辛小雪，王雪香，李明宇，郭紅艷，王曉潔，蘇 鈦，徐 萍，程 瑾

（1.北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2.國(guó)家林業(yè)和草原局 野生動(dòng)植物保護(hù)與自然保護(hù)區(qū)管理司，北京100714；3.云南省藥物研究所，云南昆明 650111；4.北京延慶區(qū)果品服務(wù)中心，北京 102100）

石斛屬Dendrobium為蘭科Orchidaceae多年生草本附生植物，全世界有1 500～2 000種，廣泛分布于亞洲熱帶、亞熱帶地區(qū)以及大洋洲［1-2］。在中國(guó)，石斛屬植物主要分布于華南、西南和華東地區(qū)，常用的藥用栽培石斛有30余種［3-4］。其中鐵皮石斛Dendrobium officinale作為藥用價(jià)值較高的一種，因具有益胃生津、滋陰清熱的功效，其新鮮或干燥莖被單列收載于2015版《中華人民共和國(guó)藥典》中，以區(qū)別于其他藥用石斛［5］?，F(xiàn)代研究表明，鐵皮石斛在提高免疫力，抗腫瘤，降血糖血壓，抗疲勞，促消化，抗肝損傷等方面有顯著功效［6-8］。近年來(lái)，鐵皮石斛的人工繁育和培植技術(shù)取得了一系列的進(jìn)展［9-10］，并在云南、浙江、安徽、福建、廣西、貴州等地開(kāi)展了規(guī)范化人工大棚栽培和生態(tài)化的仿野生種植，其栽培品已成為與野生鐵皮石斛藥用成分指標(biāo)相近的絕佳替代品。鐵皮石斛常以莖入藥，其主要功能成分為多糖、黃酮類、酚類、聯(lián)芐類、菲類、氨基酸、礦質(zhì)元素等［11-14］。其中多糖是鐵皮石斛重要的功能活性物質(zhì)，酚類和黃酮類化合物含量也被認(rèn)為與自由基清除能力有顯著相關(guān)性，具有抗氧化，抗腫瘤的藥理活性［15-17］。隨著鐵皮石斛多樣性產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)，鐵皮石斛花因具有與莖相似的多糖、黃酮類、有機(jī)酸類和萜類等資源性成分和功效而逐漸被關(guān)注［18-20］。但相關(guān)研究多限于花中單一活性成分的提取或水提物的功能鑒定，對(duì)花中主要化學(xué)成分的積累及分布研究相對(duì)較少，使鐵皮石斛花產(chǎn)品停留在初加工水平，造成了資源浪費(fèi)。本研究通過(guò)對(duì)鐵皮石斛花苞期、微開(kāi)期及盛花期3個(gè)不同花期及盛花期花被、合蕊柱和子房3個(gè)不同花部位的多糖、總黃酮、總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的研究，旨在探討鐵皮石斛花的活性成分組成，確定鐵皮石斛花的最佳采收期及最佳采收部位，進(jìn)一步優(yōu)化鐵皮石斛花產(chǎn)品的精加工工藝。

1 材料與方法

1.1 植物材料

鐵皮石斛花樣品采自廣西樂(lè)業(yè)縣雅長(zhǎng)蘭科植物國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)鐵皮石斛種植基地，分別采集處于花苞期、微開(kāi)期、盛花期的鐵皮石斛花鮮品，以及盛花期鐵皮石斛花花被、合蕊柱和子房3個(gè)部位的鮮品。所有鮮品均于80℃干燥箱中干燥4 h后得干燥樣品，鐵皮石斛不同花期及盛花期不同花部位的干燥樣品經(jīng)粉碎后過(guò)60目篩，得各處理待測(cè)樣品。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑 D-無(wú)水葡萄糖（上海源葉生物科技有限公司）；蘆丁（北京索萊寶科技有限公司）；沒(méi)食子酸、硝酸鋁（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、碳酸鈉、濃硫酸（北京化工廠）；氫氧化鈉（西隴科學(xué)股份有限公司）；苯酚［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司］。其中D-無(wú)水葡萄糖、蘆丁為色譜純，其余為分析純。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器 電子分析天平ML 104（梅特勒-托利多儀器有限公司）；恒溫水浴鍋DZKW-D-2（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)Bio Mate 3S［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司］；真空泵GM-0.33A（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀IKA RV10（艾卡儀器設(shè)備有限公司）；恒溫循環(huán)器HX-1050［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司］；超聲波清洗器KQ 5200E（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

