王 婧，刁小龍，楊海峰，孫志雯，陳曉蘭

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,江蘇泰州 225300 2. 中崇信諾生物科技泰州有限公司，江蘇泰州 225300)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea)病在臨床以急性腸炎為特征，常由于致死性水樣腹瀉導(dǎo)致仔豬脫水死亡，是一種高致死率疾病[1]。病原為豬流行性腹瀉病毒(PEDV)，該病毒可感染各年齡段豬，使患病豬出現(xiàn)水樣腹瀉、嘔吐等臨床癥狀，并伴隨厭食和精神沉郁等。仔豬的感染率可達(dá)100%，母豬則不一定[2]。從患病豬48 h的排泄物中可檢測(cè)到PEDV，有時(shí)甚至可延長(zhǎng)至4周。PEDV感染1周齡以內(nèi)仔豬可引起嚴(yán)重水泄和3～4 d嘔吐，隨后出現(xiàn)嚴(yán)重的脫水和電解質(zhì)失衡并可能導(dǎo)致死亡，平均死亡率達(dá)50%，1～3 日齡仔豬死亡率甚至可達(dá)100%。雖然大一點(diǎn)的豬比1周齡以內(nèi)仔豬初發(fā)病時(shí)癥狀輕微，但PEDV影響育肥豬的生長(zhǎng)情況。母豬可能不會(huì)腹瀉，但是通常會(huì)有抑郁和厭食的表現(xiàn)[3]。

PEDV是一個(gè)大的有囊膜RNA病毒，屬于尼多病毒目冠狀病毒屬甲型冠狀病毒科，基因組大約28 kb，擁有5′端非翻譯區(qū)和3′端非翻譯區(qū)，共編碼至少7 個(gè)開放閱讀框(ORF1a，ORF1b，ORF2～ORF6)，其中ORF 1a和ORF 1b共占整個(gè)基因組5′端的2/3，用于編碼非結(jié)構(gòu)蛋白。剩余 3′端的基因共編碼4 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，分別是纖突蛋白(S)、膜蛋白(M)、小膜蛋白(E)和核衣殼蛋白(N)。其中S蛋白是病毒子包膜主要的Ⅰ型糖蛋白，與病毒入侵及刺激并誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和性抗體密切相關(guān)。S蛋白可劃分為S1(1～735 aa)和S2(736～1 383 aa)兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，S1結(jié)構(gòu)域?qū)ψR(shí)別豬氨基肽酶(pAPN)受體至關(guān)重要。PEDV進(jìn)入細(xì)胞與pAPN結(jié)合，隨后通過(guò)直接膜融合的方式與靶細(xì)胞完成內(nèi)化過(guò)程，隨后脫殼并釋放病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)開始復(fù)制[4-6]。

另有研究表明，冠狀病毒S蛋白的變異會(huì)導(dǎo)致其宿主范圍、組織細(xì)胞培養(yǎng)及毒力發(fā)生改變。遺傳進(jìn)化分析表明，S基因存在較高的變異性，不同分離株S基因之間存在不同程度的核苷酸插入、突變和刪減等現(xiàn)象，進(jìn)而改變病毒原始抗原特性，因此常被用來(lái)研究不同時(shí)間和地區(qū)流行毒株之間的親緣關(guān)系[7]。

2017年3月，河南周口某豬場(chǎng)發(fā)生哺乳仔豬腹瀉，通過(guò)剖檢疑似為PEDV感染，為進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷及對(duì)該豬場(chǎng)PEDV的流行情況進(jìn)行分析，本研究采集發(fā)病仔豬新鮮腸道樣品進(jìn)行PEDV檢測(cè)，并進(jìn)一步克隆S基因片段，運(yùn)用DNAMAN、MEGA等基因分析軟件進(jìn)行序列分析，為進(jìn)一步掌握該地PEDV的流行毒株及毒力變異情況提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采集河南周口某豬場(chǎng)的腹瀉仔豬新鮮腸道樣品3份，置于-80 ℃冰箱冷凍保存。

