張付春，楊 堅，潘明啟，郭春苗，鐘海霞，周曉明，王 敏

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝作物研究所/農(nóng)業(yè)部新疆地區(qū)果樹科學(xué)觀測試驗站， 烏魯木齊 830091; 2. 昌吉州林業(yè)局，新疆昌吉 831100)

葡萄中含有大量具有保健作用的生理活性物質(zhì)，目前，已明確其生理活性效果大多與單寧類化合物相關(guān)[1-2]。新疆是中國最大的葡萄產(chǎn)區(qū)，截至2016年底，釀酒葡萄栽培面積達到3.73萬hm2，由于受新疆氣候、水土等因素影響，新疆產(chǎn)區(qū)釀酒葡萄果實單寧化合物含量偏低，難以滿足優(yōu)質(zhì)葡萄酒生產(chǎn)要求，單寧含量偏低成為影響新疆產(chǎn)區(qū)釀酒葡萄品質(zhì)的主要指標(biāo)之一，因此，新疆產(chǎn)區(qū)釀酒葡萄果實單寧的調(diào)控亟待研究。研究表明，砧木影響葡萄果實酚類物質(zhì)以及相關(guān)酶活性，對接穗果實花青素、黃酮醇、黃烷-3-醇、原花青素、對稱二苯代乙烯、羥基肉桂酸和對羥基酸均能產(chǎn)生影響[3]，對PAL(苯丙氨酸氨解酶)、CHI(查爾酮異構(gòu)酶)、UFGT(類黃酮葡糖苷轉(zhuǎn)移酶)3個酶活性產(chǎn)生影響[4]，選用砧木嫁接栽培葡萄已逐漸受到國內(nèi)重視，已有研究表明砧木對葡萄果實單寧合成和積累具有明顯的調(diào)控作用[5]。

隱色花色素還原酶(Leucoanthocyanidin reductase，LAR)專一性催化 2R、3S、4S-黃烷-3，4-二醇還原生成 2R、3S-黃烷-3-醇[6]，與花色素合成酶(ANS)、花色素還原酶(ANR)共同啟動葡萄果實原花色素(Proanthocyanidins)的生物合成[7]，是葡萄果實單寧生物合成的關(guān)鍵酶之一。而包括隱色花色素還原酶在內(nèi)的所有參與生化反應(yīng)的酶的合成、活性調(diào)節(jié)都是由基因控制的[8]。研究表明，葡萄果實中多酚類物質(zhì)生物合成和積累受環(huán)境條件調(diào)控[9]，如溫度[10]、紫外線[11-13]、水分[14-17]等。但遺憾的是，有關(guān)砧木嫁接對葡萄果實原花色素生物合成和積累的作用鮮見報道，特別是砧木對隱色花色素還原酶時空積累的影響尚未見報道。

本試驗以‘赤霞珠’(VitisviniferaL. cv. ‘Cabernet Sauvignon’)嫁接苗和自根苗果實為試材，用Trizol法，對果皮和果肉RNA進行提取和純化，利用RT-PCR技術(shù)對果實隱色花色素還原酶(LAR)轉(zhuǎn)錄水平進行研究。闡明砧木對葡萄果實隱色花色素還原酶在果實中的分布、活性及原花色素時空積累的作用，揭示葡萄果實中該隱色花色素還原酶基因表達規(guī)律及砧木對其表達的影響，對于明確嫁接對葡萄果實品質(zhì)及葡萄酒風(fēng)味影響的生理和分子機制具有重要意義，同時為篩選優(yōu)良葡萄砧木，進一步調(diào)控葡萄果實中原花色素含量、提高釀酒原料和葡萄酒品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 田間處理和樣株的選擇

試驗在新疆農(nóng)科院安寧渠試驗場進行，選擇抗寒砧木品種3個：‘5BB’(法國，冬葡萄與河岸葡萄的自然雜交后代)、‘101-14MG’(法國，美洲種群內(nèi)種間雜交種)和‘SO4’(德國，冬葡萄和河岸葡萄雜交后代)，接穗品種：‘赤霞珠’(VitisviniferaL.cv ‘Cabernet Sauvignon’)；砧木于2011年5月定植，2012年5月下旬嫁接，2013年開始結(jié)果。砧穗組合處理：‘5BB’/‘赤霞珠’‘101-14MG’/‘赤霞珠’‘SO4’/‘赤霞珠’和‘赤霞珠’自根苗；選擇管理方法、土壤和灌水條件以及砧穗生長勢一致的植株，標(biāo)記株號，每處理選擇10株。