采用2015版《中華人民共和國(guó)藥典》［5］中水溶醇沉法提取花中多糖成分，苯酚-硫酸法測(cè)定多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。參照唐靜月等［21］總黃酮測(cè)定方法，以體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇超聲波法提取花中總黃酮成分，亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法測(cè)定總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。參考GB/T 31740.2-2015《茶制品第2部分：茶多酚》，以體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇超聲波法提取花中總酚成分，采用福林酚法測(cè)定其總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

鐵皮石斛花不同花期及盛花期不同部位的多糖、總黃酮、總酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并運(yùn)用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛花不同花期及盛花期不同部位花形態(tài)特征

鐵皮石斛花苞期花為綠色，花瓣完全包裹在內(nèi)（圖1A）；微開(kāi)期花瓣微張，向內(nèi)傾斜（圖1B）；盛花期花完全張開(kāi)，花為黃色，花各部位清晰可見(jiàn)（圖1C）。鐵皮石斛盛花期各部位解剖如圖1D所示，其雌蕊和雄蕊合生特化成合蕊柱，為蘭科植物所特有的結(jié)構(gòu)；花萼、花瓣及唇瓣統(tǒng)稱為花被。

圖1 鐵皮石斛鮮花不同花期及盛花期花解剖結(jié)構(gòu)Figure 1 Dendrobium officinale flower at different flowering stages and anatomic structures at flourishing flowering stage

2.2 鐵皮石斛花不同花期及盛花期不同部位多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

如表1和表2所示：從花苞期到微開(kāi)期再到完全開(kāi)放的盛花期過(guò)程中，鐵皮石斛花中多糖成分逐漸積累，其中盛花期多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為61.5 mg·g－1，顯著高于花苞期和微開(kāi)期；微開(kāi)期為55.3 mg·g－1，花苞期為45.6 mg·g－1，二者無(wú)顯著差異。盛花期花不同部位多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定結(jié)果顯示：花被中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為64.5 mg·g－1，合蕊柱次之為61.2 mg·g－1，二者無(wú)顯著差異。子房與花被、合蕊柱的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)具有顯著差異（P＜0.05），僅為52.3 mg·g－1。結(jié)果表明鐵皮石斛花不同花期多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為盛花期＞微開(kāi)期＞花苞期；盛花期花不同部位多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為花被＞合蕊柱＞子房。

2.3 鐵皮石斛花不同花期及盛花期不同部位總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

如表1和表2所示：鐵皮石斛不同花期總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)在花苞期最高，為19.9 mg·g－1，盛花期為19.2 mg·g－1， 二者無(wú)顯著差異； 微開(kāi)期最低， 為 17.4 mg·g－1， 與花苞期和盛花期存在顯著差異（P＜0.05）。 盛花期鐵皮石斛花被中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高（24.2 mg·g－1）， 其次是合蕊柱， 為 14.3 mg·g－1， 子房最低，為11.4 mg·g－1。因此鐵皮石斛花不同花期總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為花苞期＞盛花期＞微開(kāi)期。盛花期花不同部位總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為花被＞合蕊柱＞子房，三者差異顯著。

2.4 鐵皮石斛花不同花期及盛花期不同部位總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

鐵皮石斛花中酚類物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨花的逐漸開(kāi)放而積累，盛花期花中總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大值為22.2 mg·g－1，顯著高于微開(kāi)期和花苞期；微開(kāi)期為 19.6 mg·g－1， 花苞期最低， 為 18.5 mg·g－1（表 1）。盛花期鐵皮石斛花不同部位總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在顯著差異（P＜0.05），其中花被最高，為26.5 mg·g－1，合蕊柱次之，子房最低，總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別是19.2和13.9 mg·g－1（表2）。結(jié)果表明鐵皮石斛花不同花期總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為盛花期＞微開(kāi)期＞花苞期；盛花期花不同部位總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為花被＞合蕊柱＞子房。

