吳 姍，李 可，方 云，樓成杰，虞惠貞，張明哲，帥江冰，張曉峰

（浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，杭州310016）

單核細(xì)胞增生李斯特菌（簡(jiǎn)稱單增李斯特菌）和致病性弧菌是生活中常見的、危害性較大的食源性致病菌。人感染單增李斯特菌往往是通過攝入被污染的食品如牛奶、奶酪、肉類和海鮮等引起的[1]。新生兒、孕婦及其他40歲以上的成人、免疫功能缺陷者都是易感人群。感染單增李斯特菌后的癥狀可表現(xiàn)為突然發(fā)熱、劇烈頭痛、惡心、嘔吐、腹瀉、敗血癥、腦膜炎、流產(chǎn)等。自20世紀(jì)90年代以來，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization,WHO）將單增李斯特菌列為4大食源性疾病的致病菌之一?；魜y弧菌、副溶血弧菌、哈維弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、梅氏弧菌等都是重要的致病性弧菌，可引起食物中毒，使患者出現(xiàn)腹瀉、惡心、嘔吐、發(fā)熱等癥狀，嚴(yán)重的可導(dǎo)致敗血癥，甚至死亡。其中霍亂弧菌中的O1群和O139群菌株可以引起嚴(yán)重的腹瀉，致死率較高，被《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》列為甲類傳染病。

在醫(yī)學(xué)診斷及食品微生物檢測(cè)中，除了通常使用的培養(yǎng)方法（如ISO 11290-1—2017，ISO 11290-1—1996，ISO 11290-2—1998和ISO 11290-1 AMD 1—2004）外，還開發(fā)了一系列的生物化學(xué)方法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法等[1-4]，如20世紀(jì)90年代以后，隨著新技術(shù)的出現(xiàn)，國(guó)外推出了一些基于檢測(cè)生理代謝的細(xì)菌自動(dòng)化鑒定系統(tǒng)（如API、Biolog、Vitek等）及基于免疫學(xué)的酶標(biāo)抗體法（ELISA）、熒光抗體染色法（免疫熒光法）、同位素標(biāo)記抗體法（放射免疫）等。盡管這些方法具有操作簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)，但也存在特異性較差、所需的耗材價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，目前很少在國(guó)內(nèi)推廣。以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的方法主要集中在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）技術(shù)的應(yīng)用上。PCR是一種體外酶促基因擴(kuò)增技術(shù)，可在短時(shí)間內(nèi)將靶DNA擴(kuò)增數(shù)百萬倍。該技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快速、敏感性高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是目前國(guó)內(nèi)外快速檢測(cè)技術(shù)研究的重點(diǎn)。但PCR方法在不同的實(shí)驗(yàn)室或檢測(cè)部門所檢測(cè)的目的基因和操作流程上有一定的差異，沒有形成標(biāo)準(zhǔn)，得到的檢測(cè)結(jié)果也不盡相同。近年來的實(shí)踐應(yīng)用還表明，食品和培養(yǎng)基中存在的抑制劑可影響PCR反應(yīng)，使檢測(cè)結(jié)果呈假陰性。盡管人們對(duì)PCR方法進(jìn)行了不斷的改進(jìn)和完善，卻不能有效地阻止假陰性結(jié)果的發(fā)生。熒光原位雜交法（fluorescence in situ hybridization,FISH）是基于微生物細(xì)胞中16S或23S rRNA的高拷貝數(shù)和不易受環(huán)境影響的穩(wěn)定性檢測(cè)樣品中的微生物的方法[5-6]。如SCHMID等[7]使用DNA探針結(jié)合FISH技術(shù)檢測(cè)了李斯特菌屬。肽核酸探針（peptide nucleic acid,PNA）是一種DNA的模擬物，將PNA探針和FISH技術(shù)結(jié)合可以克服DNA探針細(xì)胞穿透性差、雜交親和力不強(qiáng)等弱點(diǎn)[5,8]。PNA-FISH現(xiàn)已被用于大腸埃希菌[9]、鏈球菌[10]、坂歧腸桿菌[11]、白念珠菌[12]等細(xì)菌和真菌的檢測(cè)。上述檢測(cè)都只涉及用單重?zé)晒鈽?biāo)記探針進(jìn)行檢測(cè)。為了提高檢測(cè)通量，MALIC等[13]成功地使用3個(gè)分別標(biāo)記3種不同熒光的PNA探針同時(shí)檢測(cè)人類皮膚傷口上的3種細(xì)菌；ALMEIDA等[14]則使用多重?zé)晒鈾z測(cè)技術(shù)同步檢測(cè)了李斯特菌、沙門菌和大腸埃希菌。但上述的多重?zé)晒鈾z測(cè)對(duì)設(shè)備的要求較高，樣本都需要在激光共聚焦顯微鏡下觀察。而相比于普通熒光顯微鏡，激光共聚焦顯微鏡的普及率仍較低。因此，本研究擬嘗試用普通熒光顯微鏡實(shí)現(xiàn)雙重PNA-FISH檢測(cè)。ZHANG等[15-16]報(bào)道了用PNA-FISH方法分別檢測(cè)單增李斯特菌和弧菌的技術(shù)，在此基礎(chǔ)上，本研究采用雙色熒光分別標(biāo)記單增李斯特菌和弧菌特異性的PNA探針，以實(shí)現(xiàn)用普通熒光顯微鏡同步檢測(cè)單增李斯特菌和主要致病性弧菌的目的。

