge1DocXR+凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 甜櫻桃的預(yù)處理 選擇顏色大小一致、無病蟲害、無機(jī)械損傷的櫻桃果實(shí)在(0±0.5) ℃預(yù)冷24 h后,裝入15 cm×10 cm×6 cm的經(jīng)紫外燈照射過30 min的保鮮盒中封閉保存,每盒300.0 g樣品,共30盒樣品,貯藏于0 ℃冷庫中,貯存30 d左右,取有明顯病癥的果實(shí)分離病原菌。

1.2.2 病原菌的分離純化 收集在0 ℃冷庫中的櫻桃病果,用組織分離法進(jìn)行分離。用75%酒精表面消毒5 s后,用無菌水清洗3次,用滅過菌的鑷子撕去櫻桃表皮,取其中的病果組織接種于PDA培養(yǎng)基平板中,將平板置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待菌落長出后采用平板劃線法分離,后于28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d,將獲得的菌落純化多次直至獲得單一菌落。將純化的菌株置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 病原菌致病性檢測 根據(jù)柯赫氏法則[11-13],將分離純化得到的病原菌回接到健康的櫻桃果實(shí)上。選取60顆健康櫻桃果實(shí)并將其在2%的次氯酸鈉溶液中浸泡30 s,無菌水漂洗3次,自然風(fēng)干。用經(jīng)高壓蒸汽滅菌的針在果實(shí)赤道部刺3 mm深的傷口,取10 μL濃度為105CFU·mL-1菌懸液接種于刺傷部位,接種后將其置于密封的塑料盒中,并在28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d,重復(fù)3次。每隔24 h觀察病斑發(fā)展速度與發(fā)病程度,選取明顯發(fā)病果實(shí)再次進(jìn)行病原菌的分離鑒定,判斷與所接菌株的菌落形態(tài)是否一致,若一致則為采后病原菌。

1.2.4 病原菌的形態(tài)學(xué)分析

1.2.4.1 病原菌的菌落形態(tài)分析 將分離純化后所得的一定數(shù)量病原菌分別接種到PDA培養(yǎng)基中,置于28 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.2.4.2 病原菌的顯微形態(tài)分析 將滅過菌的蓋玻片以45 ℃角插入察氏培養(yǎng)基內(nèi),將菌種用接種環(huán)接在蓋玻片與培養(yǎng)基相接的沿線上,將平板置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng),病原真菌YTA培養(yǎng)5～7 d,病原真菌YTB培養(yǎng)10～14 d。用鑷子將蓋玻片取出,將長勢好的一面蓋在已滴有1滴乳酸酚棉藍(lán)染液的載玻片上,擦去蓋玻片上菌種長勢較差的一面,在顯微鏡下對病原菌菌絲體和分生孢子進(jìn)行形態(tài)觀察、拍照[14]。

1.2.5 病原菌分子生物學(xué)鑒定 用無菌解剖刀刮取0.1～0.2 g病原真菌YTA和YTB菌絲于1.5 mL離心管中,加入少量的聚乙烯吡咯烷酮(PVP),石英砂和預(yù)熱的CTAB抽提液用G50研磨儀研磨至勻漿,采用改良的CTAB法[15]提取病原真菌基因組DNA,置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?yīng)用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGA TATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAA CAAGG-3′),以分離得到的病原菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增;引物均由金唯智(蘇州)有限公司合成。50 μL PCR反應(yīng)體系:94 ℃變性4 min,94 ℃ 50 s,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,共35個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳,在全能成像系統(tǒng)上觀察并記錄結(jié)果。PCR產(chǎn)物送往金唯智(蘇州)有限公司測序。

1.2.6 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將測序所得的基因序列拼接后,提交到NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫,應(yīng)用BLAST進(jìn)行同源序列比對,下載相近的參比序列并利用MEGA6.0軟件以NJ鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,分析病原菌與同屬其它菌株的親緣關(guān)系,以確定其分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀及致病性