1.2 試 劑

PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2(Dye Plus) 一步法RT-PCR試劑盒、EXTaq酶、DNA marker DL2000、DNA marker DL5000、pMD18-T載體等均購(gòu)自TAKARA寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；普通質(zhì)粒提取購(gòu)自天根生化科技有限公司；瓊脂糖為西班牙Biowest公司產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 樣品處理及RNA提取

小腸病料組織加入適量液氮進(jìn)行研磨稀釋后，于4 ℃ 10 000 r/min離心10 min。吸取上清液按照Trizol說(shuō)明提取RNA，最后將RNA溶解于DEPC水中，-20 ℃保存。

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)腹瀉仔豬的臨床癥狀懷疑是由PEDV感染引起，按照PEDV基因序列設(shè)計(jì)并合成引物。其中M1/M2引物用于PEDV檢測(cè)，參照文獻(xiàn)[8]合成，由于S基因片段較長(zhǎng)，因此將基因分為Sa、Sb、Sc 3段進(jìn)行克隆，根據(jù)CV777毒株S基因序列，采用Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由上海生物工程有限公司進(jìn)行引物合成。引物信息見表1。

表1 PCR引物信息Table 1 Information of PCR primer

1.5 反轉(zhuǎn)錄及基因的PCR擴(kuò)增

根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明，配制RT-PCR反應(yīng)液，將一步法酶混合物、Buffer、引物、提取的PEDV總RNA及RNase Free dH2O配制成25 μL反應(yīng)體系，按照以下程序放入PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，M基因擴(kuò)增PCR程序參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行，S基因片段的擴(kuò)增條件為：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。反應(yīng)結(jié)束后吸取5 μL 反應(yīng)產(chǎn)物在15 g/L的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.6 S基因克隆

電泳檢測(cè)條帶和目的條帶一致后，取PCR反應(yīng)混合液3 μL，pMD-18T載體1 μL，Buffer 5 μL，滅菌水1 μL，混合均勻后置于16 ℃連接2 h，并轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，采用PCR 法進(jìn)行鑒定，鑒定成功后將陽(yáng)性菌株送上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.7 序列分析

將測(cè)序得到的3 個(gè)片段采用Congtig1軟件進(jìn)行拼接，然后采用 DNAMAN 軟件對(duì)所獲得的序列進(jìn)行翻譯。對(duì)翻譯推導(dǎo)所得的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行 BLASTp 分析，并與經(jīng)典毒株 CV777 的序列進(jìn)行多序列比對(duì)，分析其突變位點(diǎn)。最后與近年來(lái)國(guó)內(nèi)外流行的 PEDV 毒株進(jìn)行多序列比對(duì)，采用Mega 5.0 軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，毒株信息見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床病料的PEDV檢測(cè)

采用 Trizol 法提取腹瀉仔豬腸道樣品的 RNA，參照文獻(xiàn)[8]采用擴(kuò)增M基因的引物對(duì)提取的樣品RNA進(jìn)行一步法反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)，以對(duì)照株 CV777 作為陽(yáng)性對(duì)照，電泳結(jié)果顯示3個(gè)樣品均有特異性條帶，約為290 bp，與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)，對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行克隆測(cè)序與序列分析的結(jié)果表明3個(gè)樣品均為PEDV陽(yáng)性。

2.2 PEDV S基因的擴(kuò)增及克隆

由圖 2 可知，分別進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增Sa、Sb和Sc片段，并進(jìn)行克隆和測(cè)序，片段大小為2 188、1 532 和 1 404 bp。

