孫茂霖，孫 健，石 尚，劉化龍，鄭洪亮， 趙宏偉，謝冬微，王敬國(guó)，鄒德堂

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030; 2. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所，哈爾濱 150086)

水稻是世界上最重要的糧食作物之一。近年來(lái)，隨著市場(chǎng)對(duì)高品質(zhì)稻米需求量的提升，在保證產(chǎn)量的前提下提高水稻的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)已成為水稻育種的熱點(diǎn)[1]。維生素作為人體必須的重要營(yíng)養(yǎng)元素，是衡量水稻營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的重要指標(biāo)[2]。維生素B6(Vitamine B6, VB6)又稱吡哆素，是一種水溶性維生素，包括吡哆醇(Pyridoxine,PN)、吡哆胺(Pyridoxamine,PM)、吡哆醛(Pyridoxal,PL)及它們的磷酸衍生物。VB6參與了細(xì)胞內(nèi)的多種代謝，在生物體內(nèi)發(fā)揮著極其重要的作用[3]。有研究表明，攝取足量的VB6能有效減少心血管疾病、高血壓、癲癇、糖尿病、腎臟疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病，糙皮病等疾病的發(fā)病率[3]。VB6的輔酶形式(PLP)可通過增強(qiáng)免疫系統(tǒng)和延緩腫瘤發(fā)展而對(duì)癌癥有積極的影響[4]。還有研究表明，神經(jīng)疾病如抑郁癥、阿爾茨海默病、自閉癥，精神分裂癥、癲癇和帕金森病等均與VB6缺乏有關(guān)[5]。

植物和微生物是自然界中VB6的制造者，而動(dòng)物只能從食物中獲取VB6。水稻作為人們的主食之一，也是重要的VB6來(lái)源[6]。如果其VB6增加，人體日常VB6的吸收量就會(huì)增加，有利于身體健康。但大多數(shù)水稻品種的VB6極低，因此，選育出富含VB6的品種對(duì)于保證人體健康具有重要意義。目前，國(guó)內(nèi)外已有對(duì)影響VB6合成關(guān)鍵酶基因的報(bào)導(dǎo)，如Ehrenshaft等[7]在研究尾孢菌對(duì)自身毒素的抗性中發(fā)現(xiàn)了涉及VB6代謝的基因SOR1，后來(lái)鑒定為PDX1。隨后，該研究小組又從尾孢菌鑒定出涉及VB6合成的第2個(gè)基因PDX2[8]。Tambasco-studart等[9]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了參與VB6從頭合成途徑的4個(gè)基因，其中，有3個(gè)為PDX1的同源基因(AtPDX1.1,AtPDX1.2,AtPDX1.3)，還有1個(gè)為PDX2的同源基因(AtPDX2)。劉海峰[10]在水稻中同樣發(fā)現(xiàn)了PDX1的同源基因(OsPDX1.1,OsPDX1.2, OsPDX1.3)。

關(guān)聯(lián)分析(GWAS)是以連鎖不平衡為基礎(chǔ)，鑒定某一自然群體內(nèi)目標(biāo)性狀與分子標(biāo)記或候選基因間關(guān)系的一種分析方法[11]，在水稻和其他作物中已被廣泛應(yīng)用[12-14]。本研究以314份不同地理來(lái)源的水稻品種為材料，對(duì)其進(jìn)行連續(xù)2 a的VB6測(cè)定，利用154對(duì)SSR標(biāo)記與VB6進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，旨在挖掘與VB6相關(guān)的SSR標(biāo)記位點(diǎn)，為水稻高VB6的分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

314份水稻品種來(lái)源于黑龍江省104個(gè)、吉林省46個(gè)、遼寧省30個(gè)、日本92個(gè)、韓國(guó)19個(gè)、朝鮮11個(gè)、俄羅斯7個(gè)、法國(guó)3個(gè)、美國(guó)2個(gè)。分別于2016、2017年種植于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)基地，4月中旬播種，5月中旬移栽，試驗(yàn)地設(shè)計(jì)為行長(zhǎng)3 m，雙行區(qū)，行距30 cm，穴距10 cm，3次重復(fù)，水肥病蟲害管理同一般大田管理。

1.2 VB6質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

水稻成熟收獲后，種子經(jīng)過3個(gè)月的自然風(fēng)干，使其生理生化性狀穩(wěn)定。用糙米機(jī)將種子研磨成糙米，將糙米研磨成粉，過60目篩，采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的VB6測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品的VB6質(zhì)量分?jǐn)?shù)。其原理為VB6與4-氨基安替比林在強(qiáng)氧化劑作用下生成穩(wěn)定的黃色化合物，在390 nm有特定吸收峰。記錄在390 nm的波長(zhǎng)下的吸光值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到樣本總VB6質(zhì)量分?jǐn)?shù)。對(duì)每個(gè)樣品測(cè)定3次，取平均值。

