梁 柳，胡如久，林 華，蘇 源，高玉鵬，楊明明

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院, 陜西楊凌 712100)

沙門菌是肉雞生產(chǎn)中常見的病原菌，會引起急性或慢性常見多發(fā)疾病，且是貫穿整個養(yǎng)禽周期的惡性循環(huán)式疾病，對人類和動物健康均具有極大危害[1]。沙門菌感染會引起各種疾病如雞白痢、雞傷寒和副傷寒，造成機體病變甚至死亡，對家禽養(yǎng)殖業(yè)造成極大的經(jīng)濟損失。預(yù)防和控制沙門菌感染的措施主要有藥物防治和疫苗免疫。常用的疫苗有3大類：滅活疫苗、弱毒活疫苗和亞單位疫苗[2]。盡管這些措施在防控疾病方面有所成效，但仍存在一些缺陷。如：長時間用藥控制沙門菌感染效果可能要好些，但是大劑量和頻繁用藥，成本很高，耐藥性和藥物殘留也是大問題[3]；傳統(tǒng)的疫苗存在免疫力低，免疫周期短，安全穩(wěn)定性不好，生產(chǎn)程序復(fù)雜等[4]問題。因此，尋求一種更安全可靠，具有高免疫原性和免疫能力的方法來預(yù)防沙門氏菌感染勢在必行。

細菌胞外囊泡(Outer membrane vesicles, OMVs)是革蘭氏陰性細菌外膜在生長過程中自發(fā)釋放的一種由脂質(zhì)雙層膜包圍的球形囊泡[5]。OMVs的直徑一般為50～200 nm[6]，主要含有蛋白質(zhì)、核酸、磷脂、酶及脂多糖等生物活性分子。OMVs具有多種生物功能如：作為藥物載體在機體內(nèi)發(fā)揮作用和對細菌生理與病理的功能等[7]。OMVs中的脂多糖和外膜蛋白可以作為免疫評估分子的輔助劑刺激抗原呈遞細胞，增強免疫反應(yīng)[8]。OMVs也會產(chǎn)生多種毒性因子，如堿性磷酸酶、溶血性磷脂酶C和膽囊纖維調(diào)控因子抑制因子，從而影響宿主細胞生物學(xué)功能[9]。此外，OMVs還可誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)功能，表面可以展示抗原，從而在宿主中引起強烈的炎癥和免疫反應(yīng)。從腦膜炎菌(N.meningitidis)中分離的OMVs可作為疫苗抵抗其引起的腦膜炎癥[6]。Alaniz等[7]研究表明鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium,ST)OMVs(ST-OMVs)可以刺激促炎因子的產(chǎn)生，如腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor alpha, TNF-a)和白介素-2(Interleukin-2, IL-2)。Muralinath等[10]研究表明ST獲得的OMVs可誘發(fā)保護性免疫反應(yīng)，并被用作載體從其他病原體中傳遞抗原。這些研究提示，一些革蘭氏陰性細菌的OMVs具有開發(fā)成疫苗的潛力，并且OMVs疫苗是以納米微囊泡的形式被宿主細胞識別，具有高效、毒性小等優(yōu)點[11]。本試驗旨在從ST培養(yǎng)液中分離并純化ST-OMVs，探究其對肉仔雞的毒性及免疫保護效果，為肉仔雞的疫病防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株及其培養(yǎng)

鼠傷寒沙門氏菌(編號：CVCC2226)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，將新鮮LB液體培養(yǎng)基于200 r/min 37 ℃的水平搖床上振蕩培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

酵母粉，蛋白胨，瓊脂粉，氯化鈉，氯化鉀，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，OptiPrepTM Density Gradient Medium溶液，BCA試劑盒購自南京建成生物技術(shù)有限公司。

1.3 ST-OMVs的分離、純化與鑒定

將保存的ST菌種復(fù)蘇，在新鮮LB液體培養(yǎng)基中于200 r/min 37 ℃的水平搖床上擴大培養(yǎng)；然后將培養(yǎng)物于4 ℃ 12 000×g進行高速冷凍離心15 min；取上清用直徑為0.45 μm的濾膜過濾；過濾后的濾液經(jīng)過100 ku濾膜進行超濾得到超濾濃縮液；濃縮液于4 ℃ 150 000×g進行超速離心2 h，去上清得到沉淀，用0.1 mol/L的PBS溶液重懸沉淀物。隨后對重懸液采用從10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%到50%不同體積分數(shù)的OptiPrepTM Density Gradient Medium溶液進行梯度密度離心[12]，取20%～40%體積分數(shù)間的組分后超速離心2 h，富集得到的沉淀即為純化ST-OMVs[12]，置于-80 ℃保存。