2.3 PEDV S基因的序列分析

利用Contig1軟件將測(cè)序得到的片段分別進(jìn)行拼接，得到3條S基因序列，分別命名為A、B和C，長(zhǎng)度均為4 161 bp，共編碼1 386個(gè)氨基酸，3株P(guān)EDVS基因的核苷酸序列和推導(dǎo)氨基酸序列相似性為99%。3條S基因核酸序列BLAST搜索結(jié)果均與AHCZ-2株的相似性最高，達(dá)98.6%。推導(dǎo)氨基酸序列與經(jīng)典毒株CV777相比，在第57位插入4個(gè)氨基酸NQGV，在第134位插入1個(gè)氨基酸D，而在第157、158位缺失 2個(gè)氨基酸，與王飛等[9]報(bào)道的中國(guó)部分地區(qū) PEDVS基因的蛋白序列相似。

表2 PEDV的S基因序列比對(duì)參考毒株信息Table 2 Viral reference strain for S Gene sequence alignment of PED

C.CV777株陽(yáng)性對(duì)照 Positive control of CV777 strain; 1～3.檢測(cè)樣品 Sample;4.陰性對(duì)照 Negative control; M.DNA marker DL2000

圖1M基因檢測(cè)電泳結(jié)果
Fig.1AgarosegelelectrophoresisofPCRamplificationsforPEDVMgene

M.DNA marker DL5000;1.Sa；2.Sb；3.Sc

采用Clustal Omega在線軟件對(duì)所得3個(gè)S基因推導(dǎo)蛋白質(zhì)序列和經(jīng)典毒株CV777的S蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在中和表位區(qū)域(499～638 aa)共有11處突變，分別是517位A→S，521位L→R，523位S→G，527位V→I，542位D→G，549位T→S，594位G→S，605位A→E，619位F→S，621位K→T，635位I→V。3個(gè)線性表位只有1 373～1 379有 1 個(gè)氨基酸突變。而在預(yù)測(cè)的 2 處受體結(jié)合域中，25～88 aa結(jié)構(gòu)域有11處氨基酸突變或插入，249～529 aa結(jié)構(gòu)域有14處氨基酸突變或缺失。

2.4 PEDV S蛋白遺傳進(jìn)化分析

主要選擇PEDV經(jīng)典毒株CV777，中國(guó)周邊各國(guó)的疫苗株、經(jīng)典流行株，以及近年來(lái)在中國(guó)境內(nèi)分離到的部分毒株與本試驗(yàn)克隆得到的3株P(guān)EDV毒株S基因推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，并利用MEGA 5 軟件，采用N-J法進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹的構(gòu)建(圖3)。

圖3 PEDV的S蛋白氨基酸遺傳進(jìn)化分析Fig.3 Genetic evolution analysis of S protein amino acid of PEDV

利用篩選得到的39 株代表毒株的S蛋白氨基酸序列構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，可見進(jìn)化樹分為兩個(gè)大分支，每個(gè)分支又可劃分為a和b 2 個(gè)小分支，本次試驗(yàn)所得的 3 株S蛋白均位于G2-b分支，位于同一分支的還有中國(guó)境內(nèi)流行毒株YC2014、CH/GDZH02/1、CH-SCAY-2014、HBXY-1和CH-QTC-01-2015，美國(guó)的流行株USA/Colorado和CHGD-01等，表明本次鑒定的毒株與這些毒株遺傳關(guān)系較近。韓國(guó)經(jīng)典毒株Chinju99、NJ02和 KNU-0801，以及日本的KH野豬毒株均位于G2-a分支。美國(guó)流行的經(jīng)典株CV777以及LZC、DR13和Brl/87等毒株均位于G1-a分支，其他中國(guó)流行毒株如CH/JLGZL/2011和JS-2004-2等位于G1-b分支，本研究結(jié)果與喬涵等[10]報(bào)道的河南分離株均位于G2分支相似。

