王萍，陸捷潔

（海南省皮膚病醫(yī)院 皮膚科，海南 ?？?570206）

惡性黑色素瘤（malignant melanoma, MM）來源于黑色素細(xì)胞，具有侵襲力強(qiáng)、轉(zhuǎn)移性高和預(yù)后極差等特點(diǎn)[1]。細(xì)胞凋亡異常在黑色素瘤發(fā)病過程起重要作用，Survivin是人類凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein, IAPs）家族的成員，是目前腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一[2]。肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2D（myocyte enhancer factor 2D, MEF2D）在肝癌、骨肉瘤及肺癌等疾病中發(fā)揮重要抗凋亡作用[3-5]。本研究采用免疫組織化學(xué)和Western blotting檢測(cè)黑色素瘤患者和皮內(nèi)痣患者組織中Survivin和MEF2D的表達(dá)水平及其相關(guān)性，探討Survivin和MEF2D在黑色素瘤發(fā)病中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收取海南省皮膚病醫(yī)院皮膚科于2013年6月—2017年6月收集的21例黑色素瘤和10例皮內(nèi)痣組織，均通過組織病理學(xué)確診。標(biāo)本使用4%多聚甲醛溶液固定24 h，使用石蠟包埋技術(shù)制作石蠟包塊。黑色素瘤患者中男性12例，女性9例；年齡20～86歲，平均52.8歲。根據(jù)病理（Clark標(biāo)準(zhǔn)）分級(jí)：Ⅰ級(jí)5例，Ⅱ級(jí)4例，Ⅲ級(jí)6例，Ⅳ、Ⅴ級(jí)6例。皮內(nèi)痣患者中男性4例，女性6例；年齡15～56歲，平均41.7歲。

1.2 主要試劑

兔抗人Survivin單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），兔抗人MEF2D單克隆抗體（美國CST公司），免疫組織化學(xué)SP染色試劑盒DAB顯色劑（北京中杉金橋生物有限公司）。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

石蠟包塊連續(xù)切5張，厚4～5μm，1張進(jìn)行HE染色復(fù)查診斷。采用SP法進(jìn)行組織染色，實(shí)驗(yàn)操作按照試劑盒說明書進(jìn)行：60℃烤片4 h，二甲苯脫蠟、濃度梯度乙醇水化及蒸餾水洗滌，高壓修復(fù)抗原5 min，0.3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶30 min，滴加一抗（濃度參考說明書）4℃孵育過夜，PBS清洗3次，10 min/次，滴加二抗常溫孵育1 h，DAB顯色，蘇木精復(fù)染后使用鹽酸分化和氨水返藍(lán)，乙醇濃度梯度脫水，二甲苯透明和中性樹膠封片，使用顯微鏡觀察拍片。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn)

隨機(jī)選取高倍鏡下4個(gè)視野，按染色強(qiáng)度進(jìn)行打分，染色強(qiáng)度與背景著色相對(duì)比：0分為無色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。統(tǒng)計(jì)300個(gè)腫瘤細(xì)胞中Survivin或MEF2D陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)，依據(jù)陽性細(xì)胞所占比例判斷Survivin或MEF2D表達(dá)水平：0分為陰性，1分為≤10%，2分為＞10%～50%，3分為＞50%～75%，4分為＞75%。染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積≥2分為免疫染色陽性。

1.5 Western blotting檢測(cè)

黑色素瘤和皮內(nèi)痣組織切成小塊置入研磨器，加入400μl蛋白裂解液后研磨，轉(zhuǎn)移研磨液至1.5 ml離心管，使用震蕩器震蕩30 s，置于冰上10 min，4℃、15 000 r/min離心15 min。留取5μl蛋白上清液定量，其余加入6×Loading buffer（體積比1∶5），沸水煮沸5 min變性。取30μg蛋白上樣，SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳分離，110 V電壓轉(zhuǎn)膜2 h。5%脫脂奶粉封閉1 h，將膜置于特定一抗，4℃搖床上孵育過夜。使用TBST洗膜3次，10 min/次，置于相應(yīng)的二抗常溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗膜3次，10 min/次，后用ECL顯影液進(jìn)行顯影，目的蛋白表達(dá)量通過與內(nèi)參蛋白β-actin標(biāo)準(zhǔn)化后得到相對(duì)比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用Fisher確切概率法，相關(guān)性分析用Pearson法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組Survivin、MEF2D蛋白陽性率比較

