李凱 羅云波 許文濤

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083；2. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)（食用）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

核酸作為重要的生物大分子，在生物生命活動(dòng)中具有重要的作用。核酸分子除了能夠攜帶遺傳信息以外，單鏈DNA還能自我折疊成復(fù)雜的三級(jí)結(jié)構(gòu)，成為具有特異性識(shí)別能力以及催化活性的功能核酸，其中包括核酸適配體（Aptamer）、脫氧核酶（DNAzyme）等。功能核酸的發(fā)現(xiàn)，為生物傳感、生物成像提供了廣闊的發(fā)展空間，已經(jīng)在包括檢測(cè)、分離、材料科學(xué)、納米技術(shù)、材料合成、體內(nèi)成像及醫(yī)療領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用［1-8］。

大多數(shù)的脫氧核酶具有金屬離子依賴性的特點(diǎn)，只有在特定金屬離子存在的情況下才展現(xiàn)出催化活性，使DNA片段在特定位置上發(fā)生剪切。第一個(gè)脫氧核酶是于1994年被篩選出來(lái)，Pb2+存在下能夠特異切割RNA［9］。隨后其他金屬離子依賴性的核酶也逐漸被人們篩選出來(lái)，如鎘離子脫氧核酶（Cd16 DNAzyme）［10］、鉻離子脫氧核酶（Ce13d DNAzyme）［11］、銅離子脫氧核酶（PSCu10 DNAzyme）［12］、鉛離子脫氧核酶（GR5 DNAzyme，8-17 DNAzyme）［13］及 10-23 脫氧核酶等。

10-23脫氧核酶（10-23 DNAzyme，DZ13）是一種能特異結(jié)合并切割RNA 分子的功能核酸DNA，具有高效的催化降解能力。1997年，Santoro 等［14］建立了體外篩選系統(tǒng)，從隨機(jī)的DNA分子庫(kù)中篩選出對(duì)與Mg2+依賴性的脫氧核酶，由于選自第10 輪擴(kuò)增的第23 個(gè)克隆，故被稱為10-23 脫氧核酶。由于DZ13高效識(shí)別與切割能力，其介導(dǎo)的生物傳感器得到了廣泛的應(yīng)用，主要涉及體內(nèi)的靶向治療、生物成像及生物傳感等方面。本文將介紹DZ13介導(dǎo)的生物傳感器的研究進(jìn)展，旨在為未來(lái)使用10-23脫氧核酶搭建新型快捷生物傳感器奠定理論基礎(chǔ)。

1 DZ13介紹

1.1 DZ13篩選技術(shù)

DZ13的篩選技術(shù)是指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技 術(shù)（Systematic evolution of Ligands by exponential enrichment，SELEX）。首先需要建一個(gè)包含1013-1016隨機(jī)序列的DNA庫(kù)，這些序列中間會(huì)嵌入一小段RNA作為剪切位點(diǎn)，位點(diǎn)兩邊的結(jié)合序列為隨機(jī)區(qū)域。通過(guò)將這些序列與靶標(biāo)金屬離子一起孵育，一小部分序列會(huì)與金屬離子結(jié)合并且切割RNA位點(diǎn)。切掉的序列通過(guò)兩次PCR反應(yīng)獲得全長(zhǎng)。1995年，Breaker和Joyce［15］想通過(guò)建立體外篩選系統(tǒng)篩選出Mg2+特異性的脫氧核酶，在原有的基礎(chǔ)上，篩選出能夠切割RNA的通用型DZ13，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選出了DZ13能夠在Mg2+、Mn2+、Zn2+和Pb2+存在進(jìn)行特異位點(diǎn)切割，而且催化過(guò)程能夠在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境下進(jìn)行，為DZ13在體內(nèi)的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

1.2 DZ13催化結(jié)構(gòu)

DZ13包括催化核心和側(cè)臂兩部分（圖1），催化核心是由15個(gè)脫氧核糖核苷酸組成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，側(cè)臂通過(guò)Waston-Crick堿基配的形式與靶標(biāo)序列進(jìn)行特異性結(jié)合，將環(huán)狀催化核心固定在底物分子催化位點(diǎn)上。10-23脫氧核酶切割位點(diǎn)為R（嘌呤核糖核苷酸）與Y（嘧啶核糖核苷酸）之間的磷酸二酯鍵，在與酶鏈結(jié)合成復(fù)合結(jié)構(gòu)時(shí)，R不進(jìn)行堿基配對(duì)，Y必須與酶鏈形成堿基配對(duì)結(jié)構(gòu)（圖1）。當(dāng)切割位點(diǎn)是A與U時(shí)，接近生理?xiàng)l件下（2 mmol/L MgCl2，150 mmol/L KCl，pH 7.5，37℃）催化效率最高kcat≈0.1 min-1。通過(guò)對(duì)側(cè)臂的設(shè)計(jì)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)含有核糖核苷酸位點(diǎn)的DNA進(jìn)行特異性識(shí)別與切割。

