張重慶, 孫夕林, 吳麗娜,劉楊, 申寶忠

PET/CT作為分子影像技術之一，能夠在活體實現(xiàn)對組織、細胞及分子水平的代謝和功能狀態(tài)的顯像；這不僅能夠揭示疾病的分子事件進行疾病的早期診斷，而且在新藥研發(fā)和個體化治療療效監(jiān)測方面有著巨大的應用潛能。因此，高特異性、高親和力探針的開發(fā)和應用成為分子影像學的重點研究內容之一。

眾所周知，在PET/CT分子顯像的實踐中，最為關鍵的是基于正電子核素的放射性探針的構建。在放化探針的研發(fā)中，因18F具有理想的半衰期(109.8 min)，易于引入化合物形成穩(wěn)定的化學鍵以及高正電子豐度(β+>97%)等優(yōu)勢，成為放射性藥物的研究熱點[1]。

目前常規(guī)的18F標記探針的標記方法，主要包括親核取代、親電取代、點擊化學反應及通過輔基間接標記等方法[2]。研發(fā)新的標記方法，構建出性能優(yōu)異的探針，對于揭示疾病的發(fā)病機制和早期篩查有重要的臨床轉化意義。利用放射性核素標記生物大分子時，在相對溫和的反應條件下得到高放化產(chǎn)率(radiochemical yeild，RCY)的藥物一直是一個難題。在這種情況下，幾種非碳元素(如硅、鋁、硼)直接結合到生物分子中作為18F放射性標記的氟化物結合位點，引起了分子影像學界放化學家的極大關注，基于同位素交換(isotope exchange,IEX)的標記方法也應運而生[3]。例如，Schirrmacher等[4]應用氟硅化合物先偶聯(lián)生物分子后，利用18F-19F IEX的原理一步標記得到放射性產(chǎn)物。2005年Ting等[5]則開發(fā)了一種利用芳香三氟硼酸鹽進行生物分子標記的方法，實現(xiàn)了利用氟硼化合物標記生物分子以進行分子靶向成像；隨后，該團隊進一步研究，基于同位素交換的原理，開發(fā)了一類新型的兩性放射合成子(radiosynthon)，其典型代表是N-烷基胺甲基三氟硼酸鹽(ammonimethyltrifluoroborate,AMBF3)[6]，利用該合成子及其類似物，成功標記了多種生物分子和功能片段，合成的一些探針表現(xiàn)出優(yōu)秀的在體分布性能，本文就目前該標記方法和應用研究進展進行綜述。

基于同位素交換利用AMBF3標記的方法與優(yōu)勢

1.利用放射性合成子AMBF3的標記方法

該標記方法主要分為三步：①放射性合成子AMBF3的合成。 AMBF3合成子可以先通過N，N-二甲基炔丙基胺與碘代甲基硼酸頻哪醇酯 (iodomethylboronyl pinacolate)發(fā)生烷基化反應，得到的中間產(chǎn)物在與氟氫化鉀在酸性溶液和45℃的條件下反應兩小時經(jīng)氨水淬滅得到放射性合成子AMBF3[7]。 ②生物分子與放射合成子的偶聯(lián)。其主要原理是通過該合成子一端炔基結構與含有疊氮結構的目標生物分子在銅催化下的點擊化學反應(copper-Catalyzed click reaction,CuAAC)合成生物偶聯(lián)綴合物。非肽類的疊氮化功能分子易從商業(yè)來源獲得，可以直接與放射合成子進行偶聯(lián)。對肽類生物分子進行偶聯(lián)前，則需先在肽的N端偶聯(lián)疊氮結構。其主要步驟為：在N-甲基-2-吡咯烷酮中使用過量的溴乙酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯(bromoaceric acide- N-Hydroxysuccinimide easter,NHS ester)在室溫下將溴乙酸NHS酯偶聯(lián)至肽序列的N端；通過將肽與過量的疊氮化鈉一起孵育，用疊氮化物置換由步驟1得到的連接肽的末端溴化物，分離純化后即可進行與放射合成子偶聯(lián)。③18F-19F同位素交換兩步。 合成該生物分子偶聯(lián)物后，通過18F-19F IEX在pH值為2.0～2.5的條件下(鄰二氮雜苯-鹽酸緩沖液配置)，反應20min后即可完成18F標記,然后在氨水淬滅后，通過C18 light固相萃取柱進行分離。短時間內即可獲得高比活度(>3Ci/mmol)、高純度(>98%)及較高放化產(chǎn)率(RCY>20%～40%，n>20)的放射性產(chǎn)物(圖1)。

