卓曉軒 樊琳琳 安星宇 郭敬瑋 楊睿 曾千春 羅瓊

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云南地方品種子預(yù)44中一個新的抗稻瘟病基因的定位

卓曉軒#樊琳琳#安星宇#郭敬瑋 楊睿 曾千春 羅瓊*

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 省部共建云南生物資源保護與利用國家重點實驗室/云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點實驗室, 昆明 650201;#共同第一作者;*通訊聯(lián)系人, E-mail: qiongbf@aliyun.com)

【目的】子預(yù)44是具有廣譜持久稻瘟病抗性的云南地方粳稻品種。為了揭示子預(yù)44廣譜持久抗瘟機制并在抗稻瘟病育種中進(jìn)行有效利用，【方法】利用江南香糯與子預(yù)44雜交構(gòu)建的遺傳群體及分離自云南羅平的稻瘟病菌株LP36進(jìn)行子預(yù)44的抗性遺傳分析和抗性基因定位?！窘Y(jié)果】子預(yù)44對LP36的抗性為單顯性基因控制，暫定名為(t)，它位于水稻第4染色體長臂上SSR標(biāo)記RM5503與RM3276之間約318 kb區(qū)間內(nèi)。【結(jié)論】(t)為新的抗稻瘟病基因。研究結(jié)果為子預(yù)44的育種利用和(t)基因的克隆提供了重要信息。

水稻；稻瘟病；抗稻瘟病基因；基因定位

由稻瘟病菌（）引起的稻瘟病是水稻最具毀滅性的病害之一，分布范圍極廣，嚴(yán)重威脅世界糧食安全，全球每年因稻瘟病造成的糧食損失足以養(yǎng)活6千萬人口[1]。國內(nèi)外對稻瘟病的防治進(jìn)行了大量調(diào)查和廣泛深入的研究，取得了可喜的成績和巨大進(jìn)步[2]。目前，稻瘟病的防治措施主要包括抗病品種選育、化學(xué)防治和栽培管理，而利用水稻自身的抗病基因培育抗病品種是防治稻瘟病最經(jīng)濟有效的方法[3]。由于水稻基因組學(xué)研究的快速發(fā)展，2006年以后，鑒定和克隆的抗稻瘟病基因大量增加。迄今為止，水稻中報道的主效抗稻瘟病基因已超過100個[4]，已經(jīng)克隆的基因有26個，包括[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]、[17]、[18]、[3]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]、[27]和[28]。這些基因分別屬于核苷酸結(jié)合位點和富含亮氨酸的重復(fù)序列(nucleotide-binding site and leucine-rich repeats，NBS-LRR)家族、絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(Serine/ Threonine specific Protein Kinase，STK)家族、脯氨酸富含蛋白、C2H2類轉(zhuǎn)錄因子家族，主要分布在水稻第1、6和11染色體上。相比秈稻，粳稻稻瘟病抗性普遍較弱，抗性資源缺乏[9]，目前克隆的抗稻瘟病基因主要來自秈稻抗性資源。

子預(yù)44是云南地方品種麻早谷與城堡2號雜交選育而成的高原粳稻。張錦文等[29]于2004－2007年在云南宜良稻瘟病高發(fā)區(qū)進(jìn)行了子預(yù)44稻瘟病抗譜鑒定。子預(yù)44對6群16個稻瘟病菌生理小種(ZA1、ZA49、ZA57、ZA61、ZB1、ZB13、ZB17、ZB25、ZC1、ZC3、ZC13、ZC15、ZE1、ZE3、ZF1和ZG1)表現(xiàn)抗性；2012年，我們在宜良稻瘟病高發(fā)區(qū)對子預(yù)44進(jìn)行苗期自然接種加誘發(fā)接種(將上年采集于宜良發(fā)病田塊的感病秸稈與當(dāng)年發(fā)病田塊的新鮮稻瘟病植株形成的天然混合菌株撒蓋在3~4葉期幼苗上)進(jìn)行田間抗性鑒定，子預(yù)44仍表現(xiàn)高抗稻瘟病[30]。此外，在稻瘟病嚴(yán)重發(fā)生的江蘇揚州(2014年)、海南陵水(2015年)、云南羅平和湖北恩施(2017年)，子預(yù)44均表現(xiàn)高抗稻瘟病(未發(fā)表資料)。子預(yù)44為深入研究粳稻的廣譜持久稻瘟病抗性分子遺傳機制帶來了契機。