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，Survivin蛋白染色陽性呈棕黃色顆粒，主要定位于細(xì)胞漿，少數(shù)細(xì)胞核中亦可見染色。黑色素瘤組織中有15例陽性表達(dá)，陽性率為71.4%（15/21），皮內(nèi)痣中有0例陽性表達(dá)，陽性率為0.0%（0/10），經(jīng)Fisher確切概率法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。見圖1A、B。

MEF2D蛋白陽性棕黃色顆粒主要定位于細(xì)胞核，少數(shù)胞漿中亦可見表達(dá)。黑色素瘤組織中陽性率為76.2%（16/21），皮內(nèi)痣組織中陽性率為20.0%（2/10）。經(jīng)Fisher確切概率法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.006）。見圖1C、D。

2.2 Survivin、MEF2D蛋白表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

Survivin和MEF2D蛋白在黑色素瘤組織中呈高表達(dá)，分析其與臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，隨著病理分級(jí)增加，Survivin和MEF2D蛋白陽性率逐漸升高（P＜0.05）。Ⅰ、Ⅱ級(jí)腫瘤組織免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，Survivin陽性率為33.3%（3/9），Ⅲ、Ⅴ級(jí)陽性率為83.3%（10/12），經(jīng)Fisher確切概率法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。MEF2D陽性表達(dá)率在Ⅰ、Ⅱ級(jí)腫瘤組織中為44.4%（4/9），Ⅲ、Ⅴ級(jí)腫瘤組織中為91.7%（11/12），經(jīng)Fisher確切概率法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Survivin和MEF2D蛋白表達(dá)與年齡、性別無關(guān)（P＞0.05）。見附表。

圖1 Survivin和MEF2D蛋白在皮內(nèi)痣組織和黑色素瘤組織中的表達(dá) （免疫組織化學(xué)×400）

2.3 黑色素瘤組織中Survivin和MEF2D蛋白的表達(dá)

Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，皮內(nèi)痣組織未檢測(cè)到Survivin蛋白表達(dá)或表達(dá)極弱，而黑色素瘤組織中Survivin不同程度表達(dá)；皮內(nèi)痣組織MEF2D蛋白表達(dá)極弱，而黑色素瘤組織中MEF2D蛋白呈不同程度高表達(dá)。

使用Image-J軟件分析Survivin和MEF2D蛋白相對(duì)內(nèi)參表達(dá)量灰度值。圖2中1的Survivin相對(duì)表達(dá)量為（0.155±0.009），2為（1.117±0.016），兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=90.770，P=0.000）；3的Survivin相對(duì)表達(dá)量為（0.277±0.032），4為（1.955±0.045），兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=52.630，P=0.000）；5 的 Survivin 相對(duì)表達(dá)量為（0.741±0.042），6為（1.528±0.096），兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.470，P=0.000）。1的 MEF2D相對(duì)表達(dá)量為（0.707±0.064），2為（1.612±0.083），兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.960，P=0.000）；3的 MEF2D相對(duì)表達(dá)量為（0.728±0.047），4為（1.740±0.076），兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=19.620，P=0.000）；5的 MEF2D相對(duì)表達(dá)量為（0.869±0.053），6為（2.015±0.077），兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=21.230，P=0.000）。見圖 2、3。

圖2 Survivin、MEF2D蛋白在黑色素瘤和皮內(nèi)痣組織的表達(dá)