圖1 利用放射性合成子AMBF3的標記流程

2.利用AMBF3進行放化標記的優(yōu)勢

由于氟元素特殊的化學性質，常規(guī)的18F標記多需要進行共沸干燥，然后在有機溶劑中進行反應，且反應條件較為苛刻。而上述標記策略能夠實現(xiàn)在水性條件下進行標記，無需干燥步驟。同時，該方法分離提純手段簡單，進一步縮短了標記時間，在一定程度上間接提高了合成產(chǎn)率。除此之外，該標記策略所引入的化學基團分子量較小，對于生物大分子或功能片段的影響較小?？偨Y該方法的主要優(yōu)勢包括：①水性條件下一步法進行放射性標記；②無須對18F-進行干燥，縮短了標記時間；③無需進行HPLC分離純化，合成步驟簡單；④基于不同類型的生物分子進行標記可完成PET活體顯像，適于推廣應用；⑤有同時標記多個功能片段或生物分子的潛能；⑥能獲得較好的放射化學產(chǎn)率(RCY>25%)和高比活度(>3Ci/mmol)；⑦引入的標記基團分子量較小，對生物分子性能的影響較小[8]。

利用AMBF3標記生物分子在腫瘤分子顯像中的應用

1.18F-AmBF3-MJ9靶向胃泌素肽受體顯像在前列腺癌中的應用

胃泌素釋放肽受體(gastrin-releasing peptide receptor，GRPR)是一種G蛋白偶聯(lián)家族受體，通過與配體結合活化而發(fā)揮作用，與多種腫瘤如前列腺癌、乳腺癌等的發(fā)生、增殖、血管形成和侵襲密切相關。蛙皮素(Bombesin，BBN)是從一種兩棲動物中提取的多肽，與哺乳動物內源性胃泌素釋放肽(gastric-releasing peptide,GRP)有相似的保守C 端，可以與胃泌素肽受體特異性結合。因此，研究人員利用多種正電子核素如64Cu、68Ga、18F對蛙皮素及其類似物進行標記，以實現(xiàn)對胃泌素釋放肽受體這一靶點進行成像，從而對早期前列腺癌的診斷提供幫助[9]。

最近的研究發(fā)現(xiàn)，一些多肽類蛙皮素拮抗劑如RM26等，經(jīng)放射性標記后對GRPR有更高的親和性，有助于提高探針對前列腺癌腫瘤細胞的靶向[10]。因此，基于之前報道的利用放射性合成子AMBF3標記多肽的方法，Pourghiasian等[11]標記了一種GRPR拮抗劑18F-AmBF3-MJ9 并進行前列腺癌荷瘤鼠的顯像。其中AmBF3-MJ9是通過銅催化的點擊反應，并通過氨基甲基-三氟硼酸鹽(AmBF3)共軛炔和含疊氮結構的MJ9制備，與GRPR具有良好的結合親和力(Ki=0.5±0.1nM)。隨后通過簡單的一步法18F-19F同位素交換反應進行標記，在25min內完成標記，所得探針18F-AmBF3-MJ9基本參數(shù)為：放化產(chǎn)率(RCY)=(23±5)%(n = 3)，放化純度>99%，比活度為(100±32)GBq/mmol)。

