于建武 李明榮 張曉宇 孫麗杰 趙勇華 劉偉

慢性HCV感染早期易發(fā)生胰島素抵抗(insulin resistance，IR)和肝脂肪變性[1]。肝脂肪變性和IR加速脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化和肝癌(HCC)自然進程并導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生。合并肝脂肪變性的CHC成為臨床上難治性的疾病。直接抗病毒藥物盡管能有效的清除HCV，仍不能完全阻止HCC的發(fā)生。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)和AMP激活蛋白激酶(AMPK)作為重要的蛋白激酶感知細胞能量代謝狀態(tài)的改變，對肝臟的能量、糖、脂代謝起重要調(diào)節(jié)作用。既往研究證實HCV下調(diào)SIRT1-AMPK信號通路導(dǎo)致肝細胞能量、糖、脂類代謝紊亂有利于HCV復(fù)制[2-4]。本研究利用表達HCV核心蛋白的HepG2細胞，觀察糖脂代謝異常對HCV感染肝細胞SIRT1-AMPK信號通路的影響。

資料和方法

一、建立表達HCV-core的HepG2細胞系及鑒定

按文獻[5]進行。將HepG2細胞(本科保存)接種于12孔板，2×105/孔，70%～80%細胞融合后，采用脂質(zhì)體Lipofectinmine2000試劑盒(Invitrogen公司)進行轉(zhuǎn)染，并按說明書操作。采用pcDNA3.1-core重組質(zhì)粒(美國Invitrogen公司)2 μg和Lipofectamine 8 μL進行轉(zhuǎn)染，分別用無血清的1640培養(yǎng)基(美國Promega公司)稀釋，充分作用后將混合物加入每孔細胞中，共孵育4 h后，棄掉轉(zhuǎn)染液，更換含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，在體積分數(shù)為0.05的CO2孵箱里繼續(xù)培養(yǎng)36 h后，利用400 μg/mL的G418(Gibco公司)進行穩(wěn)定表達的篩選，3周后選出抗性克隆株繼續(xù)擴大培養(yǎng)，以轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體的HepG2細胞作為對照組。

表達HCV核心蛋白的HepG2細胞在終濃度分別為1.0、2.0、4.5 g/L葡萄糖的無血清DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco 公司)中孵育24 h。表達HCV核心蛋白的HepG2細胞在終濃度分別為0、300、500 μmol/L油酸(美國Sigma Aldrich 公司)和無血清1.0 g/L葡萄糖DMEM培養(yǎng)液中孵育24 h。檢測表達HCV核心蛋白的HepG2細胞SIRT1、AMPK活性和表達。

二、SIRT1酶活性檢測

應(yīng)用SIRT1活性熒光定量檢測試劑盒(美國Sigma公司)，按照說明書進行操作。常規(guī)收集細胞后，加入細胞裂解液[1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)20 μL、5 mol/L NaCl 20 μL、0.5 mol/L EDTA 2 μL、10%NP-40 50 μL、ddH2O 908 μL]1 mL，充分振蕩15 min，4℃14 000×g離心10 min，吸取上清液，Bradford方法蛋白定量。吸取上清5 μL，加入30 μL緩沖液、NAD+5 μL、SIRT1底物10 μL，振蕩混勻，置37 ℃水浴30 min；再加入5 μL顯影液，混勻后置37℃水浴10 min，于紫外線下測吸光值，最后用蛋白濃度校正。每組設(shè)3個復(fù)孔。SIRT1酶活性用pmol/(μg·min)表示。結(jié)果用與1.0 g/L葡萄糖DMEM培養(yǎng)液組的相對比值表示。

三、AMPK α2酶活性檢測

提取細胞總蛋白，150 μg蛋白與AMPK α2抗體免疫沉淀。在30 ℃、pH 7.0、40 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)50 μL(0.1 mmol/L S-腺苷甲硫氨酸合成酶SAMS成肽、0.2 mmol/L AMP、80 mmol/L NaCl、0.8 mmol/L二硫蘇糖醇、5 mmol/L MgCl2和0.2 mmol/L 2 μCi[γ-32P]標記ATP)中激酶反應(yīng)20 min。取25 μL終產(chǎn)物，p81濾紙點樣，體積分數(shù)為0.05三氯醋酸+質(zhì)量分數(shù)為0.01焦磷酸鈉洗，液體閃爍計數(shù)儀(Beckman，LS6500，美國)檢測放射強度。結(jié)果用與1.0 g/L葡萄糖DMEM培養(yǎng)液組的相對比值表示。