圖1 DZ13結(jié)構(gòu)，酶鏈與RNA底物鏈通過(guò)Watson-Crick堿基配對(duì)結(jié)合［14］

1.3 DZ13活性影響因素

DZ13的催化活性受到多方面因素的影響，為了提高催化效率，研究人員從反應(yīng)條件到對(duì)脫氧核酶內(nèi)部堿基以及機(jī)構(gòu)的改造等方面進(jìn)行大量的研究。

（1）反應(yīng)體系的pH值。在37℃，10 mmol/L Ca2+，3種不同緩沖液（BIS-TRIS 丙烷緩沖液、PIPES緩沖液、EPPS緩沖液）的條件下，10-23脫氧核酶催化活性在pH 6.5-8.5之間呈現(xiàn)對(duì)數(shù)-直線關(guān)系，R2達(dá)到 0.94［16］。（2）二價(jià)金屬陽(yáng)離子。是10-23脫氧核酶啟動(dòng)反應(yīng)的關(guān)鍵因素，起到穩(wěn)定活性過(guò)渡狀態(tài)以及幫助折疊的作用，活性影響排序?yàn)椋篗n2+（EPPS）＞ Pb2+、Mg2+、Ca2+＞ Cd2+（Tris）＞Sr2+、Ba2+＞＞ Zn2+、Co2+［16］。（3）底物結(jié)合區(qū)的長(zhǎng)度與堿基組成。底物結(jié)合區(qū)過(guò)長(zhǎng)及GC含量越多，切割產(chǎn)物不易脫落，會(huì)導(dǎo)致剪切速率的降低。過(guò)短底物不容易結(jié)合，也會(huì)導(dǎo)致剪切效率降低。常用7+7，8+8，9+9等結(jié)合長(zhǎng)度［17］。（4）緩沖液類型。不同類型的緩沖液會(huì)影響二價(jià)金屬陽(yáng)離子對(duì)10-23脫氧核酶的作用，Mn2+存在的N-（2羥乙基）哌嗪-N-丙磺酸緩沖液（EPPS）相對(duì)于其他金屬離子能夠使10-23脫氧核酶具有較好的剪切活性，但在三羥甲基氨基甲烷（Tris）緩沖液中幾乎沒有剪切活性。Cd2+在Tris 緩沖液中可使10-23脫氧核酶有適度活性，但在 EPPS 緩沖液中對(duì)活性的影響極微［16，18］。（5）溫度。大多數(shù)研究顯示溫度在37℃條件下10-23脫氧核酶可發(fā)揮較好的活性。

1.4 DZ13結(jié)構(gòu)改造對(duì)酶活性影響

Wang等［19］發(fā)現(xiàn)用核苷類似物替換到DZ13 A9位置上，能夠明顯的提高剪切率，并且得出活性影響關(guān)系：氨基酸＞羥基＞羥基苯甲酸＞苯基。將LNA（Locked nucleic acid）加入10-23脫氧核酶的結(jié)合臂中形成LNAzyme，活性會(huì)顯著提高［20-22］；若對(duì)脫氧核酶以及結(jié)合區(qū)域進(jìn)行硫代修飾，穩(wěn)定性會(huì)顯著提高但會(huì)使剪切活性大大降低，在酶鏈兩端進(jìn)行少量硫代修飾可在一定程度上提高穩(wěn)定性的同時(shí)保持大部分的剪切活性［22-23］；若對(duì)3′末端引物倒置連接的胸腺嘧啶脫氧核苷，或者在酶鏈兩端進(jìn)行2-甲氧基修飾可以保持酶鏈具有良好的穩(wěn)定性，末端修飾同時(shí)適當(dāng)延長(zhǎng)結(jié)合區(qū)域可提高剪切活性［22-24］。