我們在子預(yù)44中鑒定了抗不同稻瘟病菌株的主效基因(t)[31]、(t)[32]、(t)[33]和微效基因[34]。本研究利用感病品種江南香糯與子預(yù)44雜交構(gòu)建的F2群體，鑒定了一個位于水稻第4染色體長臂上、抗稻瘟病菌株LP36的抗稻瘟病基因。這也是在第4染色體上定位的第一個抗瘟主效基因。這為進(jìn)一步克隆該基因奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 水稻材料和菌株

水稻材料包括子預(yù)44、江南香糯、日本晴以及用于抗性遺傳分析和基因定位的子預(yù)44/江南香糯F2群體。稻瘟病菌株LP36由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)何月秋教授課題組提供。

1.2 水稻幼苗培育

挑選發(fā)育良好、飽滿無病的子預(yù)44，江南香糯及江南香糯與子預(yù)44雜交獲得的F2代種子，用75%的酒精消毒2 min，再用20%的次氯酸鈉消毒40 min，清水漂洗后，水中浸泡24 h，讓種子充分吸漲，然后放入37℃恒溫箱中催芽。將萌發(fā)的種子放入96孔育苗盤，用清水養(yǎng)至其根長約10 cm，再換成營養(yǎng)液培養(yǎng)，3~4葉期幼苗用于接種。

1.3 稻瘟病菌孢子懸浮液制備及接種鑒定

將濾紙片保存的菌株置于馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g/L煮爛，兩層紗布過濾，葡萄糖20 g/L，瓊脂13 g/L)上，28℃活化培養(yǎng)3~4 d，待菌落長出后，挑少量菌絲塊置于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g/L煮爛，兩層紗布過濾，葡萄糖20 g/L)上，于恒溫?fù)u床上(28℃、180 r/min)培養(yǎng)3 d，吸取800 μL菌液至番茄燕麥培養(yǎng)基(番茄汁200 mL/L，燕麥40 g/L，燕麥加水煮爛，兩層紗布過濾，殘渣搗碎機打細(xì)過濾，淀粉18 g/L，瓊脂粉18 g/L)上，用涂布棒將菌液均勻涂于培養(yǎng)基表面，28℃下光照培養(yǎng)4 d，用無菌水洗下孢子，濾布(Miracloth神奇濾布475855)過濾，將菌液的孢子濃度調(diào)至2×105個/mL，加入4‰明膠配成孢子懸浮液。

孢子懸浮液噴霧接種3~4葉期的水稻幼苗。接種后的水稻幼苗在28℃、濕度90%的培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培育24 h。24 h后保持溫度和濕度不變，12 h光照/12 h黑暗培養(yǎng)5~7 d后進(jìn)行表型鑒定和抗性評價。

Z?子預(yù)44；J?江南香糯；N?日本晴。

Fig. 1. Phenotypes of Ziyu 44, Jiangnanxiangnuo and Nipponbare inoculated with.isolate LP36.

1.4 基因組DNA提取及PCR擴增

基因組DNA提取采用CTAB法。PCR體系(20 μL) 包含DNA模板(10 ng/μL) 2 μL，前后引物(10 ng/μL) 各0.5 μL, 10×緩沖液2.5 μL，dNTPs 2 μL，酶0.4 μL，加ddH2O補足至20 μL。PCR程序如下：94℃下預(yù)變性5 min，94℃下變性30 s，58℃下(或參考引物序列適當(dāng)改變溫度)退火30 s，72℃下延伸30 s(根據(jù)產(chǎn)物大小適當(dāng)改變時間)，34個循環(huán)；72℃下延伸7 min。PCR產(chǎn)物用4%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，紫外照膠儀(SmartGel II)進(jìn)行拍照記錄。

1.5 定位區(qū)間內(nèi)候選基因的鑒定

根據(jù)水稻基因組注釋項目(Rice Genome Annotation Project, http://rice.plantbiology.msu.edu/ index. shtml)的基因預(yù)測和功能注釋結(jié)果對定位區(qū)間內(nèi)候選基因進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 子預(yù)44對稻瘟病菌株LP36的抗性鑒定及遺傳分析

稻瘟病菌株LP36噴霧接種子預(yù)44、江南香糯和日本晴3~4葉期幼苗，5~7 d后進(jìn)行抗性鑒定。子預(yù)44表現(xiàn)為高抗稻瘟病菌株LP36，江南香糯和日本晴高感(圖1)。

進(jìn)一步利用LP36菌株對子預(yù)44、江南香糯及子預(yù)44與江南香糯雜交獲得的F2群體進(jìn)行噴霧接種和抗性評價。F2代群體抗感性狀分離明顯（圖2），149株F2群體中鑒定出明顯感病的單株33株，抗、感性狀分離符合3∶1的分離比（χc2﹤χ20.05,1=3.84,表1），即子預(yù)44對稻瘟病菌株LP36的抗性屬于單基因控制的顯性遺傳。將該基因暫定名為(t)。

Z?子預(yù)44；J?江南香糯；R?F2群體抗病單株；S?F2群體感病單株。

Fig. 2. Phenotypes of parents and F2plants inoculated with.isolate LP36.