表1 不同花期鐵皮石斛全花多糖、總黃酮及總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 1 Contents of polysaccharides,total flavonoids and total phenols in entire flower of Dendrobium officinale at different flowering stages

表2 盛花期鐵皮石斛花不同部位多糖、總黃酮及總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 2 Contents of polysaccharides,total flavonoids and total phenols in different parts of D.officinale flower at flourishing flowering stage

3 討論

鐵皮石斛花中多糖隨花的開(kāi)放而逐漸積累，表現(xiàn)在盛花期花多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于微開(kāi)期，高于花苞期，這種規(guī)律性與黃秀紅等［22］的研究結(jié)果相同。鐵皮石斛花不同部位均含有一定的多糖成分，其中花被中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高。鐵皮石斛花中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)雖與莖中差異較大［19,23］，但花中多糖的單糖組成與莖相似，且花中多糖有非常強(qiáng)的DPPH自由基和ABTS自由基清除能力［20,24］。

鐵皮石斛莖、葉、花中均含有大量黃酮類化合物，并具有清除自由基、抗氧化和降血糖等藥理活性，其中花中黃酮類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)及抗氧化能力顯著高于莖［18,23,25-27］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛花苞期及盛花期花中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，并高于黃秀紅等［22］的測(cè)定結(jié)果，但低于龔慶芳等［23］的測(cè)定結(jié)果，這可能與品種及提取方法不同有關(guān)。鐵皮石斛各花期總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著高于其他石斛花中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，如球花石斛Dendrobium thyrsiflorum，鼓槌石斛D.chrysotoxum［22,28］。因此若以黃酮類物質(zhì)作為藥用產(chǎn)品開(kāi)發(fā)，可優(yōu)先選擇鐵皮石斛花作為提取材料，以花苞期或盛花期作為最佳采收期。

酚類是植物中的天然抗氧化劑，也是鐵皮石斛的藥用活性成分之一，具有較強(qiáng)的清除自由基和抗衰老的功效［23,29-30］。鐵皮石斛花中總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨花的開(kāi)放而逐漸積累，盛花期最高，花被是酚類物質(zhì)的主要積累部位。有研究發(fā)現(xiàn)：鐵皮石斛花中總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)與莖中相近，抗氧化作用也無(wú)較大差異［23］，因此若以總酚作為鐵皮石斛的目標(biāo)產(chǎn)物，花材料可作為莖的補(bǔ)充材料加以利用，盛花期為花的最佳采收期，花被為精加工產(chǎn)品的最佳采收部位。此外鐵皮石斛花中總酚與總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高且相近，使得鐵皮石斛花具有很強(qiáng)的抗氧化活性，這可能也是鐵皮石斛花具有 “滋陰”功效的原因之一［31］，但花中酚類與黃酮類物質(zhì)的具體活性成分還有待進(jìn)一步研究。

雅長(zhǎng)鐵皮石斛2014年成為國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品，這是廣西樂(lè)業(yè)縣迄今為止唯一獲得國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)的產(chǎn)品。從節(jié)約生產(chǎn)成本及藥用效益最大化的方面考慮，建議選擇盛花期作為鐵皮石斛花的最佳采收期；盛花期花被作為最佳采收部位。多糖，黃酮類及酚類化合物是鐵皮石斛花中的主要活性組分，其中花中總黃酮及總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，可作為藥用組分進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研究。鐵皮石斛花中活性組分含量受品種、生長(zhǎng)地和生長(zhǎng)周期的影響，鐵皮石斛栽培品種多，栽植范圍廣，有關(guān)鐵皮石斛種源和栽培方法與其活性組分積累的關(guān)系值得開(kāi)展深入研究。