GRPR陽性腫瘤細胞PC3荷瘤鼠離體分布實驗證明，探針在腫瘤、胰腺、小腸有高攝取，在注射探針兩小時后攝取值(每克組織注射劑量百分比)分別為2.20±0.13、 4.75±2.36和8.67±11.5(%ID/g)。腫瘤與肌肉的攝取比值隨時間延長明顯增加，在注射探針后2h腫瘤與肌肉的攝取比值可達77±7。此外，使用GRPR拮抗劑進行阻斷后顯像，腫瘤的攝取可以阻斷60%；同樣說明了該探針能與GRPR特異性結合。在體成像和生物分布實驗得出一致的結果。通過該標記方法，成功實現(xiàn)了GRPR受體靶向探針的一步法放射性標記，獲得較高放化產(chǎn)率和放化純度的探針，其腫瘤與本底的高攝取比，也為實現(xiàn)靶向GRPR顯像提供了可能(圖2a、2b)。

2. 18F-AMBF3-TATE靶向生長抑素受體顯像在神經(jīng)內分泌腫瘤中的應用

生長抑素受體(somatostatin receptor,SSTR)是一種G蛋白偶聯(lián)家族受體，具有典型的7-跨膜結構域。已被發(fā)現(xiàn)的五種不同的亞型中(SSTR 1～5)，SSTR2對生長抑素(SST)及其類似物親和力最高。而大多數(shù)神經(jīng)內分泌腫瘤(neuroendocrine tumors,NETs)具有高表達水平的SSTR，這為實現(xiàn)神經(jīng)內分泌腫瘤分子顯像提供了理論基礎。

圖2 利用同位素交換合成探針18F-AmBF3-MJ9和18F-AMBF3-TATE荷瘤鼠成像圖[11,15]?；叶戎狄訧D%/g為準；a～b) 注射劑量百分比范圍為0～3 ID%/g； c～d) 為0～15 ID%/g。T：腫瘤；I：小腸；K：腎臟。a) 18F-AmBF3-MJ9靶向前列腺癌PC3荷瘤鼠成像； b) 100 ug of BAY86-7548阻斷后18F-AmBF3-MJ9前列腺癌PC3荷瘤鼠成像； c)18F-AMBF3-TATE 靶向生長抑素受體陽性AR42J細胞荷瘤鼠成像；d) 阻斷SSTR2后，18F-AMBF3-TATE荷瘤鼠成像。

近30年來，放化學家已經(jīng)開發(fā)了許多靶向SSTR2的分子影像探針，以用于NETs的診斷、分期，甚至標記治療性核素以完成分子靶向治療[12]。在這些針對靶向SSTR2受體的生物分子中，特別是標記奧曲肽(Octreotate)及其衍生物(Tyr3-Octreotate,TOC、Tyr3-Thr8-Octreotate,TATE)的多種探針，已經(jīng)用于靶向神經(jīng)內分泌腫瘤SSTR2的無創(chuàng)成像。如111In-pentetreotide(商品名Octreoscan,Mallinckrodt公司)已被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準用于臨床，目前已成為神經(jīng)內分泌腫瘤的臨床診斷標準之一[13]；而68Ga標記奧曲肽的衍生物的探針如68Ga-DOTATOC、68Ga-DOTATATE和68Ga-DOTANOC等，同樣顯示了對神經(jīng)內分泌腫瘤的高親和性和巨大潛能[14]。但是由于111In為單光子顯像劑，68Ga標記的藥品尚未批準用于臨床，但18F標記奧曲肽及其衍生物仍具有重要的研究價值。