2.2 Pi-zy4(t)的精細(xì)定位

采用CTAB法分單株提取全部感病單株及部分抗病單株基因組DNA。每條染色體上選取2對（長短臂各一對）在親本子預(yù)44、江南香糯間呈現(xiàn)較好多態(tài)性的SSR引物，先對10個感病單株和10個抗病單株進(jìn)行性狀連鎖分析。發(fā)現(xiàn)位于第4染色體長臂上的SSR標(biāo)記RM5503（物理位置30.76 Mb）與抗感性狀存在明顯的連鎖關(guān)系。通過子預(yù)44和江南香糯兩親本間多態(tài)性的引物進(jìn)行連鎖分析，初步把(t)定位于水稻第4染色體長臂上（圖3）。

進(jìn)一步用稻瘟病菌株LP36接種317個單株組成的F2群體，又鑒定出了明顯感病的單株105株，共得到138株感病單株。根據(jù)初步定位的結(jié)果，我們對位于水稻第4染色體長臂上RM5503附近的SSR標(biāo)記進(jìn)行親本子預(yù)44和江南香糯間多態(tài)性分析(包括RM5503)，獲得揭示兩親本間多態(tài)性的引物有25對。用這25對多態(tài)性SSR引物對F2群體中鑒定出的138個感病單株進(jìn)行連鎖分析，發(fā)現(xiàn)SSR標(biāo)記RM3276(物理位置31.08 Mb)和SSR標(biāo)記RM5503(物理位置30.76 Mb)與感病性狀緊密連鎖，分別有一個交換單株；SSR標(biāo)記RM17450(物理位置30.88 Mb)與感病性狀共分離(圖3~4)。為此，(t)被定位于水稻第4染色體長臂上SSR標(biāo)記RM5503與RM3276之間約318 kb的范圍內(nèi)。

表1 江南香糯×子預(yù)44的F2群體對LP36的抗性分離情況

圖3 Pi-zy4(t)的精細(xì)定位

Fig. 3. Fine mapping of the(t) locus.

2.3 定位區(qū)間候選基因的預(yù)測

水稻第4染色體長臂上報道了2個數(shù)量抗性位點基因，一個是隱性抗稻瘟病基因(物理位置19.66 Mb)[23]；另一個是顯性抗稻瘟病基因(物理位置31.55 Mb)[27]，與主效抗病基因(t)(物理位置30.76?31.08 Mb)所在位置不同，表明(t)是一新的抗稻瘟病基因。

(t)的定位區(qū)間注釋有40個基因(表2)，這40個基因包含有表達(dá)蛋白、轉(zhuǎn)移酶家族結(jié)構(gòu)域蛋白、萜類合酶、蛋白激酶等。其中，3個預(yù)測的基因?qū)儆谝阎目共』蝾愋?，包括LOC_Os04g51880(編碼GHMP激酶ATP結(jié)合蛋白)、LOC_Os04g51950(編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶HT1)和LOC_ Os04g52140(編碼包含蛋白激酶結(jié)構(gòu)域的蛋白)。

3 討論

植物在生長發(fā)育過程中，會受到真菌、細(xì)菌、病毒、線蟲等病原物的侵襲，表現(xiàn)為抗病或感病，在長期的相互作用、相互選擇、協(xié)同進(jìn)化的過程中，植物逐漸形成了一系列復(fù)雜的防御機制來保護自己。Flor[35]的基因?qū)蚣僬f認(rèn)為在寄主中控制抗病性或感病性的基因與在病原菌中控制無毒性或毒性的基因相互對應(yīng)。這一假說為現(xiàn)在克隆病原菌無毒基因和植物抗病基因，研究植物抗病機制并將其運用于育種，培育高抗植株提供了理論基礎(chǔ)。

