王 飛，宓捷波，葛含光

(天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物與食品檢測中心，天津 300461)

群勃龍、睪酮、黃體酮均屬于甾類同化激素藥物，是比較重要的性激素。同化激素能增強(qiáng)體內(nèi)物質(zhì)沉積、改善生產(chǎn)性能，被廣泛應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)，尤其是反芻動物養(yǎng)殖中[1]。多數(shù)激素類物質(zhì)具有潛在的致癌效應(yīng)[2-3]，長期攝入同化激素會導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂、發(fā)育異常或腫瘤。鑒于此，我國于1988年6月發(fā)布的《獸藥管理?xiàng)l例實(shí)施細(xì)則》中規(guī)定“不得添加激素類藥品”[4]；農(nóng)業(yè)部規(guī)定在所有食品動物中禁止使用群勃龍[5]。但由于經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，違法濫用現(xiàn)象仍較普遍，為了保障我國進(jìn)出口動物源食品的安全和人民的身體健康，對同化激素的殘留監(jiān)測勢在必行。

目前，對甾類同化激素多殘留檢測的方法主要有免疫分析法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等，多以檢測血漿、尿液等樣品中甾類激素代謝物為主，而動物源性食品中原型藥物的檢測研究工作較少。同化激素類藥物在肝、腎和脂肪組織中殘留量較高，以原型藥物為主[6]，而在肌肉和血漿中殘留量較低，因此開發(fā)動物源性食品中甾類同化激素原型藥物的檢測方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法作為檢測同化激素的重要手段之一，能夠滿足痕量和超痕量激素殘留的分析要求，對于食品檢測、臨床診斷和基礎(chǔ)研究具有重要意義[7]。

本研究擬以叔丁基甲醚為提取溶劑，經(jīng)過簡單的前處理，結(jié)合超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)快速檢測牛肉、牛腎中的群勃龍、睪酮、黃體酮。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

API 4000+質(zhì)譜儀：美國AB Sciex公司產(chǎn)品；Agilent 1290超高壓液相色譜儀：美國Agilent公司產(chǎn)品；Avanti J-26XPI離心機(jī)：美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品；N-EVAP 112 24針氮吹儀：美國Organomation公司產(chǎn)品；Milli-Q純水儀：美國Millipore公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

群勃龍、黃體酮、睪酮固醇激素類標(biāo)準(zhǔn)品：純度>95%，德國Dr.Ehrenstorfer公司產(chǎn)品；乙腈、甲酸、叔丁基甲醚：色譜純，迪馬科技公司產(chǎn)品；碳酸鈉等其他試劑：均為國產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水：由Milli-Q純水系統(tǒng)制備。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1樣品前處理方法 準(zhǔn)確稱取5 g樣品(精確至0.05 g)于50 mL離心管中，加入3 mL 10%碳酸鈉溶液和15 mL 叔丁基甲醚，均質(zhì)30 s，以10 mL叔丁基甲醚潤洗刀頭，合并均質(zhì)溶液。振蕩溶液10 min，以4 200 r/min 離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至離心管中，氮?dú)獯蹈伞Ｓ?.0 mL 50%乙腈-水溶液(含0.1%甲酸)溶解殘余物，渦旋混勻，于-20 ℃冷凍30 min，然后以12 000 r/min 離心5 min，取適量溶液過0.22 μm有機(jī)微孔濾膜，待超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測試。

1.3.2基質(zhì)工作曲線的繪制 用基質(zhì)空白溶液分別將群勃龍、睪酮、黃體酮3種標(biāo)準(zhǔn)儲備液(牛肉、牛腎)稀釋為0.0、1.25、2.5、5.0、20.0、50.0 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣測定，以離子色譜圖中各組分的峰面積定量，繪制基質(zhì)工作曲線。

1.3.3色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱(2.1 mm×50 mm×1.8 μm)；流動相：A為0.1%甲酸-水溶液，B為乙腈；柱溫20 ℃；進(jìn)樣量10 μL。梯度洗脫程序列于表1。

表1 3種甾類同化激素藥物的梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution program of three hormones

1.3.4質(zhì)譜條件 ESI正離子模式；毛細(xì)管電壓5.5 kV；離子源溫度600 ℃；多反應(yīng)監(jiān)測模式掃描；其他質(zhì)譜條件參數(shù)列于表2。

表2 3種甾類同化激素藥物的質(zhì)譜檢測條件Table 2 MS/MS parameters of three hormones

注：*表示以子離子及其前體離子為定量離子對

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理及檢測條件的優(yōu)化

2.1.1浸提溶液及凈化方式的優(yōu)化 群勃龍、睪酮、黃體酮均屬脂溶性化合物，極性較弱，難溶于水，易溶于極性有機(jī)溶劑。在文獻(xiàn)報(bào)道中，往往以乙腈[8]、乙酸乙酯[9]、酸化甲醇[10-11]、叔丁基甲醚[12]等為提取溶劑，再以固相萃取小柱，如C18柱[13]、HLB柱[14]等進(jìn)行凈化。