1 材料與方法

1.1 PNA探針

在本研究中所使用的PNA探針如表1所示，Lm-16S-2[15]為單增李斯特菌特異性探針，Vib-16S-1[16]為致病性弧菌特異性探針，BacUin[17]為細(xì)菌通用探針。所有探針由Panagene公司（韓國(guó)）合成。由于所使用的探針Lm-16S-2和Vib-16S-1均來自文獻(xiàn)[15-16]，因此本研究不再對(duì)探針的特異性和靈敏度進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2 細(xì)菌菌株及培養(yǎng)

在本研究中所使用的菌株見表2。由于本文的重點(diǎn)是研究使用普通熒光顯微鏡建立雙重?zé)晒釶NA探針同步檢測(cè)單增李斯特菌和致病性弧菌的方法，因此只選擇了目標(biāo)細(xì)菌菌株進(jìn)行方法的優(yōu)化，而未選擇非目標(biāo)菌株對(duì)探針的特異性進(jìn)行驗(yàn)證。

表1 PNA探針序列Table1 PNAprobe sequences used in this study

表2 所使用的菌株Table2 Strains used in this study

單增李斯特菌菌株用腦心浸出液（brain heart infusion,BHI）培養(yǎng)基培養(yǎng)，弧菌用3%氯化鈉堿性蛋白胨水（3%NaCl alkaline peptone water,APW）培養(yǎng)基培養(yǎng)。上述細(xì)菌在30℃、130 r/min條件下振蕩過夜，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.3 PNA-FISH操作步驟

離心（2 000 g，5 min）收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution,PBS）（pH 7.4）洗滌1次，再用PBS調(diào)整菌液濃度至D（600 nm）=1.0～1.2，取10μL菌液（應(yīng)用雙重?zé)晒馔瑫r(shí)檢測(cè)2種菌時(shí)，2種菌各取5μL）于用98%乙醇清洗過的玻片（1 cm×1 cm）上，涂勻，火焰固定，將玻片于80%乙醇中浸泡15 min，風(fēng)干；取25μL含500 pmol/mL PNA的雜交緩沖液（pH 7.5，10%硫酸葡聚糖，10 mmol/L NaCl，30%甲酰胺，0.1%焦磷酸鈉，0.2%聚乙烯吡咯烷酮，0.2%聚蔗糖，5 mmol/L Na2EDTA，0.2%TritonX-100，50 mmol/L Tris/HCl）滴加于玻片上（雙重?zé)晒鈾z測(cè)時(shí)，2種探針各加入12.5μL），55℃作用30 min，雜交后將玻片于55℃預(yù)熱的洗滌緩沖液（pH 10，5 mmol/L Tris，15 mmol/L NaCl，0.1%TritonX-100）中洗滌2次，每次10 min，將風(fēng)干后的涂片滴上香柏油，同時(shí)進(jìn)行陽性對(duì)照和陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以BacUin作為陽性對(duì)照探針，以不加任何探針的涂片作為陰性對(duì)照；在熒光顯微鏡（Leica DM 6000B）的100倍物鏡（滴加香柏油）下觀察其熒光亮度及細(xì)菌的形態(tài)。

1.4 2種菌液的比例對(duì)雙重PNA探針雜交結(jié)果的影響

將單增李斯特菌L.m SLCC2755和霍亂弧菌V.c MM-43的菌液濃度調(diào)節(jié)至D（600 nm）=1.0～1.2，將檢測(cè)總量控制在10μL的情況下，按比例添加2種菌液，以此比較菌液比例對(duì)雙重PNA探針雜交結(jié)果的影響。