3 討 論

在亞洲，PEDV于1982年在日本首次被報(bào)道，至此PEDV在亞洲各國(guó)迅速流行。2000年以后，PEDV在菲律賓、泰國(guó)、中國(guó)臺(tái)灣和越南等地的報(bào)道日益增加[11-12]。自從PED第一次在中國(guó)確診，該病就一直給中國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失，20世紀(jì)90年代早期，經(jīng)典毒株CV777的滅活苗在中國(guó)被廣泛應(yīng)用，PED得到較好的控制[13]。但從2010年開始，PED在中國(guó)養(yǎng)豬大省死灰復(fù)燃，中國(guó)科學(xué)家對(duì)近幾年的PEDV分子流行病進(jìn)行大量調(diào)查。從2011年2月—2014年3月，進(jìn)行除中國(guó)西藏和海南的29省大規(guī)模調(diào)查，結(jié)果顯示4 a間全國(guó)總樣品陽(yáng)性率為61.1%～78.49%不等，而各豬場(chǎng)陽(yáng)性率為71.43%～83.47%不等[14]。

2017年3月在河南周口某豬場(chǎng)出現(xiàn)大量哺乳仔豬腹瀉，通過(guò)剖檢疑似PEDV感染，為了確診，本研究進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室PCR檢測(cè)以及S基因的遺傳進(jìn)化分析。研究結(jié)果顯示3份樣品的S基因與疫苗株CV777的相似性均為98%以上，雖然表現(xiàn)出極高的相似性，但是這3株新毒株相對(duì)經(jīng)典疫苗株在中和表位區(qū)域(499～638 aa)[15]共有11處氨基酸突變，另外兩個(gè)中和表位，SS2表位(748YSNIGVCK755)較為保守，SS6表位中(764LQDGQVKI771)766D突變?yōu)镾，而國(guó)內(nèi)近年來(lái)分離的毒株在此結(jié)構(gòu)域多數(shù)表現(xiàn)為2～3個(gè)氨基酸突變(L突變?yōu)镾)[16]，在該結(jié)構(gòu)域氨基酸突變易影響S蛋白的疏水性[17]。尤其值得注意的是，被檢毒株S蛋白中和表位區(qū)域的549位T→S，594位G→S突變現(xiàn)象，549位和594位為S蛋白的中和表位結(jié)構(gòu)域，這些位置的突變可能和免疫動(dòng)物發(fā)病具有重要聯(lián)系，中國(guó)自2011年以后分離的PEDV毒株這兩處均突變?yōu)榻z氨酸，而2002-2009年分離到的PEDV毒株這兩處氨基酸的突變情況不同，這期間少數(shù)毒株第549位未發(fā)現(xiàn)突變，而大部分毒株此處突變?yōu)榫彼醄18]。

目前，中國(guó)PED爆發(fā)主要是由于G1b變異株以及與CV777不同基因型的G2流行野毒株的流行導(dǎo)致[19]。2010年之后，屬于G1b基因群的新的變異毒株在中國(guó)被陸續(xù)報(bào)道，如在陜西渭南流行的PEDV均屬于G1分支，且與CV777親緣關(guān)系較遠(yuǎn)[20]。另外，免疫動(dòng)物的PED爆發(fā)使人們對(duì)CV777毒株疫苗的保護(hù)性產(chǎn)生質(zhì)疑。對(duì)此次檢測(cè)到的3株P(guān)EDV進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析顯示均屬于G2-b分支，從親緣關(guān)系看與在河南省附近其他省份分離到的PEDV毒株親緣關(guān)系較近。這與周兵強(qiáng)等[21]分析的近年來(lái)河南省PEDV的M基因和ORF3基因均屬于基因2型結(jié)果一致，并且與經(jīng)典毒株以及疫苗株比較均發(fā)生變異，而與2010年后國(guó)內(nèi)流行的大多數(shù)毒株的同源性較高。本研究結(jié)果為進(jìn)一步跟蹤監(jiān)測(cè)河南省PEDV分子流行特征，制定綜合防控措施及新疫苗研發(fā)具有重要意義。