由于本實(shí)驗(yàn)采用外標(biāo)法定量，為盡可能減少前處理步驟，使用了高效率的浸提溶劑，以減少樣品損失，這是提高方法檢出限的關(guān)鍵因素。實(shí)驗(yàn)比較了以叔丁基甲醚、乙腈、乙酸乙酯為提取溶劑，以陽離子交換柱為凈化柱，以牛肉為加標(biāo)基質(zhì)的前處理方法。結(jié)果表明，以叔丁基甲醚為提取溶劑能得到更好的加標(biāo)回收率。實(shí)驗(yàn)嘗試了去除固相萃取柱凈化步驟，單純采用液液分配的方法，以叔丁基甲醚為提取溶劑，對牛肉基質(zhì)中的3種甾類同化激素進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，在以叔丁基甲醚為提取溶劑的情況下，既使沒有凈化柱，依然能得到較高的加標(biāo)回收率，基質(zhì)干擾影響較小。但是，在樣品基質(zhì)更為復(fù)雜(如牛腎臟樣品)，尤其是油脂較多的情況下，不經(jīng)凈化分離直接檢測，難免會對儀器造成污染。因此，實(shí)驗(yàn)嘗試了采用旋蒸后對樣品進(jìn)行低溫冷凍，再離心除脂的方法，既達(dá)到了凈化的目的，又縮短了前處理時(shí)間。

2.1.2流動相的選擇 本實(shí)驗(yàn)使用0.1%甲酸-水溶液和乙腈作為流動相，梯度洗脫，能夠?qū)?種目標(biāo)分析物基線分離。含有低濃度甲酸的溶劑有利于電噴霧離子化，通過多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖，可對3種甾類同化激素進(jìn)行較好地定性和定量分析。因?yàn)檫@3種甾類同化激素藥物屬于脂溶性物質(zhì)，極性相對較小，故在最初的梯度中將水相的比例提高至98%，保證目標(biāo)分析物在色譜柱上充分保留，梯度洗脫的詳細(xì)信息已在表1中列出。

2.1.3質(zhì)譜條件的優(yōu)化 將群勃龍、睪酮、黃體酮標(biāo)準(zhǔn)溶液注入離子源，在正離子模式下對3種甾類同化激素藥物進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，分別對碰撞氣能量、電噴霧電壓、霧化氣壓力進(jìn)行優(yōu)化，使分子離子與特征碎片離子對信號強(qiáng)度的響應(yīng)值達(dá)到最佳，其檢測條件已列于表2。3種甾類同化激素(50 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液)的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖示于圖1，可以看出，3種同化激素在2.0～3.0 min內(nèi)依次出峰，峰形良好。

2.2 方法學(xué)論證

2.2.1基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取0、25、50、200、500 μL，0.1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，N2吹干后，以基質(zhì)空白溶液定容至1 mL，最終得到濃度分別為0、2.5、5.0、20.0、50.0 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。在牛肉和牛腎基質(zhì)中，3種甾類同化激素均表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.996 7，其線性方程及相關(guān)系數(shù)列于表3。

圖1 3種甾類同化激素(5 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液)的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of three hormones(5 μg/L standard solution)

2.2.2干擾性實(shí)驗(yàn) 分別取空白牛肉、牛腎基質(zhì)，按照1.3.1節(jié)方法進(jìn)行前處理，之后進(jìn)行質(zhì)譜檢測，結(jié)果示于圖2。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)用牛肉、牛腎基質(zhì)中不含有3種甾類同化激素物質(zhì)，能夠以該基質(zhì)進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)。

表3 3種甾類同化激素物質(zhì)的線性方程和相關(guān)系數(shù)Table 3 Regression equations and correlation coefficients (r) of three hormones

圖2 牛肉(a)、牛腎(b)空白樣品的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of blank samples of beef (a) and kidney (b)

2.2.3回收率及精密度實(shí)驗(yàn) 在空白牛肉和牛腎基質(zhì)中分別添加1.0、2.0、10.0 μg/kg 3個(gè)濃度水平的3種甾類同化激素物質(zhì)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行6次平行測定，結(jié)果列于表4?？梢钥闯觯谂Ｈ夂团ＤI基質(zhì)中，3個(gè)濃度水平的3種甾類同化激素物質(zhì)均得到較好的回收，回收率在74%～83%范圍內(nèi)。在平行測定過程中，方法的重現(xiàn)性良好，變異系數(shù)小于10%。

2.2.4實(shí)際樣品檢測結(jié)果 日常檢測中，在牛肉及牛內(nèi)臟組織樣品中檢測到黃體酮陽性，6個(gè)陽性樣品的名稱及黃體酮的含量列于表5，其多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖示于圖3。從圖譜可見，本實(shí)驗(yàn)建立的方法適用于黃體酮檢測。黃體酮是內(nèi)源性激素，目前國內(nèi)及國際上尚未對其限量進(jìn)行明確規(guī)定。

表4 3種甾類同化激素物質(zhì)的回收率及其精密度Table 4 Recoveries and precisions of three hormones

表5 陽性樣品名稱及黃體酮含量Table 5 Names of the positive samples and progesterone contents

注：黃體酮被檢出圖3 陽性樣品的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig.3 MRM chromatograms of positive samples

3 結(jié)論

本研究建立了一種以叔丁基甲醚為提取溶劑，無需固相萃取凈化，直接采用超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測牛肉和牛腎中3種甾類同化激素的方法。結(jié)果表明，3種甾類同化激素在0.0～50.0 μg/L濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.996 7。在1.0、2.0、10.0 μg/kg 3個(gè)濃度水平對牛肉和牛腎基質(zhì)做添加回收實(shí)驗(yàn)，以外標(biāo)法定量，平均回收率為74%～83%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。該方法操作簡便、回收率高，陽性樣品檢出準(zhǔn)確，適用于大批量樣品的快速檢測。