利用掃描電鏡[13]來觀察OMVs的外部形態(tài)特征，利用Nanosight NS300納米顆粒跟蹤分析儀[14]來測定OMVs的粒徑與濃度，利用 BCA法[14]測定ST-OMVs的蛋白濃度。

1.4 試驗動物及飼養(yǎng)管理

將350只1日齡健康愛拔益加(AA)雛雞，在清潔環(huán)境中飼養(yǎng)至7日齡。選擇經(jīng)沙門氏菌感染為陰性、健康及體質(zhì)量一致的320只肉仔雞隨機等分為5組，每組8個重復(fù)，每重復(fù)8只，試驗設(shè)計分別為對照組(PBS組)、后期攻毒試驗用的ST感染組(ST組)和3個不同劑量OMVs的ST-OMVs組，OMVs注射劑量分別為5、10和20 μg/(d·只)(OMV5、OMV10和OMV20)。飼養(yǎng)第1周采用24 h光照，室溫保持在35 ℃，從8日齡開始每天降低1 ℃直到25 ℃。8日齡起采用23L：1D光照制度，每日19:00-20:00停止光照1 h。試驗雞飼喂商品飼料，0～21日齡飼喂前期料，22～36日齡飼喂中期料，營養(yǎng)成分滿足或超過NRC(1994)的標(biāo)準，每日于8:00、14:00和20:00 共投料3次，自由飲水。

1.5 ST-OMVs免疫程序

3個OMVs免疫組試驗雞從8日齡開始每隔1周對試驗雞腹腔注射200 μL含有OMVs的PBS，OMVs劑量分別為5、10和20 μg/(d·只)，每次連續(xù)3 d，共注射3次。即在8、9、10日齡進行第1次注射；在15、16、17日齡進行第2次注射；在22、23、24日齡進行第3次注射。PBS組和ST組按相同方法注射等量PBS溶液。每次注射前試驗雞禁水禁食2 h，注射后1 h恢復(fù)食水。

1.6 ST對試雞的攻毒

30日齡時，對ST組和3個OMVs免疫組肉仔雞腹腔注射1×109CFU的ST[15]，PBS組腹腔注射等量PBS溶液作為對照，繼續(xù)觀察飼養(yǎng)5 d。

1.7 樣品采集與預(yù)處理

ST-OMVs第3次免疫后1周，即試驗第29天，隨機選定各重復(fù)的2只試驗雞翅靜脈采血2 mL，以重復(fù)作為1個分析血樣，屠宰，采集右側(cè)胸腺、脾臟和法氏囊稱量；血液37 ℃靜置1 h后，4 ℃放置過夜，低溫冷凍離心機1 500×g離心15 min，吸取上層血清，-20 ℃保存，用于血清免疫相關(guān)生理指標(biāo)的測定。

試驗雞攻毒后的第5天，即試驗第35天，隨機選定各重復(fù)的2只試雞翅靜脈采血。血液置于抗凝管中，1 500×g，4 ℃離心15 min，吸取上清，-20 ℃保存，用于測定血清炎性細胞因子。

1.8 檢測指標(biāo)與方法

1.8.1 OMVs免疫期間的生產(chǎn)性能 試驗開始時(第8天)記錄初始體質(zhì)量，分別在試驗第15、22、29天(即一免、二免和三免1周后)8:00空腹稱質(zhì)量、結(jié)料，計算日均采食量(DFI)、平均日增量(BWG)和飼料效率(FCR)。

第8～29天，每天觀察記錄各重復(fù)死亡數(shù)，按周計算各組死亡率。

1.8.2 免疫器官指數(shù)測定 第29天采樣時，胸腺、脾臟和法氏囊去盡脂肪和結(jié)締組織，用濾紙吸干殘血后，用分析天平稱其濕量，計算胸腺、脾臟和法氏囊指數(shù)，即每100 g體質(zhì)量中脾臟所占的質(zhì)量。公式如下：