2 結(jié)果

2.1 雙重PNA雜交條件

在前期的研究中對(duì)單增李斯特菌和弧菌的PNA-FISH雜交程序進(jìn)行了優(yōu)化，且發(fā)現(xiàn)2種菌的最佳雜交條件相近（即1.3所述雜交條件）[15-16]，因此在進(jìn)行雙重?zé)晒馓结橂s交檢測(cè)時(shí)，我們?cè)谏鲜鰞?yōu)化檢測(cè)條件下，對(duì)2種目標(biāo)細(xì)菌濃度、相應(yīng)的探針濃度及雜交條件進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化。應(yīng)用雙重?zé)晒馔瑫r(shí)檢測(cè)2種細(xì)菌時(shí)，2種細(xì)菌各取5μL，加入探針的量也變?yōu)?種探針各加入12.5μL，檢測(cè)結(jié)果如表3及圖1～4所示。當(dāng)2種細(xì)菌同時(shí)存在時(shí)，無論是加入1種探針（圖1～3）還是同時(shí)加入2種探針（圖4），都有較好的雜交結(jié)果。因此，上述檢測(cè)條件可以滿足2種細(xì)菌的同步雙重PNA探針雜交檢測(cè)。

表3 不同熒光標(biāo)記的PNA探針在不同檢測(cè)通道下對(duì)單增李斯特菌和弧菌的檢測(cè)結(jié)果Table3 Detection result of L.monocytogenes and Vibrio with different fluorescence-labeled PNAprobes at different detection channels

2.2 檢測(cè)通道的選擇

Lm-16S-2是用于檢測(cè)單增李斯特菌的PNA探針，用FAM熒光標(biāo)記，可被I3和L5濾光模塊檢測(cè)到綠色熒光；Vib-16S-1和BacUin分別是用于檢測(cè)弧菌和細(xì)菌的PNA探針，都是用Cy3作為熒光標(biāo)記，可被N21和Y3濾光模塊檢測(cè)到紅色熒光。比較這些濾光模塊可發(fā)現(xiàn)，標(biāo)記FAM熒光的細(xì)菌可被I3和L5濾光模塊檢測(cè)到綠色熒光，且在相同視野下，I3通道檢測(cè)到的熒光亮度略高于L5；同樣，標(biāo)記Cy3熒光的細(xì)菌能被N21和Y3濾光模塊檢測(cè)到紅色熒光，同樣，在相同視野下，N21檢測(cè)到的熒光亮度略高于Y3模塊。如表3所示：L.m EGD與Lm-16S-2探針雜交時(shí)，I3的綠色熒光強(qiáng)度可達(dá)到“+++”，而L5只有“++”；與BacUin探針雜交時(shí)，N21的紅色熒光強(qiáng)度可達(dá)到“+++”，而Y3只有“++”。但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，只標(biāo)記綠色熒光的細(xì)菌，也會(huì)在紅色熒光檢測(cè)模塊下檢測(cè)到紅色熒光，如L.m EGD與Lm-16S-2探針雜交時(shí)，不僅能在I3、L5通道下檢測(cè)到綠色熒光，也在N21模塊下檢測(cè)到紅色熒光；同樣，只標(biāo)記紅色熒光的細(xì)菌，也會(huì)在綠色熒光檢測(cè)模塊下檢測(cè)到綠色熒光，如V.v Vul-wz2009與Vib-16S-1探針雜交時(shí)，不僅能在N21、Y3下檢測(cè)到紅色熒光，也能在I3及L5模塊下檢測(cè)到綠色熒光，但綠色熒光強(qiáng)度明顯弱于紅色熒光，且L5檢測(cè)到的綠光更弱于I3。這說明不同熒光檢測(cè)通道間存在一定的干擾，在單色熒光檢測(cè)時(shí)，該干擾可忽略，但在不同細(xì)菌的多色熒光多重標(biāo)記、多通道同時(shí)檢測(cè)時(shí)，則要考慮由該原因?qū)е碌募訇栃詥栴}。

圖1 單增李斯特菌L.m54002和副溶血性弧菌V.pATCC17802的混合菌體雜交了Lm-16S-2探針后，在不同檢測(cè)通道下觀察到的熒光圖像Fig.1 Fluorescence images from the hybridization results of L.m 54002 and V.p ATCC17802 with Lm-16S-2 probe under different filter cubes