1.2 果實樣品的采集和保存

分別于果實膨大期(花后40 d)、轉(zhuǎn)色期(花后70 d)和成熟期(花后90 d、100 d)采樣，共取樣4次。選取生長基本一致的5～10株做為1個區(qū)組，共設(shè)3個區(qū)組。從每一區(qū)組中選取結(jié)果枝生長健壯、一致，果穗大小一致、著生方向相同的10～20個果穗，選取大小基本一致的外圍無明顯傷害、病蟲害果實100粒，分離果皮和果肉后，液氮速凍，-70 ℃保存，備用。

1.3 果實理化指標(biāo)的測定

花后40 d、70 d、90 d和100 d調(diào)查果果粒質(zhì)量；觀察并記錄果實轉(zhuǎn)色時間；果實成熟期稱果粒質(zhì)量，測量果蒂長度和粗度；通過排水法測定果穗體積和果粒體積，計算果穗松散度(果穗松散度=果穗體積/果粒體積)；秋季修剪時采集1 a生枝條第3節(jié)，測定枝條N、P、K、Zn、Cu、Fe、Mn質(zhì)量分數(shù)。果實隱色花色素還原酶(LAR)活性參照溫鵬飛等[18]的方法測定。

1.4 隱色花色素還原酶基因表達分析

按照Trizol一步法提取果皮和果肉中的總RNA，根據(jù)Gene Bank中葡萄LAR全長序列，利用Primer 5.0設(shè)計PCR擴增引物，由生物工程公司合成。以M-MLV為反轉(zhuǎn)錄酶，將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。葡萄果實總RNA提取參照溫鵬飛[19]方法進行，LAR基因表達分析采用Real-time PCR 法，參照Trans Script Ⅱ Green Two-Step qRT-PCR Super Mix 試劑盒操作說明進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同砧木對‘赤霞珠’枝條礦質(zhì)元素質(zhì)量分數(shù)的影響

‘5BB’‘SO4’和‘101-14MG’均增加了枝條N素質(zhì)量分數(shù)，‘5BB’較自根苗差異顯著，分別為5.8 g/kg和3.4 g/kg，說明‘5BB’促進了N素的吸收，N作為大量元素是化肥的主要成分之一，‘5BB’砧木的利用對減少化肥使用有一定的實踐意義；‘SO4’增加了‘赤霞珠’枝條P素質(zhì)量分數(shù)，‘101-14MG’增加了‘赤霞珠’枝條K素質(zhì)量分數(shù)；‘5BB’‘SO4’和‘101-14MG’降低了Fe元素質(zhì)量分數(shù)，‘101-14MG’使枝條Mn元素質(zhì)量分數(shù)上升，說明其促進了Mn元素的吸收(圖1)。

Cs-1.赤霞珠9/5BB Cabernet Sauvignon 9 /5BB；Cs-2.赤霞珠9/SO4 Cabernet Sauvignon 9 /SO4；Cs-3.赤霞珠9/101-14MG Cabernet Sauvignon 9 /101-14MG；Cs-4.赤霞珠9自根苗 Cabernet Sauvignon 9 seedling；下同 The same below

圖1‘赤霞珠9’砧穗組合枝條礦質(zhì)元素質(zhì)量分數(shù)
Fig.1Massfractionofmineralelementsin‘CabernetSauvignon’grapebranchesofanvilscioncombination

2.2 不同砧木對‘赤霞珠9’果實品質(zhì)的影響

砧木‘5BB’‘SO4’嫁接‘赤霞珠’，增大了‘赤霞珠’葡萄果粒，‘5BB’使‘赤霞珠’果粒質(zhì)量增加0.39 g，‘SO4’使‘赤霞珠’果粒質(zhì)量增加0.34 g，‘101-14MG’使‘赤霞珠’果粒質(zhì)量增加0.26 g(圖2)；‘5BB’嫁接‘赤霞珠’在盛花后40 d轉(zhuǎn)色，使‘赤霞珠’葡萄提前8 d轉(zhuǎn)色，‘SO4’使‘赤霞珠’葡萄提前6 d轉(zhuǎn)色，‘101-14MG’使‘赤霞珠’葡萄提前4 d轉(zhuǎn)色(圖2)；‘SO4’在增大‘赤霞珠’果粒的同時，拉長了果蒂長度，‘5BB’和‘101-14MG’對果蒂長度無明顯影響(圖3)，‘SO4’和‘5BB’增加了‘赤霞珠’果實果蒂粗度，‘101-14MG’略降低了果蒂粗度(圖3)，‘SO4’降低了‘赤霞珠’果穗緊實程度，增加了果穗松散度(圖3)。

圖2 ‘赤霞珠9’砧穗組合果粒質(zhì)量及轉(zhuǎn)色時間變化Fig.2 Change of fruit mass and time of coloring of anvil scion combination

圖3 ‘赤霞珠9’砧穗組合果蒂發(fā)育情況及果穗松散度Fig.3 Development of pedicel and loose degree of berry of anvil scion combination