免疫器官指數(shù)(g/100 g)=免疫器官質(zhì)量/試雞體質(zhì)量×100

1.8.3 血清免疫相關(guān)生理指標(biāo)測定 測定第3次免疫1周后即試驗第29天采集血清中免疫相關(guān)生理指標(biāo)，本試驗樣品檢測工作由北京華英生物技術(shù)研究所完成。溶菌酶活力(Lysozyme, LZM)：采用血清溶菌酶活性測定試劑盒測定；補體活力：采用免疫透射比濁法試劑盒測定血清補體C3質(zhì)量濃度；白蛋白質(zhì)量濃度(Albumin, ALB)：采用試劑盒溴甲酚綠比色法測定；超氧化物歧化酶活性(Superoxide dismutase,SOD)：采用超氧化物歧化酶測定試劑盒進行測定。

1.8.4 OMVs的免疫保護效果 攻毒后體質(zhì)量變化。試驗第30天，ST攻毒后，每日8:00按重復(fù)空腹對活雞稱量。

攻毒后存活率。ST攻毒5 d后，記錄各重復(fù)死亡雞數(shù)，計算各組存活率。

炎性細胞因子測定。采用放射免疫法測定試驗第35天采集的血清，每重復(fù)2只雞，以重復(fù)作為1個分析血樣，測定其中的IL-1β(Interleukin-1β, IL-1β)、IL-6(Interleukin-6, IL-6)、TNF-α促炎性細胞因子的分泌量，本試驗樣品檢測工作由北京華英生物技術(shù)研究所完成。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件One-Way ANOVA模塊進行方差分析，用Duncan’s法進行多重比較，數(shù)據(jù)均用“平均值±標(biāo)準差”表示，以P<0.05 作為差異顯著性判斷標(biāo)準。

2 結(jié)果與分析

2.1 ST-OMVs生物特性分析

采用差速離心法從ST培養(yǎng)液上清中富集、密度梯度離心法純化后得到較多量的純化ST-OMVs沉淀。對純化ST-OMVs進行掃描電鏡檢測，結(jié)果(圖1)顯示，無雜質(zhì)、視野清晰，ST-OMVs大小不一，外形呈現(xiàn)圓形或橢圓形，直徑100 nm左右，在50～200 nm范圍之內(nèi)，符合細菌OMVs顆粒粒徑的要求。隨后采用Nanosight檢測純化ST-OMVs的粒徑分布(圖2)，結(jié)果顯示MODE曲線線條平緩流暢，說明含有的雜質(zhì)較少，純度較好；粒徑峰值為76 nm，還有少數(shù)在100～200 nm間，與細菌OMVs的理論顆粒粒徑大小值基本吻合，偏離范圍的小部分可能與顆粒間粘著有關(guān)。最后，采用BCA法對純化ST-OMVs進行蛋白定量，結(jié)果顯示1×1010particles/mL的ST-OMVs的蛋白質(zhì)量濃度為7.3 μg/mL。

圖1 掃描電鏡觀察ST-OMVs形態(tài)Fig.1 Observation of ST-OMVs morphoiogical using SEM

圖2 NAnosight檢測ST-OMVs粒徑分布Fig.2 NAnosight analysis of ST-OMVs

2.2 ST-OMVs對肉仔雞生產(chǎn)性能及免疫功能的影響

由表1可知，與對照組相比，OMV5和OMV10組肉仔雞在8～28日齡各階段及整個免疫期的DFI、BWG和FCR均無顯著差異(P>0.05)，而OMV20組試驗雞的DFI和BWG顯著降低(P<0.05)，F(xiàn)CR顯著增加(P<0.05)。OMV20組試驗雞在7～14 d和15～21 d有少量死亡，但與PBS組無顯著差異(P>0.05)；OMV5和OMV10組均無試驗雞死亡。說明，5和10 μg/(d·只)的OMVs免疫劑量對免疫期間肉仔雞生產(chǎn)性能沒有顯著影響，而20 μg/(d·只)的OMVs免疫劑量可顯著降低免疫期間肉仔雞生產(chǎn)性能。

由表2可知，雖然3個OMVs劑量免疫組試驗雞的免疫器官指數(shù)有高于PBS組趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)上的差異(P>0.05)。表3結(jié)果顯示，OMVs免疫可顯著提高免疫期間肉仔雞血清中溶菌酶活力、白蛋白質(zhì)量濃度、C3質(zhì)量濃度及SOD活力(P<0.05)，并且OMV10組雞血清的白蛋白質(zhì)量濃度、C3質(zhì)量濃度及SOD活力最高。說明OMVs免疫在一定程度上能夠促進免疫器官生長發(fā)育，顯著改善機體免疫功能。

表1 ST-OMVs對肉仔雞生產(chǎn)性能及死亡率的影響Table 1 Effects of ST-OMVs on performance and mortality in broilers

注：同列數(shù)據(jù)后相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Note:In the same colum, values with the same letter or without letter superscripts mean no significant difference(P>0.05), the different lowercase letter superscripts mean significant difference(P<0.05).The same below.