圖2 單增李斯特菌L.m54002和副溶血性弧菌V.pATCC17802的混合菌體雜交了弧菌探針Vib-16S-1后，在不同檢測(cè)通道下觀察到的熒光圖像Fig.2 Fluorescence images from the hybridization results of L.m 54002 and V.p ATCC17802 with Vib-16S-1 probe under different filter cubes

圖3 單增李斯特菌L.m 54002和副溶血性弧菌V.p ATCC17802的混合菌體雜交了通用探針BacUin后，在不同檢測(cè)通道下觀察到的熒光圖像Fig.3 Fluorescence images from the hybridization results of L.m 54002 and V.p ATCC17802 with BacUin probe under different filter cubes

圖4 單增李斯特菌L.m SLCC2755和霍亂弧菌V.c MM-43的混合菌體雜交了Lm-16S-2和Vib-16S-1探針后，在不同檢測(cè)通道下觀察到的熒光圖像Fig.4 Fluorescence images from the hybridization results of L.m SLCC2755 and V.c MM-43 with Lm-16S-2 and Vib-16S-1 probes under different filter cubes

在單重?zé)晒鈾z測(cè)時(shí)，檢測(cè)通道模塊I3和N21已經(jīng)能滿足檢測(cè)要求，但在多重?zé)晒鈾z測(cè)時(shí)，這2個(gè)通道間的交叉干擾會(huì)導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，因此引入L5和Y3檢測(cè)通道模塊。檢測(cè)結(jié)果顯示，L5和Y3較I3和N21產(chǎn)生的假陽性少，如L.m 54002+V.p ATCC17802與Lm-16S-2探針雜交（圖1）時(shí)，理論上只有綠色熒光通道上能檢測(cè)到綠色熒光，但N21通道也檢測(cè)到了紅光，相比較而言，Y3通道能成功屏蔽熒光的干擾，在該通道上未能檢測(cè)到假陽性的紅色熒光；同樣，L.m 54002+V.p ATCC17802與Vib-16S-1探針雜交（圖2）時(shí)，理論上只有在紅色熒光通道上能檢測(cè)到紅色熒光，但在I3通道上檢測(cè)到了較弱的綠光，而在L5通道上則未能檢測(cè)到假陽性的綠光。但L5和Y3模塊也未能杜絕相鄰熒光間的干擾，特別是用BacUin探針雜交（圖3）時(shí)，得到的熒光亮度都較強(qiáng)，因此，L5通道往往也能檢測(cè)到假陽性的綠色熒光。而在使用單增李斯特菌和弧菌的特異性PNA探針（分別標(biāo)記FAM和Cy3熒光）進(jìn)行雙重?zé)晒鈾z測(cè)時(shí)，L5和Y3檢測(cè)通道模塊是可行的。

圖4是單增李斯特菌和弧菌的混合菌液同時(shí)與2種目標(biāo)菌探針進(jìn)行雙重?zé)晒怆s交的結(jié)果，即單增李斯特菌L.m SLCC2755和霍亂弧菌V.c MM-43的混合菌體同時(shí)雜交探針Lm-16S-2和Vib-16S-1。結(jié)果表明：被探針Lm-16S-2雜交后的單增李斯特菌可在L5檢測(cè)通道上觀察到綠色熒光（圖4A）；被探針Vib-16S-1雜交后的霍亂弧菌可在Y3檢測(cè)通道上觀察到紅色熒光（圖4B）。

此外，本實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照均未被檢測(cè)到目標(biāo)菌的熒光圖像（圖略）。

2.3 2種菌液的體積比例對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

上述檢測(cè)都是在2種菌液體積比接近1∶1的理想條件下進(jìn)行的，而在實(shí)際情況下，同步檢測(cè)時(shí)可能2種菌的含量會(huì)有差異。因此，在上述檢測(cè)條件不變的情況下，比較了2種菌液在不同體積比例下雙色探針同步雜交檢測(cè)的結(jié)果，如表4所示：在3∶7或7∶3的比例下，可同步雙通道檢測(cè)2種菌；當(dāng)比例為1∶9或9∶1時(shí)，量少的菌則明顯在視野中減少，亮度明顯減弱；當(dāng)比例為1∶19或19∶1時(shí)，量少的菌則在視野中很難被檢測(cè)到。

表4 L.mSLCC2755和V.c MM-43菌液體積比例對(duì)雙重PNA探針雜交結(jié)果的影響Table4 Effect of the volume ratio of L.m SLCC2755 and V.c MM-43 on the dual PNAprobe hybridization results