1.3 SSR標(biāo)記分析

采用簡(jiǎn)化的CTAB法[15]進(jìn)行DNA提取。選取于水稻12條染色體上均勻分布的1 000對(duì)SSR標(biāo)記，由上海生工生物工程有限公司合成。篩選出具有多態(tài)性的154對(duì)SSR引物對(duì)314份品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

擴(kuò)增體系包括3 μL的模板DNA(25 ng/μL)，2μL SSR引物(12 ng/μL)，2 μL PCR緩沖液，1.5 μL MgCl2(25 mmol/L)，0.3 μLTaq酶(5 U/μL)，0.2 μL dNTP(10 mmol/L)，最后加入11 μL ddH2O使總體積達(dá)到20 μL。

PCR程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性6 min；38個(gè)循環(huán)(94 ℃下變性30 s，47 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸30 s)；72 ℃下延伸5 min，4 ℃下保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠上電泳及銀染法檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007軟件對(duì)VB6質(zhì)量分?jǐn)?shù)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行基本統(tǒng)計(jì)分析。

用STRUCTURE 2.3.4軟件進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析[12]，估計(jì)最佳群體K，其取值范圍為2～8，參數(shù)iterations設(shè)為100 000，burn-in period設(shè)為1 000 000，每個(gè)K值重復(fù)運(yùn)行5次。依據(jù)似然值最大的原則選取合適的K值作為群體數(shù)目，若對(duì)數(shù)似然值lnP(D) 隨亞群數(shù)K值的增大而增大，則采用ΔK來(lái)確定合適的K值[16-17]。

利用TASSEL 3.0軟件計(jì)算154個(gè)SSR標(biāo)記位點(diǎn)兩兩之間的D′值，用于評(píng)價(jià)供試群體的LD程度(等位基因頻率<5%的稀有等位基因作為缺失處理)。以P≤0.01時(shí)，判定位點(diǎn)之間的LD達(dá)到顯著[18]。將STRUCTURE 2.3.4軟件運(yùn)行后形成的Q值作為協(xié)變量，運(yùn)用TASSEL 3.0軟件中的GLM和MLM模型，分別進(jìn)行性狀與標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析[19]。

將2 a在2種模型中均定位到的位點(diǎn)進(jìn)行整理，以群體平均值為對(duì)照進(jìn)行優(yōu)異等位變異的挖掘，并計(jì)算優(yōu)異等位變異的表型效應(yīng)值[20]，同時(shí)篩選出具有該等位變異的優(yōu)質(zhì)品種。

2 結(jié)果與分析

2.1 VB6的變異分析

對(duì)2016與2017年測(cè)定的314個(gè)水稻品種的VB6變異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表1)，可以看出2016年品種的VB6的平均值為68.52 μg/g，變幅為39.70～127.24 μg/g，變異系數(shù)為14.78%。2017年品種的VB6的平均值為69.18 μg/g，變幅為42.95～138.48 μg/g，變異系數(shù)為15.32%。從2 a的VB6數(shù)據(jù)可知，不同品種間VB6變異范圍大，具有豐富多樣性。表2列出材料中VB6最高和最低的品種各10種，并按由高到低進(jìn)行編號(hào)，發(fā)現(xiàn)最高的10個(gè)品種的VB6均高于80 μg/g，而最低的10個(gè)品種普遍低于50 μg/g，其中，‘龍錦1號(hào)’2 a平均VB6最高達(dá)到132.86 μg/g，‘花葉稻’在所有品種中2 a平均VB6最低僅有42.56 μg/g。在VB6最低的10個(gè)品種中，‘空育131’在黑龍江省被廣泛種植，但它的VB6僅有49.67 μg/g，有極高的改良價(jià)值。