表2 ST-OMVs對肉仔雞免疫器官指數(shù)的影響Table 2 Effects of ST-OMVs levels on organ index in broilers

表3 ST-OMVs對肉仔雞血清免疫相關(guān)生理指標(biāo)的影響Table 3 Effects of ST-OMVs on serum immunity-related indices in broilers

2.3 ST-OMVs對肉仔雞的免疫保護效果

由圖3可知，除OMV20組試驗雞外，各組試驗雞攻毒前的初始體質(zhì)量均無顯著差異(P>0.05)。但隨著攻毒后時間的延長，ST組試驗雞體質(zhì)量出現(xiàn)顯著下降(P<0.05)，而OMVs免疫組試驗雞體質(zhì)量均顯著增加(P<0.05)。與PBS組相比，OMV5和OMV10組的試驗雞體質(zhì)量無顯著變化(P>0.05)。表明，ST-OMVs免疫能夠消除ST感染引起的雞體質(zhì)量下降。

由圖4可知，與PBS組相比，ST組試驗雞的存活率顯著降低(P<0.01)；OMV5組試驗雞的存活率顯著低于PBS組(P<0.01)，但又顯著高于ST組；OMV10和OM20組的試驗雞存活率與PBS組沒有顯著差異，且兩者之間也沒有顯著差異(P>0.01)。表明，ST-OMVs免疫能夠顯著增強ST感染試驗雞的存活率，且OMV10和OMV20免疫組效果相對較好。綜合免疫期間的生產(chǎn)性能和ST攻毒后的體質(zhì)量和存活率指標(biāo)，認為OMV10為OMVs的最佳免疫劑量組。隨后比較分析OMV10組、ST組和PBS組試驗雞在攻毒5 d后血清中的促炎性細胞因子水平，由表4可知，OMV10組的IL-1β和TNFα分泌量顯著低于ST組(P<0.05)，而OMV10組的IL-6分泌量雖然沒有顯著低于ST組，但有較大降低(0.05

圖3 攻毒后肉仔雞體質(zhì)量變化Fig.3 Body mass change of broilers changed by ST

數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準誤”(n=8)；與對照組相比，**P<0.01, ***P<0.001

Data is expressed as “mean value±SEM”(n=8)；compared with control group,**P<0.01, ***P<0.001

圖4 攻毒后肉仔雞存活率Fig.4 Survival rate of broilers changed by ST

3 討 論

OMVs是革蘭氏陰性細菌自然釋放的一種具有球形雙層膜結(jié)構(gòu)的分泌物，其粒徑平均為50～200 nm。本試驗采用掃描電鏡和Nanosight納米檢測技術(shù)從形態(tài)學(xué)和顆粒大小對ST-OMVs進行系統(tǒng)分析，更好地驗證了提取的OMVs的質(zhì)量和純度。試驗結(jié)果表明，大多數(shù)的ST-OMVs直徑在50～100 nm之間，呈圓形、橢圓形，大小各異，有的還聚集成團，符合文獻報道[6]中關(guān)于OMVs的形態(tài)學(xué)特征。同時，也有一些超過范圍的顆粒粒徑，這可能是由于超速離心后囊泡融合在一起未吹散開的結(jié)果。

本試驗研究了OMVs對肉仔雞生長性能、死亡率和各免疫器官指數(shù)的影響，結(jié)果表明，OMVs免疫劑量在5和10 μg/(d·只)時對肉仔雞生產(chǎn)性能沒有顯著的負面影響。當(dāng)OMVs免疫劑量達到20 μg/(d·只)時，肉仔雞生產(chǎn)性能出現(xiàn)顯著下降，并伴隨少量試雞死亡?？梢?，就肉仔雞生產(chǎn)性能而言，OMVs的免疫接種有一定的劑量范圍，在此范圍內(nèi)的免疫對生產(chǎn)沒有負面影響。本試驗研究結(jié)果與Kim[15]利用大腸桿菌OMVs對小鼠的存活率的研究結(jié)果一致。可見，ST-OMVs對于肉仔雞機體存在一定的安全性。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，OMVs免疫可顯著提高免疫期間血清中的溶菌酶活力、白蛋白和C3質(zhì)量濃度及SOD活力。LZM是動物體液和組織中普遍存在的一種水解酶，是具有溶解細菌作用的非特異性免疫因子，在動物機體的免疫防御中發(fā)揮重要作用[16]。ALB幾乎均由肝臟實質(zhì)細胞合成，是血清中的主要蛋白質(zhì)成分，能夠說明機體的營養(yǎng)狀態(tài)[17]。補體系統(tǒng)是動物預(yù)防細菌入侵的第2道免疫防線，特別是對革蘭氏陰性細菌。作為血清中質(zhì)量濃度最高的補體C3在機體的免疫應(yīng)答中發(fā)揮極重要的作用[18]。SOD是一種普遍存在于生物界的活性物質(zhì)，對生物體新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)起清除作用[19]。試驗表明高劑量[20 μg/(d·只)]的OMVs對肉仔雞有一定負效應(yīng)或毒副作用，影響其生長；低劑量[5 μg/(d·只)和10 μg/(d·只)]的OMVs的應(yīng)用對肉仔雞安全可行，具有免疫作用。