將從甜櫻桃果實(shí)發(fā)病部位分離出的2株病原菌,編號為YTA和YTB,回接于健康櫻桃的刺傷部位進(jìn)行致病性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明接種YTA時(shí),接種第4 d時(shí)果實(shí)出現(xiàn)明顯病癥,發(fā)病率為100%;YTB在第4 d時(shí)果實(shí)出現(xiàn)病癥,發(fā)病率為100%;回接后出現(xiàn)的癥狀與自然條件下發(fā)病癥狀一致(圖1)?；亟覻TA后出現(xiàn)綠色病斑,病斑凹陷,呈現(xiàn)水樣狀;回接YTB后出現(xiàn)白色病斑,之后果柄處長出白色菌絲,整個(gè)果實(shí)呈現(xiàn)黑褐色,后期全果腐爛。從甜櫻桃發(fā)病部位重新分離病原菌,得到的病原菌與所接病原菌形態(tài)一致。由此證明YTA和YTB病原菌均是造成山西省甜櫻桃采后腐爛的病原菌。

圖1 病原菌回接櫻桃Fig.1 Sweet cherry fruits inoculated with the pathogens注:圖中左側(cè)為病果樣品,右側(cè)為病原菌回接結(jié)果

2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)分析

2.2.1 菌落形態(tài)學(xué)分析 將2株病原菌分別接種到PDA培養(yǎng)基中,置于28 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。YTA菌絲初期為白色,培養(yǎng)3 d左右開始變?yōu)榛揖G色,菌落相對平坦,質(zhì)地絨毛狀或絮狀,在菌落邊緣形成一圈濃密白色絨毛,菌落中間呈灰綠色,6～7 d可長滿直徑為9 cm的PDA培養(yǎng)基,菌落在培養(yǎng)皿背面近于黃色,易于觀察(見圖2a);YTB菌落疏松、干燥、不透明、不易挑取、質(zhì)地呈絨毛狀、菌絲稀疏其形態(tài)類似針狀向外輻射,初期為白色后逐漸變?yōu)樯罨疑?產(chǎn)孢量少,培養(yǎng)皿背面呈黑褐色(見圖2b)。

圖2 2株病原菌的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of the two strains pathogens 注:a:YTA;b:YTB。

2.2.2 顯微形態(tài)分析 將2株病原菌在顯微鏡下進(jìn)行顯微觀察。YTA的分生孢子呈橢圓形,大小均勻(見圖3a);在分生孢子梗端連續(xù)成串生長,分生孢子鏈呈圓柱狀,分生孢子梗通常單輪生,偶有雙輪生或三輪生,無隔膜,幼齡時(shí)分生孢子梗呈瓶狀(見圖3b);成熟時(shí)分生孢子梗呈笤帚狀,分生孢子大量產(chǎn)生易脫落(見圖3c)。YTB的分生孢子呈卵圓形,大小不均一,分生孢子呈灰綠色(見圖3d);頂端形成膨大的頂囊(見圖3e);菌絲體疏松,成網(wǎng)狀,菌絲粗糙有隔膜,分生孢子梗不明顯,分生孢子頂生或側(cè)生(見圖3f)。

圖3 2株病原菌的顯微形態(tài)(40×)Fig.3 Microscopic morphology of the two strains pathogens(40×)注:a:YTA分生孢子,b:YTA幼齡時(shí)分生孢子梗,c:YTA成熟時(shí)分生孢子梗;d:YTB分生孢子,e:YTB膨大的頂囊,f:YTB菌絲和分生孢子。

2.3 基因序列分析結(jié)果

應(yīng)用ITS通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,YTA和YTB菌株分別獲得了長度為500 bp左右的清晰條帶,電泳結(jié)果見圖4。將純化的PCR產(chǎn)物直接測序,分別獲得了551和490 bp的序列。

圖4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果Fig.4 Electrophoresis analysis of PCR amplified products注：M：Marker。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