2 DZ13介導(dǎo)的光學(xué)傳感器

2.1 比色傳感器

Zhao等［25］報(bào)道了利用DZ13建立了一種恒溫條件下對(duì)RNA進(jìn)行擴(kuò)增以及檢測(cè)的新方法（圖2）。10-23酶鏈包含兩個(gè)與靶標(biāo)RNA結(jié)合臂，發(fā)生剪切后，5′端RNA片段會(huì)作為引物對(duì)10-23酶鏈進(jìn)行復(fù)制，產(chǎn)生雙鏈DNA序列。由于在10-23酶鏈的5′端設(shè)計(jì)了一段含有切刻內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的片段，被內(nèi)切酶剪切之后會(huì)形成新的黏性末端，通過(guò)DNA聚合酶進(jìn)行鏈置換反應(yīng)，通過(guò)3個(gè)循環(huán)可以進(jìn)行信號(hào)放大。產(chǎn)生的單鏈DNA富含G序列，反應(yīng)結(jié)果可以通過(guò)與ABTS2-與雙氧水顯色的手段達(dá)到檢測(cè)的目的，檢測(cè)限為1 fmol/L-100 pmol/L。

圖2 單鏈擴(kuò)增及顯色原理圖［25］

Carter等［26］利用DZ13修飾的納米金離子建立DDZ-AuNP傳感器檢測(cè)登革熱病毒（Dengue viras，DENV）。10-23酶鏈的結(jié)合臂是與DENV基因組RNA特異性序列的互補(bǔ)序列，能夠與靶標(biāo)RNA特異性結(jié)合。整個(gè)反應(yīng)可以分為3個(gè)階段：DDZ識(shí)別并剪切DENA RNA基因組；AuNPs活化；AuNPs聚沉檢測(cè)。當(dāng)存在靶標(biāo)RNA時(shí)，DDZ特異性結(jié)合，在37℃Mg2+存在的情況下進(jìn)行G149位點(diǎn)的剪切，使AuNPs在NaCl存在情況下減少表面斥力作用產(chǎn)生聚集效果，顏色由紅色變成無(wú)色。反之，如果沒有靶標(biāo)RNA存在時(shí)，則沒有顏色的變化呈紅色。

2.2 熒光傳感器

熒光檢測(cè)法作為常用檢測(cè)方法，具有操作簡(jiǎn)單、信號(hào)檢測(cè)方便、原理簡(jiǎn)單以及反應(yīng)快等特點(diǎn)［27］。因此，基于DZ13的熒光傳感器發(fā)展出多種不同類型。2.2.1 基于熒光探針熒光傳感器 Bone等［28］設(shè)計(jì)了一套DNA串聯(lián)結(jié)構(gòu)（DNA-only cascade，DoC），實(shí)現(xiàn)了對(duì)包括金屬離子（Pb2+）、小分子物質(zhì)（dATP）以及靶標(biāo)核酸序列的多重檢測(cè)（圖3）。DoC結(jié)構(gòu)中，10-23酶鏈被輔助連封閉，不具有切割活性。輔助鏈上具有起始反應(yīng)的酶位點(diǎn)，當(dāng)溶液中存在靶標(biāo)物質(zhì)時(shí)，會(huì)催化酶對(duì)輔助鏈上的位點(diǎn)進(jìn)行切割，產(chǎn)生具有活性的10-23酶鏈，會(huì)對(duì)溶液中含有熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)的底物鏈進(jìn)行切割實(shí)現(xiàn)信號(hào)的輸出。該方法能夠識(shí)別單堿基突變的核酸鏈，并且能夠短時(shí)間內(nèi)對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行定量檢測(cè)，該方法檢測(cè)限能夠達(dá)到鉛離子5 nmol/L，核酸5 pmol/L。

圖3 DNA串聯(lián)檢測(cè)方法原理圖［28］

Cha等［29］利用DZ13建立了DZ13介導(dǎo)的DNA馬達(dá)，能夠在碳納米管內(nèi)對(duì)納米材料（CdS）進(jìn)行運(yùn)輸（圖4）。DNA馬達(dá)移動(dòng)的能量來(lái)源是通過(guò)10-23酶鏈對(duì)RNA底物鏈的切割產(chǎn)生。當(dāng)10-23酶鏈與修飾在碳納米管上的RNA底物鏈進(jìn)行結(jié)構(gòu)后，在鎂離子存在的條件下，對(duì)RNA進(jìn)行切割，產(chǎn)生切割片段，并隨后與酶鏈脫離，10-23酶鏈會(huì)繼續(xù)識(shí)別下一條RNA底物，完成一個(gè)循環(huán)。通過(guò)不斷的重復(fù)循環(huán)，實(shí)現(xiàn)了沿碳納米管的移動(dòng)。該方法整個(gè)移動(dòng)過(guò)程是可控的，能夠隨時(shí)停止隨時(shí)開始，通過(guò)選擇具有熒光性質(zhì)的“納米貨物”可以進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。實(shí)驗(yàn)環(huán)境下，觀測(cè)到的DNA馬達(dá)單方向移動(dòng)能夠達(dá)到3 μm，速度能夠達(dá)到1 nm/min。