本試驗記錄了試驗雞在30日齡攻毒后5 d內(nèi)的體質(zhì)量變化和存活率，結(jié)果顯示，ST-OMVs免疫能夠消除ST感染引起的試雞體質(zhì)量下降，顯著提高ST攻毒后試驗雞存活率。說明ST-OMVs免疫后可顯著提高試驗雞抵抗ST感染的能力；攻毒后體質(zhì)量和存活率的變化說明OMVs對于肉仔雞具有免疫保護作用，與Liu等[20]對OMVs的免疫保護效果研究一致。本試驗測定了30日齡雞攻毒后的第5天血液炎性細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。IL-1β、IL-6和TNF-α是由多種細胞分泌的促炎性因子，具有不同生物學(xué)功能，會介入炎性反應(yīng)等病理與生理反應(yīng)。Sinha等[21]研究表明，經(jīng)霍亂弧菌(Vibriocholerae)OMVs作用能誘導(dǎo)骨髓源樹突細胞分泌IL-1β、IL-6。Lee等[22]研究表明經(jīng)肺炎雙球菌(K.pneumoniae)OMVs誘導(dǎo)巨噬細胞分泌IL-6和TNF-α。喬智慧等[23]在對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷中的研究同樣表明當(dāng)機體發(fā)生損傷時，IL-1β質(zhì)量濃度會升高。本試驗中，在30日齡進行攻毒后，未曾免疫過的ST組的肉雞血清中的IL-1β質(zhì)量濃度明顯高于PBS組。Kim[15]研究表明受到大腸桿菌攻擊后，OMV免疫的小鼠的血清和腹腔液中沒有檢測到IL-6和TNF-α水平的上升，而在未免疫小鼠中觀察到這些細胞因子顯著增加。然而，即使在OMV免疫小鼠中，腹膜液中的IL-6和TNF-α水平也增加，表明免疫組受細菌攻擊仍會導(dǎo)致局部炎癥。在本試驗中，ST組與其他2組相比IL-6的質(zhì)量濃度并沒有顯著差異，但是3組結(jié)果中，ST組的IL-6質(zhì)量濃度高于PBS組，ST組TNF-α的分泌量顯著高于其他2組，炎性因子的分泌趨勢與Kim[15]研究結(jié)果一致。本試驗中炎性因子的分泌量，與PBS組相比，OMV10組的分泌量還是有所上升，表明即使免疫組攻毒后還是會產(chǎn)生炎癥，與前人[15]研究一致。

4 結(jié) 論

OMVs作為細菌向外空間分泌的一種物質(zhì)體，作為免疫物質(zhì)，在一定程度上能夠促進肉仔雞免疫器官生長發(fā)育，且免疫劑量為10 μg/(d·只)時對其生產(chǎn)性能沒有顯著的負面影響；當(dāng)OMVs免疫劑量達到20 μg/(d·只)時則會明顯導(dǎo)致肉仔雞生產(chǎn)性能下降，并伴隨少量試雞死亡；OMVs免疫可顯著提高免疫期間肉仔雞血清中的溶菌酶活力、白蛋白質(zhì)量濃度和C3質(zhì)量濃度及SOD活力；ST-OMVs免疫能夠消除ST感染引起的肉仔雞體質(zhì)量下降，顯著提高ST攻毒后肉仔雞存活率，ST-OMVs免疫后可顯著提高肉仔雞抵抗ST感染的能力，本試驗中ST-OMVs最佳免疫劑量為10 μg/(d·只)。