2.3 不同砧木對‘赤霞珠9’ LAR活性的影響

由圖4可知，在‘赤霞珠’整個果實發(fā)育期，各處理LAR活性呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，這與溫鵬飛[19]研究結(jié)果一致。在花后40 d、70 d、90 d和100 d 4個果實發(fā)育階段，‘101-14MG’和‘SO4’嫁接‘赤霞珠’LAR活性始終大于‘赤霞珠’自根苗果實，‘5BB’在花后40 d和70 d，LAR活性與‘赤霞珠’自根苗LAR活性差異不大，花后90 d開始，LAR低于‘赤霞珠’自根苗果實，在花后100 d時，‘101-14MG’嫁接‘赤霞珠’LAR活性最強，其次分別是‘赤霞珠’/‘SO4’和‘赤霞珠’自根苗，‘赤霞珠’/‘5BB’LAR活性最低(圖4)。

2.4 不同砧木對‘赤霞珠9’ LAR基因表達的影響

由圖5可以看出，花后40 d、70 d、90 d和100 d不同發(fā)育階段，果皮和果肉中LAR相對表達量總體呈現(xiàn)下降趨勢，果肉中LAR相對表達量極小，果皮中LAR表達量顯著高于果肉(圖5)；花后40 d，‘101-14MG’嫁接‘赤霞珠’果實果皮中LAR相對表達量最大，其次是‘SO4’嫁接‘赤霞珠’，‘5BB’嫁接‘赤霞珠’和‘赤霞珠’自根苗LAR相對表達量差異不顯著，隨著果實的不斷發(fā)育，4個處理間果皮中LAR相對表達量差異逐漸縮小；果肉中LAR相對表達量以‘101-14MG’嫁接‘赤霞珠’最大，并在40 d、70 d、90 d和100 d均顯著高于其他3個處理，其次是‘SO4’嫁接‘赤霞珠’，‘5BB’嫁接‘赤霞珠’果肉LAR相對表達量略低于‘赤霞珠’自根苗，總體看，‘101-14MG’和‘SO4’嫁接‘赤霞珠’果皮和果肉中LAR相對表達量均大于‘赤霞珠’自根苗和‘5BB’嫁接‘赤霞珠’，其中‘SO4’嫁接‘赤霞珠’與‘赤霞珠’自根苗果皮和果肉中LAR相對表達量差異顯著(圖6)。

圖4 不同發(fā)育期‘赤霞珠9’砧穗組合 果實LAR酶活性的變化Fig.4 Change of LAR activity of anvil scion combination during development of grape berry

圖5 不同發(fā)育期和果實不同組織LAR表達Rt PCR 分析Fig.5 Analysis of expression of LAR during ‘Cabernet Sauvignon’ berry development and different parts by Rt PCR

3 討 論

適宜的砧木利用不僅能提高接穗抗性，提高產(chǎn)量和品質(zhì)，還對應(yīng)對品種風(fēng)險，減少經(jīng)濟損失具有重要意義，選擇適宜的砧木是砧木利用取得成功的關(guān)鍵。本研究選取的3個砧木品種在國內(nèi)已有一定的使用面積，但與接穗的適宜性研究較少，本研究中砧木‘5BB’具有長勢旺盛、根系發(fā)達、入土深、耐旱、耐石灰性土壤等特點[20]，嫁接‘赤霞珠’后，使‘赤霞珠’葡萄枝條N素質(zhì)量分數(shù)提高，果粒增大；砧木‘SO4’具有長勢旺盛、根系發(fā)達、促進P素吸收等特點[20]，嫁接‘赤霞珠’后，使‘赤霞珠’葡萄枝條P素增加；砧木‘101-14MG’具有生長勢中等、根系淺、促進早熟及促進K素吸收等特點[20]，嫁接‘赤霞珠’后，對果實膨大影響不大，使‘赤霞珠’葡萄枝條K素增加。

果穗的松散度影響果穗內(nèi)部果粒的通風(fēng)透光條件，進而影響果穗內(nèi)部果粒的著色，坐果率和果粒數(shù)量不變的情況下，果蒂長度在一定程度上影響果穗的松散度，本研究中發(fā)現(xiàn)，‘SO4’砧木增大果蒂長度，果穗松散度較其他幾個處理大，尤其比自根苗果穗更松散，不但對果穗內(nèi)部果粒著色有利，而且在采后加工過程中更有利于脫梗。

圖6 砧木嫁接對赤霞珠9果實不同組織LAR表達的Rt PCR 分析Fig.6 Analysis of grafting on expression of LAR in different parts of Cabernet Sauvignon berry development and by Rt PCR