圖3 Survivin、MEF2D蛋白在黑色素瘤和皮內(nèi)痣組織中的表達(dá)水平比較 （±s）

2.4 黑色素瘤患者Survivin與MEF2D蛋白表達(dá)的相關(guān)性

21例黑色素瘤患者中Survivin和MEF2D表達(dá)均陽性者12例，均陰性者4例；Survivin表達(dá)陽性，MEF2D表達(dá)陰性者3例；Survivin表達(dá)陰性，MEF2D表達(dá)陽性者2例。Survivin與MEF2D蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.447，P=0.042）。

3 討論

近年來，中國每年新增黑色素瘤患者2萬余例，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[6]。晚期黑色素瘤患者由于手術(shù)療效不佳，且對(duì)放化療不敏感，導(dǎo)致其5年生存率偏低。既往研究發(fā)現(xiàn)，放化療主要是通過誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡起到殺傷作用，治療不敏感的原因是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生凋亡抵抗，因此發(fā)現(xiàn)黑色素瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)基因?qū)ζ浒邢蛑委熆赡軙?huì)起到關(guān)鍵作用。

Survivin是凋亡抑制蛋白IAPs家族中抗凋亡能力最強(qiáng)的蛋白之一，目前廣泛高表達(dá)于各種腫瘤，如肺癌、口腔癌和肝癌等[7-9]。Survivin在腫瘤中呈高表達(dá)且可以抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、增殖及對(duì)化療的耐藥性。Survivin被認(rèn)為是多種腫瘤的新型標(biāo)志物，用來協(xié)助腫瘤早期診斷、評(píng)估患者進(jìn)展及預(yù)后。CARPI等[10]發(fā)現(xiàn)，通過寡脫氧核苷酸分子信標(biāo)靶向Survivin mRNA達(dá)到抗腫瘤作用。本研究發(fā)現(xiàn)，Survivin在黑色素瘤組織中陽性率為71.4%，而在皮內(nèi)痣組織中未見表達(dá)。同時(shí)，在Ⅰ、Ⅱ期黑色素瘤中Survivin陽性表達(dá)率為33.3%，而在Ⅲ、Ⅳ期黑色素瘤中陽性表達(dá)率為83.3%，提示隨著病理分期增加Survivin陽性率有所升高。此外，通過Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)黑色素瘤組織中Survivin蛋白表達(dá)高于皮內(nèi)痣組織。

MEF2是轉(zhuǎn)錄因子MADS-box調(diào)節(jié)家族中的一員，MEF2家族包括MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D[11]。既往研究發(fā)現(xiàn)，MEF2D能增加肝細(xì)胞癌增殖能力，在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要意義[12]。此外，MEF2D在肺癌和神經(jīng)元細(xì)胞中發(fā)揮抗凋亡作用[5]。MEF2D除了在實(shí)體腫瘤中發(fā)揮抗凋亡作用，與白血病的發(fā)生也存在明顯聯(lián)系[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，MEF2D在黑色素瘤組織中陽性率為76.2%，而在皮內(nèi)痣組織中陽性率為20.0%。同時(shí)，在Ⅰ、Ⅱ期黑色素瘤中MEF2D陽性率為44.4%，而在Ⅲ、Ⅳ期黑色素瘤中陽性率為91.7%，提示隨著病理分級(jí)增加MEF2D陽性表達(dá)率升高。Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)黑色素瘤組織中MEF2D蛋白表達(dá)高于皮內(nèi)痣組織。本研究中發(fā)現(xiàn)，MEF2D與Survivin蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，提示MEF2D與Survivin可能存在調(diào)控關(guān)系，但具體調(diào)節(jié)過程及機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

近年來，分子靶向治療在很多腫瘤中取得突破性進(jìn)展。本研究證實(shí)，黑色素瘤組織中MEF2D、Survivin異常高表達(dá)，且與病理分級(jí)存在密切聯(lián)系，以兩者作為靶點(diǎn)對(duì)黑色素瘤進(jìn)行綜合治療將會(huì)取得更好的療效，為黑色素瘤治療提供新思路。