圖4 DZ13介導(dǎo)的分子馬達(dá)在碳納米管上移動(dòng)以及成像原理［29］

Fan等［30］建立了DZ13-MnO2納米傳感器，高效的實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)基因沉默（圖5）。MnO2納米片吸附上標(biāo)記有Ce6的脫氧核酶，能夠保護(hù)酶鏈不被消化也能有效的進(jìn)入胞內(nèi)。當(dāng)胞內(nèi)存在谷胱甘肽（Glutathione r-glutamyl cysteingl+glycine，GSH） 時(shí)，MnO2還原成Mn2+作為激活離子使10-23脫氧核酶具有活性，對(duì)靶標(biāo)RNA進(jìn)行有效的切割。通過(guò)檢測(cè)熒光實(shí)現(xiàn)對(duì)10-23脫氧核酶遞送過(guò)程的監(jiān)測(cè)。

Todd等［31］建立了 DzyNA-PCR方法，運(yùn)用DZ13對(duì)核酸序列進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)（圖6）。該方法設(shè)計(jì)了特殊的酶鏈引物，其包含靶標(biāo)特異性序列以及10-23核酶的反義互補(bǔ)序列。PCR擴(kuò)增過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生具有活性的10-23核酶擴(kuò)增產(chǎn)物，再與含有熒光基團(tuán)淬滅基團(tuán)的底物結(jié)合并且切割產(chǎn)生熒光信號(hào)，通過(guò)PCR不斷進(jìn)行信號(hào)積累實(shí)現(xiàn)檢測(cè)靶標(biāo)的目的。運(yùn)用該方法檢測(cè)質(zhì)粒DNA能夠?qū)崿F(xiàn)至少6個(gè)數(shù)量級(jí)的擴(kuò)增（R2=0.992）。涉及到人類基因組作為靶標(biāo)時(shí)，最低能夠檢測(cè)到10個(gè)拷貝。

圖5 Ce6-DNAzyme-MnO2系統(tǒng)基因沉默機(jī)制［30］

圖6 DzyNA-PCR技術(shù)擴(kuò)增檢測(cè)核酸序列原理［31］

Tian等［32］設(shè)計(jì)了新型10-23封閉結(jié)構(gòu)，對(duì)靶標(biāo)DNA進(jìn)行檢測(cè)（圖7）。該方法設(shè)計(jì)了長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)，其中包括10-23酶鏈核心序列、10-23互補(bǔ)序列和靶標(biāo)結(jié)合序列3個(gè)部分，通過(guò)自組裝的方式，DZ13催化核心與互補(bǔ)序列結(jié)合進(jìn)行封閉。當(dāng)存在靶標(biāo)DNA序列時(shí)，會(huì)與酶鏈上的互補(bǔ)序列結(jié)合，通過(guò)鏈置換反應(yīng)打開封閉結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生活性中心。進(jìn)一步結(jié)合自淬滅的分子信標(biāo)，并進(jìn)行位點(diǎn)切割釋放熒光信號(hào)。對(duì)于靶標(biāo)DNA檢測(cè)限能夠達(dá)到10 pmol/L，比之前報(bào)道的提高了3個(gè)數(shù)量級(jí)。

Kahan-Hanum 等［33］建立關(guān)于 DZ13用來(lái)檢測(cè)或診斷miRNA介導(dǎo)mRNA的傳感器庫(kù)（圖8），其 中 邏 輯 涉 及 YES、AND、NOT、OR、NAND、ANDNOT、XOR和NOR等，每一個(gè)邏輯門都只有在靶標(biāo)序列出現(xiàn)的情況下才會(huì)發(fā)生10-23酶鏈的切割，產(chǎn)生熒光信號(hào)。而且，該方法在細(xì)胞溶解物及哺乳動(dòng)物細(xì)胞也得到了驗(yàn)證，為10-23核酶相關(guān)的傳感器結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)奠定了大量的理論基礎(chǔ)。