四、蛋白質(zhì)印跡檢測SIRT1和p-AMPK的表達

收集表達HCV核心蛋白的HepG2細胞，按5×106細胞加0.5 mL蛋白裂解液提取細胞總蛋白，蛋白提取液4 ℃、14 000×g離心10 min，取上清液，采用Bradfold法測定蛋白濃度后分裝，-70 ℃保存。使用時加上樣緩沖液煮沸，取40 μg總蛋白行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，質(zhì)量分數(shù)為0.05脫脂奶粉室溫封閉2 h；分別加SIRT1抗體 (美國Santa Cruz公司) 和磷酸化AMPK(p-AMPK)(Thr172)抗體 (1∶1 000)，4 ℃溫育過夜。三乙醇胺緩沖液(TBST)洗膜3次，加HRP標記二抗 (1∶10 000)，室溫下溫育1 h；DAB顯色。凝膠成像系統(tǒng)成像并計算條帶灰度值。β-肌動蛋白作為內(nèi)參照。

五、統(tǒng)計學(xué)處理

利用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用t檢驗分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、不同濃度的糖對SIRT1和AMPK活性及表達的影響

隨著葡萄糖濃度不斷升高，SIRT1和AMPK活性及表達下降。見表1。

二、不同濃度的油酸對SIRT1和AMPK活性及表達的影響

SIRT1和AMPK活性及表達下降。見表2。

表1 不同濃度的糖對SIRT1和AMPK活性及表達的影響(±s)

注：與1 g/L葡萄糖組比，at=3.919，bt=9.505，ct=5.477，dt=9.505，et=5.686，ft =9.268，gt=5.477，ht=8.317，均P<0.01；SIRT1為沉默信息調(diào)節(jié)因子1；AMPK為AMP激活蛋白激酶；p-AMPK為磷酸化AMP激活蛋白激酶

表2 不同濃度的油酸對SIRT1和AMPK活性及表達的影響(±s)

注：與不含油酸組比，at=4.382，bt=9.505，ct=4.382，dt=8.317，et=5.477，ft=10.694，gt=4.382，ht=8.317，均P<0.01；SIRT1為沉默信息調(diào)節(jié)因子1；AMPK為AMP激活蛋白激酶；p-AMPK為磷酸化AMP激活蛋白激酶

討 論

慢性HCV感染早期常引起糖、脂類代謝紊亂，故CHC屬于一種代謝性疾病。在調(diào)節(jié)肝細胞能量、糖、脂類代謝過程中，SIRT1-AMPK信號通路是重要的中樞組成部分。本研究選擇HCV-core基因全長片段為目的基因，利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)建立穩(wěn)定表達HCV-core的HepG2細胞株。利用這個細胞模型，觀察高糖、高脂對SIRT1-AMPK信號通路的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著葡萄糖濃度不斷升高，SIRT1和AMPK活性及表達下降。

體內(nèi)脂肪酸分為飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸。每種脂肪酸對組織細胞的功能影響有所不同，棕櫚酸主要影響肝細胞的存活力，而油酸則主要誘導(dǎo)三酰甘油在肝細胞內(nèi)的蓄積[6]。故本研究觀察了對脂類代謝調(diào)節(jié)作用更大的油酸對SIRT1-AMPK信號通路的影響。發(fā)現(xiàn)隨著油酸濃度不斷升高，SIRT1活性及表達下降，AMPK活性及表達下降。Lim 等[7]發(fā)現(xiàn)，在C2C12骨骼肌細胞中油酸可增加SIRT1的磷酸化水平，但對SIRT1的總蛋白水平無顯著差異，與本研究結(jié)果不一致，可能與肌肉和肝臟不同組織間存在差異有關(guān)，也可能與HCV感染引起糖脂代謝紊亂有關(guān)。

總之，本研究表明高糖高油酸下調(diào)HCV感染肝細胞SIRT1-AMPK信號通路的活性及表達。這些結(jié)果為今后通過節(jié)食或運動改善糖脂代謝紊亂治療合并IR和肝脂肪變性的CHC患者提供了理論依據(jù)。