2.2 群體結(jié)構(gòu)分析

利用314個(gè)水稻品種的154個(gè)SSR標(biāo)記基因型數(shù)據(jù)，通過STRUCTURE 2.3.4軟件進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析。發(fā)現(xiàn)lnP(D)隨K持續(xù)上升，因此不能通過似然值最大的原則選取K值，需采用ΔK來(lái)確定合適的K值( 圖1)，發(fā)現(xiàn)K為3時(shí)ΔK最大，因此有3個(gè)亞群。圖2中314份供試材料被劃為由紅色、綠色和藍(lán)色代表的群體。每條豎線代表1份材料，豎線上的彩色片段代表材料所屬群體的比例。將比例超過65%的同種顏色的材料歸于同一亞群，其余材料歸于混合亞群。將亞群命名為第一亞群、第二亞群、第三亞群和混合亞群，發(fā)現(xiàn)第一亞群包含黑龍江品種53份，吉林品種17份，日本品種18份，俄羅斯品種2份，朝鮮品種1份；第二亞群包含黑龍江品種12份，吉林品種4份，俄羅斯品種5份，日本品種1份；法國(guó)品種1份；第三亞群包含遼寧品種29份，吉林品種16份，黑龍江品種9份，日本品種64份，朝鮮品種7份，韓國(guó)品種7份，美國(guó)品種2份；混合亞群包括黑龍江品種30份，吉林品種9份，遼寧品種1份，韓國(guó)品種12份，日本品種9份，朝鮮品種3份，法國(guó)品種2份。通過STRUCTURE 2.3.4軟件計(jì)算K為3時(shí)的Q值并用于關(guān)聯(lián)分析。

表1 314份水稻品種的VB6變異Table 1 Variation of VB6 in 314 rice varieties

表2 VB6極高和極低的部分水稻品種Table 2 Rice varieties with the highest and lowest VB6

2.3 連鎖不平衡分析

不同位點(diǎn)間的連鎖不平衡是關(guān)聯(lián)分析的基礎(chǔ)[21]。如圖3所示，以D′ 與P值繪制矩陣圖，用于觀測(cè)SSR位點(diǎn)之間LD的排列。通過154個(gè)SSR標(biāo)記分析，在11 782個(gè)SSR位點(diǎn)成對(duì)組合中，不論是同一連鎖群還是不同連鎖群，都存在一定程度的LD。D′統(tǒng)計(jì)概率(P<0.01)支持的LD成對(duì)位點(diǎn)1 566個(gè)，占全部位點(diǎn)組合的13.3%，D′平均值為0.38，整體LD水平較高。

圖1 STRUCTURE軟件分析預(yù)測(cè)的lnP(D)和ΔKFig.1 Estimated lnP(D) and ΔK over ten repeats of structure analysis

圖2 群體結(jié)構(gòu)(K=3)Fig.2 Population structure (K=3)

2.4 關(guān)聯(lián)分析

利用TASSEL3.0軟件中的GLM和MLM模型，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行性狀與標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析，當(dāng)P≤0.01認(rèn)為位點(diǎn)與性狀顯著關(guān)聯(lián)。由表3可知，2 a共檢測(cè)到與VB6相關(guān)的位點(diǎn)13個(gè)，其中2017年通過GLM模型定位到的RM254貢獻(xiàn)率最高為11.69%，所有位點(diǎn)的貢獻(xiàn)率范圍為3.87%～11.69%。2 a在至少一種模型中檢測(cè)到的位點(diǎn)有6個(gè)，分別是位于第11號(hào)染色體上的RM254，位于12號(hào)染色體的RM309，位于4號(hào)染色體的RM518，位于6號(hào)染色體的RM540，位于8號(hào)染色體的RM1271以及位于10號(hào)染色體的RM24856；其中，RM254、RM309和RM540在 2 a 2種模型中均被檢測(cè)到。

2.5 優(yōu)異等位基因及載體材料

對(duì)2 a中在GLM和MLM模型中同時(shí)檢測(cè)到的3個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)異等位基因挖掘。因?yàn)闃?biāo)記間等位變異的表型效應(yīng)值為正數(shù)時(shí)才對(duì)水稻的VB6有促進(jìn)作用所以將2 a中表型效應(yīng)大于零的優(yōu)異等位變異進(jìn)行整理，并同時(shí)列出攜帶該等位變異的3個(gè)最佳品種(表4)。由表4可知，2 a中優(yōu)異等位基因共8個(gè)，其中，RM254-200、RM254-205、RM309-185、RM540-205、RM540-215、RM540-230在2 a中均被發(fā)現(xiàn)，RM540-230 表型效應(yīng)值最高分別達(dá)到了6.23和5.91。2 a中發(fā)現(xiàn)較優(yōu)載體材料‘遼星6’‘越實(shí)’‘花臉’等有較高VB6且至少含有2個(gè)以上優(yōu)異等位變異。

圖3 供試材料154個(gè)SSR位點(diǎn)間連鎖不平衡的分布Fig.3 The LD distribution of 154 loci in the detected accessions