對2株病原菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定,將PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行測序,將測序所得的基因序列提交到NCBI的GenBank,應(yīng)用BLAST進(jìn)行同源序列比對。病原真菌YTA的ITS序列與GenBank中Penicilliumoxalicum和Penicilliumsimplicissimum有較高的同源性。從GenBank數(shù)據(jù)庫中選取代表青霉屬不同種的ITS序列,以爪哇正青霉Eupenicilliumjavanicum(KF313084)作為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果顯示:菌株YTA與親緣關(guān)系較近的草酸青霉(PenicilliumoxalicumDQ123663)聚于同一支(圖5)。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征,最終將病原真菌YTA鑒定為草酸青霉(Penicilliumoxalicum)。

圖5 YTA菌株基于rDNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on the rDNA-ITS sequences of YTA pathogen

病原真菌YTB的ITS序列與GenBank中Botrytiscinerea和Botrytisfabiopsis有比較高的同源性。從GenBank數(shù)據(jù)庫中選取代表葡萄孢屬不同種的ITS序列,以果生鏈核盤菌Moniliniafructicola(EF207421),桃褐腐病菌Monilinialaxa(EF153016)和核盤菌Sclerotiniasclerotiorum(KF878372.1)作為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果顯示:菌株YTB與親緣關(guān)系較近的葡萄孢屬(Botrytissp.LeekBC-18FJ169673)聚于同一支(圖6)。結(jié)合其形態(tài)學(xué)培養(yǎng)特征,將病原真菌YTB鑒定為葡萄孢屬(Botrytissp.)。

圖6 YTB菌株基于rDNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree based on the rDNA-ITS sequences of YTB pathogen

3 討論與結(jié)論

目前已報(bào)道引起甜櫻桃果實(shí)采后腐爛的病原微生物主要有青霉屬(Penicillium)、鏈核盤菌屬(Monilinia)、鏈格孢屬(Alternaria)、炭疽菌屬(Colletotrichum)、葡萄孢屬(Botrytis)、曲霉屬(Aspergillus)、根霉屬(Rhizopus)、枝孢霉屬(Cladosporium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、地絲菌屬(Geotrichum)、盤長孢屬(Gloeosporium)、毛霉屬(Mucor)、成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)等[16-18]。本研究對山西晉中地區(qū)低溫貯藏過程中甜櫻桃的病原菌進(jìn)行分離純化與回接,獲得了2株真菌YTA和YTB。對2株病原菌YTA和YTB進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定,結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征,分別鑒定為草酸青霉(Penicilliumoxalicum)、葡萄孢屬(Botrytissp.)。

張先富等[19]將草酸青霉作為一種拮抗菌來抑制連作土壤中尖孢鐮孢菌生長。本實(shí)驗(yàn)中對病原菌YTA進(jìn)行分離鑒定后進(jìn)一步進(jìn)行甜櫻桃果實(shí)體外致腐性實(shí)驗(yàn),接種病原菌YTA的櫻桃果實(shí)均發(fā)病,且發(fā)病癥狀與低溫貯藏過程中癥狀一致,從發(fā)病部位重新分離病原菌,得到的病原菌與所接病原菌形態(tài)一致,由此證明草酸青霉(Penicilliumoxalicum)是引起山西省甜櫻桃采后腐爛的一種病原真菌。

葡萄孢菌(Botrytiscinerea)是采后甜櫻桃果實(shí)灰霉病原菌[20-22]。病原菌進(jìn)行分離鑒定后進(jìn)一步進(jìn)行甜櫻桃果實(shí)體外致腐性實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明葡萄孢屬(Botrytissp.)同樣是引起山西省甜櫻桃采后腐爛的病原菌。

本次實(shí)驗(yàn)與以往研究的引起甜櫻桃采后腐爛的病原微生物種類有所差異,究其原因可能是不同病原菌侵入不同品種櫻桃組織的途徑不同,以及地理環(huán)境、生長條件和氣候條件等方面的差異,而導(dǎo)致在貯藏過程中引起櫻桃腐爛的病原微生物種類存在一定的差異[14]。通過對山西省低溫貯藏過程中甜櫻桃病原菌的研究,明確了引起甜櫻桃采后病原菌的種類,為進(jìn)一步加強(qiáng)新鮮櫻桃運(yùn)輸、貯藏過程中微生物病害防治及今后抑制甜櫻桃的腐爛奠定了理論基礎(chǔ)。