基于Flor的基因?qū)蚣僬f已克隆的植物抗病基因大致可分為11種類型：第一類編碼胞內(nèi)的絲蘇氨酸激酶(STK)基因，如番茄的基因[36]；第二類編碼類受體激酶基因，如水稻抗白葉枯基因[34]；第三類編碼N端富含亮氨酸重復(fù)(LRR)的跨膜受體蛋白(LRR-TM)基因，如番茄的基因[37]；第四類編碼毒素還原酶類抗病基因，如玉米抗病基因[38]；第五類編碼類似細(xì)胞表面受體(CSLR)蛋白結(jié)構(gòu)的基因，如番茄中的基因[39]；第六類編碼熱激蛋白基因，如擬南芥的抗煙草花葉病毒基因和[40]；第七類編碼膜錨定蛋白的基因，含有7個跨膜蛋白螺旋(TM)，如大麥抗白粉病基因[41]；第八類編碼未知蛋白基因，如水稻抗白葉枯病基因[42]；第九類編碼脯氨酸富含蛋白，如水稻抗稻瘟病基因[21]；第十類C2H2類轉(zhuǎn)錄因子類型，如水稻基因[28]；第十一類編碼NBS-LRR類抗病基因，這一類家族基因又分為2個亞類：TIR-NBS-LRR，如擬南芥[43]；non- NBS-LRR，如水稻中的基因[7]。水稻中已克隆的26個抗稻瘟病基因除屬于STK結(jié)構(gòu)域，屬于脯氨酸富含蛋白，屬于C2H2類轉(zhuǎn)錄因子類型外，其余23個基因均屬于NBS-LRR結(jié)構(gòu)類型。

Z?子預(yù)44；J?江南香糯；1~22?F2感病單株。

Fig. 4.Segregation of RM5503, RM17450 and RM3276 in F2population.

表2 第4染色體長臂上候選區(qū)間內(nèi)注釋的40個基因

(t)定位區(qū)間注釋的40個基因中，6個基因LOC_Os04g51880、LOC_Os04g51950、LOC_ Os04g52030、LOC_Os04g52090、LOC_Os04g52120和LOC_Os04g52140可作為我們進(jìn)一步研究的首選候選基因。LOC_Os04g51880編碼GHMP激酶ATP結(jié)合蛋白，GHMP基因家族成員參與逆境脅迫信號傳導(dǎo)途徑[44]；LOC_Os04g51950編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶HT1；LOC_Os04g52030編碼鋅指結(jié)構(gòu)域，屬于LSD1亞家族蛋白，LSD1亞家族蛋白與植物免疫反應(yīng)中的過敏反應(yīng)相關(guān)，作為植物程序性細(xì)胞死亡的負(fù)調(diào)控因子[45]；LOC_Os04g52090編碼AP2結(jié)構(gòu)域蛋白，參與植物生長、發(fā)育以及多種生理生化反應(yīng)的信號傳導(dǎo)，如花器官形成、抗病、抗逆、激素響應(yīng)(乙烯等)[46]；LOC_Os04g52120編碼鉀轉(zhuǎn)運蛋白，參與植物抗逆反應(yīng)代謝過程[47]；LOC_ Os04g52140編碼包含激酶結(jié)構(gòu)域的蛋白。LOC_ Os04g52030，LOC_Os04g52090和LOC_Os04g 52120編碼蛋白結(jié)構(gòu)與目前報道的已克隆的植物抗病基因結(jié)構(gòu)均不相同。(t)基因的克隆和功能研究也許會帶來植物防衛(wèi)反應(yīng)新機制的發(fā)現(xiàn)。

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Mapping of a New Rice Blast Resistance Gene in Ziyu 44, a Rice Landrace from Yunnan Province, China

ZHUO Xiaoxuan#, FAN Linlin#, AN Xingyu#, GUO Jingwei, YANG Rui, ZENG Qianchun, LUO Qiong*

(,)

【Objective】Ziyu 44 (L. subsp.), a landrace of Yunnan Province, has broad-spectrum and durable blast resistance. In order to understand the molecular mechanism of resistance to rice blast, 【Method】we carried out the genetic analysis of resistance of Ziyu 44 to theLP36 from Luoping County, Yunnan Province, and mapped the gene responsible for resistance to strain LP36 by using an F2population from the cross between Jiangnanxiangnuo and Ziyu 44.【Result】The resistance of Ziyu 44 to LP36 is controlled by a single dominant gene, termed as(t), which was located on the long arm of chromosome 4 between simple sequence repeat markers RM5503 and RM3276 within about 318 kb.【Conclusion】(t) is a new gene conferring resistance to rice blast. Our results provide essential information for further utilization of the blast resistance gene in rice breeding and its cloning.

rice; rice blast; blast resistance gene; gene mapping

10.16819/j.1001-7216.2019.8054

S435.111.4+1

A

1001-7216(2019)01-0012-08

2018-04-28；

2018-06-20。

國家重點研發(fā)計劃資助項目(2016YFD0100601)；國家自然科學(xué)基金資助項目(31160223)；云南省高?？萍紕?chuàng)新團隊支持計劃資助(IRTSTYN)。