在果實隱色花色素還原酶活性方面，在發(fā)育過程中總體表現(xiàn)為下降趨勢，這與溫鵬飛等[18]的研究結(jié)果一致，本研究的4個處理中，‘101-14MG’和‘SO4’使葡萄果實隱色花色素還原酶活性增強，‘5BB’作用不明顯；葡萄隱色花色素還原酶(LAR)與苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查耳酮異構(gòu)酶(CHI)、黃烷酮-3-羥化酶(F3H)、二氫黃酮醇還原酶(DFR)、隱色花色素雙氧化酶(LDOX)等共同參與單寧的生物合成[21]，在筆者團隊前期研究中發(fā)現(xiàn)，‘101-14MG’和‘SO4’使‘赤霞珠’、梅鹿輒和霞多麗葡萄果實單寧質(zhì)量分數(shù)升高，在本研究中，‘101-14MG’和‘SO4’使葡萄果實隱色花色素還原酶活性增強。

在果實隱色花色素還原酶基因表達方面，果實發(fā)育過程中的變化與果實隱色花色素還原酶活性表現(xiàn)出相似的趨勢，即在發(fā)育過程中總體表現(xiàn)為下降趨勢。‘101-14MG’和‘SO4’使葡萄果實隱色花色素還原酶基因表達量增加。從不同組織中的表達量來看，果皮中隱色花色素還原酶基因的表達量顯著高于果肉中，與溫鵬飛等[22]的研究結(jié)果一致。果實隱色花色素還原酶基因與花青素合成酶基因是葡萄果實單寧合成的特異基因，通過對以上2個基因的調(diào)控，可以改變葡萄果實單寧質(zhì)量分數(shù)，對影響葡萄果實品質(zhì)，尤其是對改善釀酒葡萄品質(zhì)有重要意義，本研究中，‘101-14MG’可能對改善釀酒葡萄果實單寧質(zhì)量分數(shù)有積極作用。

在砧穗互作機制方面，Cookson等[23]利用轉(zhuǎn)錄組測序研究了嫁接后嫁接部位上下的基因表達變化，發(fā)現(xiàn)在3 d和28 d的大量差異基因參與細胞壁修飾、傷口、激素信號和次級代謝等途徑。Kim等[24]研究了‘康貝爾’早生葡萄(抗寒性較強)和‘巨峰’葡萄(抗寒性較差)的新梢在低溫條件下的轉(zhuǎn)錄組變化，發(fā)現(xiàn)細胞過程(Cellular processes)初級代謝過程(Primary metabolic processes)和生理調(diào)節(jié)(Biological regulation)等生物過程跟‘康貝爾’早生的抗寒性密切相關(guān)。Vilvert等[25]對葡萄砧木‘SO4’(不抗病原菌)和‘8110’(抗病原菌)接種尖胞鐮刀菌(Fusariumoxysporumf. sp.herbemontis)，以各自未接種作對照，發(fā)現(xiàn)植物防御蛋白在過程中起重要作用，其中‘8110’誘導(dǎo)產(chǎn)生了更多差異蛋白。以上研究說明高通量測序及組學(xué)分析己經(jīng)成為研究砧穗互作機制的重要手段，通過轉(zhuǎn)錄組技術(shù)開展砧木對葡萄果實品質(zhì)的影響機制是下一步研究的方向。

4 結(jié) 論

砧木嫁接對‘赤霞珠’果實發(fā)育產(chǎn)生了影響，其中砧木‘5BB’、‘SO4’嫁接‘赤霞珠’，增大‘赤霞珠’葡萄果粒，‘SO4’降低了‘赤霞珠’果穗緊實度，增加了果穗松散度，‘5BB’促進了‘赤霞珠’樹體對N素的吸收，N作為大量元素是化肥的主要成分之一，‘5BB’砧木的利用對減少化肥施用有一定的實踐意義。

‘赤霞珠’葡萄果實隱色花色素還原酶活性隨著果實的發(fā)育進程而逐漸降低，‘101-14MG’和‘SO4’嫁接‘赤霞珠’葡萄果實隱色花色素還原酶活性略高于‘赤霞珠’自根苗；果皮中隱色花色素還原酶相對表達量遠高于果肉；砧木嫁接后果實隱色花色素還原酶基因相對表達量隨著發(fā)育時期和組織部位的變化趨勢與自根苗總體相似，各砧木品種對‘赤霞珠’果實隱色花色素還原酶相對表達量有不同的影響，其中‘101-14MG’增加了果實隱色花色素還原酶基因相對表達量，其次是‘SO4’，‘5BB’對‘赤霞珠’果實果實隱色花色素還原酶基因相對表達量影響不大。

砧木的研究和利用越來越受到研究者的重視，近年來砧木品種選育工作取得了一定的進展，砧木嫁接對果實品質(zhì)的影響成為砧木新品種評價的重要指標(biāo)。