2014年，Liu等[15]利用AMBF3成功標記了奧曲肽的衍生物得到了高親和力的探針18F-AMBF3-TATE，未經(jīng)衰減矯正的放化產(chǎn)率(RCY)為20%～25%。體外實驗顯示18F-AMBF3-TATE針對于SSTR2受體比68Ga-DOTATATE有更好的親和力[Ki分別為(0.136±0.03) nM和(0.76±0.2) nM]；與SSTR其它亞型的親和力較低或不結合，顯示其具有較好的特異性。SSTR2陽性荷瘤鼠(AR42J)注藥后1h行PET顯像，腫瘤組織表現(xiàn)為明顯攝取(腫瘤每克組織百分注射劑量率)，均值為(10.26±2.1)%ID/g，最大值為(23.6±3.0)%ID/g，競爭抑制劑阻斷后攝取明顯減低。相反，血池和肌肉中的平均攝取分別為(0.40±0.31)%ID/g和(0.11±0.03) %ID/g。離體生物分布實驗和成像結果一致，腫瘤攝取百分比可達(10.11±1.67)%ID/g。動物顯像和離體實驗都顯示該探針主要經(jīng)腎臟代謝，而且非特異性結合清除迅速，肝膽攝取低，骨吸收未見顯示，探針結構穩(wěn)定。

將18F-AMBF3-TATE與現(xiàn)有的十多種標記奧曲肽及其衍生物的探針進行對比，發(fā)現(xiàn)該探針的腫瘤特異性攝取值最高。尤其是與標記相同生物分子的探針68Ga-DOTATATE相比，該探針的腫瘤特異性攝取是其5倍以上。該結果表明該合成方法對于提高多肽的親和力方面有明顯優(yōu)勢，應用這種標記方法可能對其他肽類示蹤劑的研發(fā)具有重大研究價值。其高親和力和靶向性，也為進入臨床應用研究提供了可能(圖2c、2d)。

AMBF3及其衍生物在多功能分子影像探針構建中的應用

在分子影像領域，多模態(tài)、多功能成像因其能夠提供多方面的信息而備受關注。因此，熒光/PET雙功能探針的優(yōu)勢是十分明顯的，構建此探針可以通過在體和離體兩種途徑定量分析同一生物分子探針濃度，這不僅可以通過PET顯像為術前診斷與分期、術后療效監(jiān)測提供幫助，更為離體組織病理學或熒光引導手術提供了可能。該標記策略，為成功標記熒光/PET雙功能探針，多途徑成像的實現(xiàn)提供了基礎。

血管生成在腫瘤生長和轉移過程起到了至關重要的作用，靶向腫瘤新生血管的診斷和治療成為研究的熱點[16]。整合素αVβ3作為細胞黏附因子家族的重要成員，通過調節(jié)內皮細胞的黏附、遷移、增殖、凋亡等功能，在腫瘤血管生成的過程中發(fā)揮重要作用[17]。1984年由Ruoslahti等[18]首先報道了含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)序列的多肽RGD，其能被整合素αVβ3的α鏈的胞外段識別，成為靶向血管生成成像的重要生物分子。

圖3 利用同位素交換合成雙模態(tài)探針的示意圖及應用[22]。a) 熒光、核素雙標記模式圖； b) Rhodamine-[cRGD]2-[18F]-Organotrifluoroborate探針PET荷瘤鼠在體成像； c) 離體組織熒光成像。

整合素αVβ3在腦膠質瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤細胞表面中均有異常高表達，正常細胞表達程度低甚至不表達?；赗GD肽或其修飾后的標記物，在靶向αVβ3整合素的成像中廣泛應用。隨后放化學家對RGD肽進行了結構的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)與線性RGD肽相比，環(huán)形結構的RGD肽(Circle RGD,cRGD)更穩(wěn)定,具有更好的親和力和特異性。 而針對cRGD,研究者又進行了二聚化、多聚化以增加親和力，增加修飾基團以改善性能，引入雙功能螯合劑(HYNIC、DOTA、DTPA等)以適應多種標記策略等多方面的嘗試。