年份 Year方法 Method標(biāo)記 Maker染色體 ChromosomeP值 P value貢獻(xiàn)率/% R22016GLMRM20826.16E-033.99RM254111.61E-0611.37RM309122.28E-045.84RM51587.68E-034.64RM51841.26E-048.15RM54063.12E-058.65RM54788.82E-035.89RM58311.20E-037.46RM127154.55E-035.75RM131321.18E-036.41RM24856105.79E-036.51MLMRM254119.08E-047.52RM309123.92E-034.04RM51846.92E-035.29RM54066.07E-035.05RM131323.63E-035.922017GLMRM15281.94E-034.68RM254119.29E-0711.69RM309123.21E-045.62RM51844.55E-047.24RM54066.35E-058.11RM127159.74E-035.12RM136964.47E-037.06RM24856101.29E-037.68MLMRM254111.44E-048.92RM309124.98E-033.87 RM54064.82E-035.21

表4 與VB6相關(guān)的優(yōu)異等位變異及載體材料Table 4 Excellent alleles associated with VB6 in the materials

3 討論與結(jié)論

VB6作為一種日常必需的維生素，在人體中發(fā)揮著重要的作用。但在水稻中對(duì)VB6的研究較少，并未有關(guān)聯(lián)分析方面的報(bào)導(dǎo)。因此，通過關(guān)聯(lián)分析挖掘與VB6相關(guān)的SSR標(biāo)記，對(duì)后續(xù)研究有重要意義。本研究采用的314個(gè)水稻品種組成的群體材料來(lái)自于不同國(guó)家和地區(qū)，它們地理來(lái)源廣泛，同時(shí)對(duì)品種的VB6變異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)不同品種間VB6變異范圍大，具有豐富多樣性，是進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析良好材料。對(duì)VB6最高和最低的品種進(jìn)行整理，發(fā)現(xiàn)‘龍錦1號(hào)’‘遼星6’‘花臉’等10個(gè)品種VB6最高，達(dá)到80 μg/g以上。‘花葉稻’‘公苗糯’‘空育131’等10個(gè)品種VB6最低，普遍低于50 μg/g。在VB6最低的10個(gè)品種中，‘空育131’在黑龍江省被廣泛種植，可通過與VB6較高的品種‘龍錦1號(hào)’和‘遼星6’等雜交，進(jìn)行改良。

群體遺傳結(jié)構(gòu)分析是關(guān)聯(lián)分析的前提[22-23]。本研究通過對(duì)群體結(jié)構(gòu)分析減少了群體分類對(duì)關(guān)聯(lián)分析的影響，避免人為因素對(duì)亞群劃分的影響。通過STRUCTURE 軟件對(duì)供試材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析并劃分為3個(gè)亞群，并將所得Q值作為協(xié)變量納入計(jì)算，降低了亞群混合造成的偽關(guān)聯(lián)概率，使關(guān)聯(lián)分析結(jié)果更具準(zhǔn)確性。此外，研究通過2 a的2種模型(GLM模型和MLM模型)對(duì)SSR標(biāo)記與VB6進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。其中，MLM模型不僅考慮了群體結(jié)構(gòu)Q值，同時(shí)還考慮了親緣關(guān)系K值，使檢測(cè)到的標(biāo)記數(shù)目少于GLM模型中的標(biāo)記數(shù)。同時(shí)對(duì)2 a的2種模型的結(jié)果進(jìn)行分析，得到的結(jié)論更有全面性更可靠。

通過2 a的2種模型對(duì)與VB6相關(guān)的位點(diǎn)進(jìn)行挖掘，共檢測(cè)到與VB6相關(guān)的位點(diǎn)13個(gè)，貢獻(xiàn)率范圍為3.87%～11.69%，其中RM254、RM309和RM540在2 a的2種模型中均被檢測(cè)到，RM254貢獻(xiàn)率最高為11.69%。在研究發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)中，RM24856與水稻中的PDX1基因的同源基因OsPDX1.2位置相近，該基因已被證實(shí)能影響水稻VB6，超量表達(dá)該基因能提高水稻VB6水平[10]。RM24856位點(diǎn)位于第10染色體上的95 524 bp～95 543 bp，OsPDX1.2位于第10染色體上的80 964～82 250，兩者距離僅13 274 bp，RM24856位點(diǎn)極有可能與OsPDX1.2連鎖。

進(jìn)一步對(duì)RM254、RM309和RM540位點(diǎn)的優(yōu)異等位變異進(jìn)行挖掘，發(fā)現(xiàn)優(yōu)異等位基因共8個(gè)，其中RM254-200、RM254-205、RM309-185、RM540-205、RM540-215、RM540-230在2 a中均被發(fā)現(xiàn)，RM540-230 表型效應(yīng)值在2 a最高中最高，分別達(dá)到6.23和5.91。挖掘出有較高VB6且聚合了與VB6相關(guān)的優(yōu)異等位變異的載體材料‘遼星6’‘越實(shí)’‘花臉’等，可作為親本用于日后的分子輔助育種。