圖7 DZ13介導(dǎo)的靶標(biāo)物質(zhì)識(shí)別以及信號(hào)釋放原理［32］

2.2.2 基于G4聯(lián)體熒光傳感器 Zhao等［25］建立的DZ13溫條件下對(duì)RNA進(jìn)行擴(kuò)增以及檢測(cè)（圖9）。該方法通過(guò)對(duì)其中探針的變更，設(shè)計(jì)出DZ13介導(dǎo)的實(shí)時(shí)熒光RNA檢測(cè)技術(shù)。通過(guò)DZ13、DNA聚合酶和核酸內(nèi)切酶的作用下，實(shí)現(xiàn)RNA的循環(huán)方法以及G4序列的富集。通過(guò)收集熒光信號(hào)值實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)RNA實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)。

Wu等［34］設(shè)計(jì)了一種新型包含G4序列的10-23發(fā)卡結(jié)構(gòu)，并實(shí)現(xiàn)了對(duì)該酶活性的控制（圖10）。酶結(jié)構(gòu)中通過(guò)加入TMPyP4實(shí)現(xiàn)控制，實(shí)驗(yàn)表明DZ13以及G4結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性得到極大的提升，并且TMPyP4的加入降低了10-23酶的催化活性，甚至失去剪切活性。這種結(jié)構(gòu)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)于靶標(biāo)序列剪切的可控性，在基因治療方面具有較大潛力。

2.2.3 金納米材料熒光傳感器 Yehl等［35］將DZ13修飾在金納米顆粒的表面形成金納米酶結(jié)構(gòu)，通過(guò)光控作用在胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)mRNA的切割以及相關(guān)基因的調(diào)控（圖11）。該方法構(gòu)建的DZ13-Gold結(jié)構(gòu)具有很高的穩(wěn)定性，對(duì)核酸酶有較高的抗性，并且對(duì)細(xì)胞具有很小的毒性。DZ13-Gold結(jié)構(gòu)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，通過(guò)532 nm脈沖激光器的照射，使得10-23核酶與金納米顆粒分離到細(xì)胞液中，對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行特意性識(shí)別并剪切。整個(gè)過(guò)程可以通過(guò)熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

圖8 DZ13介導(dǎo)的生物傳感器邏輯門種類

圖9 實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)DZ13介導(dǎo)的RNA擴(kuò)增［25］

3 DZ13介導(dǎo)的電化學(xué)傳感器

近幾十年來(lái)，電化學(xué)傳感器的研究取得的了巨大的進(jìn)步。相比光學(xué)傳感器，電化學(xué)傳感器在檢測(cè)極限以及準(zhǔn)確性上有很大的優(yōu)勢(shì)［36］，并且在設(shè)備小型化以及低背景信號(hào)方面有更多的發(fā)展空間［37］。

圖10 DZ13-G4復(fù)合結(jié)構(gòu)原理圖［34］

圖11 DZ13-AuNP結(jié)構(gòu)圖［35］

Sun等［38］利用DNA連接靠近的原則設(shè)計(jì)了由DZ13引起的靶標(biāo)DNA電化學(xué)檢測(cè)方法（圖12）。該方法中存在兩種探針，識(shí)別探針和捕獲探針。識(shí)別探針上含有10-23核酶序列，當(dāng)靶標(biāo)DNA出現(xiàn)時(shí)，在Tris-HCl條件下，兩者通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合，產(chǎn)生10-23活性結(jié)構(gòu)。接著，環(huán)狀發(fā)卡底物開鏈與DZ13活性中心結(jié)合，并在Mg2+條件下發(fā)生對(duì)發(fā)卡底物鏈的切割，釋放出含有生物素標(biāo)記的片段。該片段被電極表面的捕獲探針結(jié)合，通過(guò)電信號(hào)進(jìn)行輸出。釋放的核酶鏈可以進(jìn)一步結(jié)合其他的靶標(biāo)序列，實(shí)現(xiàn)循環(huán)放大。該方法檢測(cè)可以達(dá)到50 fmol/L，并且能夠檢測(cè)到單堿基的差異。

Gao等［39］構(gòu)建了10-23DZ電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)血清樣本中的Mg2+。首先將5′端修飾硫醇的10-23酶鏈修飾在金電極的表面，溶液中5′端修飾二茂鐵的底物鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則靠近金電極表面。當(dāng)溶液中不存在Mg2+時(shí)，由于二茂鐵的電子傳遞作用會(huì)產(chǎn)生明顯的電流信號(hào)。當(dāng)存在Mg2+時(shí)，底物鏈被10-23酶鏈切割，使二茂鐵遠(yuǎn)離金電極，電信號(hào)減弱。整個(gè)檢測(cè)范圍0.2-5.0 mmol/L，檢測(cè)極限位0.05 mmol/L。