3 討論

我們將2種菌單獨(dú)雜交時(shí)的最優(yōu)化程序（2種優(yōu)化后雜交程序相似度高）直接用到雙重雜交上，結(jié)果顯示，若2種菌含量相似，則該優(yōu)化程序可直接應(yīng)用。但當(dāng)2種菌的含量差異較大時(shí)，量少的菌就會(huì)存在漏檢，原因在于：一是由于菌液在玻片上固定后，還要經(jīng)過乙醇浸泡的步驟，該步驟會(huì)使固定不牢的菌脫落而導(dǎo)致漏檢；二是量少的菌受到量大的菌的干擾，影響探針的雜交而導(dǎo)致漏檢。原本計(jì)劃通過雜交程序的優(yōu)化減少漏檢的可能，但在實(shí)際檢測(cè)中，某個(gè)樣本很少會(huì)同時(shí)感染單增李斯特菌和弧菌。但即便同時(shí)存在，在雙重檢測(cè)中，樣本分成兩部分同時(shí)進(jìn)行針對(duì)李斯特菌和弧菌的不同增菌處理，也可避免因某種菌菌量過低而導(dǎo)致的漏檢。

在單重?zé)晒鈾z測(cè)時(shí)，檢測(cè)通道I3和N21可完全滿足檢測(cè)的需求。但在多重?zé)晒馔瑫r(shí)檢測(cè)時(shí)，由于熒光通道間的干擾，會(huì)造成假陽性，因此我們引入了L5和Y3新的熒光檢測(cè)通道。L5（512～542 nm）和 Y3（575～645 nm）的濾光區(qū)間較 I3（450～490 nm）和N21（515～560 nm）的濾光區(qū)間間隔大些，因此可更有效地屏蔽一些熒光干擾。

SHEPARD等[18]研究表明，用普通熒光顯微鏡及雙色熒光標(biāo)記PNA探針，應(yīng)用PNA-FISH法可同步檢測(cè)白念珠菌（Candida albicans）和光滑念珠菌（Candida glabrata）。MORGAN等[19]研究表明，用普通熒光顯微鏡可對(duì)大腸埃希菌（Escherchia coli）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aerugionsa）進(jìn)行雙重?zé)晒鈾z測(cè)。但上述實(shí)驗(yàn)并沒有說明用的是什么型號(hào)的熒光顯微鏡，只顯示所使用的熒光顯微鏡配有異硫氰酸熒光素/德克薩斯紅雙通帶濾鏡（fluorescence microscope equipped with a fluorescein isothiocyanate(FITC)/Texas Red(TXR)dual bandpass filter）。由此推測(cè)，他們所標(biāo)記的熒光應(yīng)該是FITC和TXR，但實(shí)際并沒有以這2種熒光的名字命名的濾光模塊，說明他們使用的可能只是能濾過這2種熒光的濾光模塊。而在結(jié)果及分析中也未提及這2種熒光間是否會(huì)存在干擾。我們發(fā)現(xiàn)，染料FITC（發(fā)射波長(zhǎng)520 nm）和TXR（615 nm）的最大發(fā)射波長(zhǎng)的差異較本研究選擇的FAM（522 nm）和Cy3（570 nm）大，這也有助于減少2種熒光間的干擾，在后續(xù)研究中，可嘗試用TXR替換Cy3。DELLA-LATTA等[20]使用Traffic Light PNA FISH試劑盒同步檢測(cè)了3種微生物，檢測(cè)結(jié)果以綠紅黃三色分別表示大腸埃希菌（E.coli）、銅綠假單胞菌（P.aerugionsa）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）?？赡苡捎谑褂玫氖窃噭┖?，因此DELLA-LATTA等[20]并未說明探針標(biāo)記的是什么熒光，只是說明檢測(cè)所使用的熒光顯微鏡配有異硫氰酸熒光素/德克薩斯紅雙通帶濾鏡。而在實(shí)際檢測(cè)中若各種菌的形態(tài)相近，則各種標(biāo)記熒光和熒光濾光模塊的選擇就非常重要，否則很容易由于熒光通道間的干擾造成假陽性。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，普通熒光顯微鏡也可以用作多重PNA-FISH的檢測(cè)，但受熒光通道等的限制，三重檢測(cè)會(huì)較困難，但可以完成雙重?zé)晒鈾z測(cè)。