2013年，Li等[19]在基于同位素交換的原理下，利用一種放射性合成子18F芳基三氟硼酸根陰離子(18F-ArBF3-)成功標記二聚體環(huán)形RGD，從而得到探針[c(RGDfK)]2E-18F-ArBF3 ，并且和幾種18F標記方法進行了初步比較，在放化產(chǎn)率方面，該方法與通過NOTA-bisRGD的一步18F-Al螯合合成18F-Al-NOTA-bisRGD的合成效率一致，放化產(chǎn)率(RCY)為5%～25%[20]；高于利用輔基進行18F兩步法標記的放化產(chǎn)率(RCY=7%～12%)[21]。[c(RGDfK)]2E-18F-ArBF3在體成像和離體生物分布實驗均顯示出探針在高表達整合素αVβ3的荷瘤鼠(U87M)腫瘤組織中具有高特異性攝取(Tumer/Muscle>6;Tumer/Blood>9)，而骨的攝取值不到0.5%ID/g。

2014年，Liu等[22]利用該放射合成子標記的經(jīng)驗，在前述基礎上進一步推進，開發(fā)出一種熒光/PET雙功能探針Rhodamine-[cRGD]2-[18F]-Organotrifluoroborate，這對于實現(xiàn)多模態(tài)、多手段成像以便于疾病的早期診斷有著重要意義。該探針前體的合成包括三步：首先在季戊四醇核心的一條側鏈上連接合成子AMBF3，然后在剩余三條側鏈上連接炔基結構，最后通過點擊化學與三條側鏈上炔基發(fā)生環(huán)加成反應偶聯(lián)一個有機熒光劑羅丹明和兩個環(huán)狀結構RGD。合成前體后，通過同位素交換的方法完成18F標記。利用標記的正電子核素進行高分辨的PET顯像，顯示出該探針具有較高的特異性(2.5～5.5 %ID/g)，離體生物分布實驗也得到了一致結果(2.9～3.8 %ID/g)。同時標記的羅丹明熒光染料，則利用其較高的摩爾消光系數(shù)，易通過點擊化學反應與生物分子發(fā)生共軛，同時具有生物相容性好、在體內穩(wěn)定等優(yōu)良的光學、化學、生物學特征[23]。因此，離體組織熒光現(xiàn)象也得到了較好的成像效果，腫瘤組織與肝腎對比有明顯熒光(圖3)。

此外，本標記方法已經(jīng)在針對多種靶點的探針開發(fā)中進行了廣泛而有益的探索。例如Lau等[24]利用該方法，將AMBF3與磺胺類衍生物偶聯(lián)后進行18F標記， 制備了對含碳的脫水酶-IX(CA-IX) 靶點成像的分子影像探針。Zhang等[25]利用該標記方法，將AMBF3與三苯基磷及其衍生物偶聯(lián)，完成18F標記后成功進行了心肌灌注顯像。Li等[26]同樣利用該方法成功地將18F-ArBF3與綴合磷32P的寡核苷酸進行偶聯(lián)，得到了雙標記的寡核苷酸，拓寬了該方法的應用范圍。

基于18F-19F同位素交換的原理，利用AMBF3及其衍生物，成功實現(xiàn)了對生物大分子及少數(shù)小分子有機物的放化標記，同時也為多功能分子影像探針的構建搭建了一個平臺。而且該方法標記過程相對簡便易行，用時較短，一定程度上彌補了反應效率的不足。因而基于18F-19F同位素交換并利用該合成子標記的方法得到了廣泛的應用。這些探針的開發(fā)，成功實現(xiàn)了針對多種靶點、多功能的分子成像，部分探針更是展現(xiàn)出了巨大的臨床應用潛能?？傊?，隨著該方法成功標記的生物分子或功能基團的多種探針的不斷開發(fā)和廣泛應用，基于18F-19F同位素交換原理并利用AMBF3及其類似物進行探針標記的策略將在分子影像學中發(fā)揮更大的作用。