4 DZ13介導(dǎo)傳感器在基因治療方面應(yīng)用

由于10-23DZ對(duì)于RNA序列的高效的剪切作用，其在細(xì)菌基因、癌癥基因以癌癥基因方面的沉默效應(yīng)得到了廣泛的關(guān)注。10-23DZ介導(dǎo)的相關(guān)傳感器具有穩(wěn)定核酶性質(zhì)、提高遞送效率等特點(diǎn)，在體內(nèi)基因治療方面取得了很大的進(jìn)步［40］。

Li等［41］將DZ13與氫氧化鈷納米片（COHN）組成納米傳感器成功的對(duì)3個(gè)腫瘤相關(guān)基因進(jìn)行了沉默（圖13）。利用氨基活化的氫氧化鈷納米片作為DZ13的傳送載體，其中氫氧化鈷作為氧化物能夠被胞內(nèi)的谷胱甘肽還原成二價(jià)Co2+，Co2+作為誘導(dǎo)離子激活DZ13，完成對(duì)腫瘤相關(guān)mRNA剪切，實(shí)現(xiàn)該基因的沉默。將修飾羅丹明的DZ13-COHN對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)可以通過(guò)共聚焦熒光成像觀測(cè)傳感器在胞內(nèi)情況。

圖12 靶標(biāo)DNA序列的識(shí)別及電化學(xué)檢測(cè)原理圖［38］

圖13 DNAzymes-CONH納米系統(tǒng)的原理圖［41］

Dass等［42］通過(guò)將DZ13與殼聚糖結(jié)合在一起組成了DZ13-殼聚糖納米傳感器，成功建立一套關(guān)于DZ13高效安全的遞送系統(tǒng)，完成了骨肉瘤細(xì)胞中相關(guān)基因的沉默（圖14）。其中DZ13-殼聚糖納米傳感器大小為350 nm，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部時(shí)間為48 h。將羅丹明標(biāo)記在DZ13上，通過(guò)熒光電鏡觀察可以確定傳感器進(jìn)入細(xì)胞的效率以及DZ13保持的完整性，整個(gè)體系室溫下就可以進(jìn)行，傳感器穩(wěn)定性良好，室溫條件一個(gè)月內(nèi)保持活性不變。

圖14 DNAzyme-殼聚糖納米結(jié)構(gòu)胞內(nèi)顯色圖［42］

5 結(jié)語(yǔ)

DZ13作為一種功能性核酸分子，基本性質(zhì)是RNA特異性切割工具，具有高效的催化能力、特異性的底物結(jié)合能力和較為穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)等。利用其本身性質(zhì)加上與納米材料相結(jié)合，組成具有多功能的納米工作，可以在生物成像、生物傳感以及相關(guān)疾病治療方面廣泛應(yīng)用。

現(xiàn)階段，DZ13為主的應(yīng)用主要涉及新型基因治療藥物開發(fā)方面，遞送方式主要是通過(guò)構(gòu)建質(zhì)粒的方式。未來(lái)借助DZ13功能化的納米材料，可進(jìn)行納米靶向藥物遞送，推進(jìn)癌癥、腫瘤等相關(guān)疾病的治療。然而，DZ13介導(dǎo)的生物傳感器應(yīng)用相對(duì)較少，信號(hào)輸出的方式也較為單一，電化學(xué)方面、光磁方面應(yīng)用較少。通過(guò)將DZ13與電化學(xué)以及納米材料相結(jié)合搭建新型傳感器，可以有效的擴(kuò)大靶物質(zhì)檢測(cè)范圍，提高檢測(cè)以及檢測(cè)極限。并且，DZ13與靶物質(zhì)結(jié)合的空間構(gòu)象機(jī)制尚不清楚，后續(xù)可探討其結(jié)合方式是誘導(dǎo)形成還是剛性構(gòu)，通過(guò)比較不同靶物質(zhì)的結(jié)合構(gòu)象的差異機(jī)制，以此為依據(jù)進(jìn)行DZ13的序列裁剪以開發(fā)適合不同靶物質(zhì)的特異性更高、親和力更強(qiáng)的DZ13衍生核酶。