蒲 艷，田輝伍，陳大慶，段辛斌，劉紹平，汪登強(qiáng)

(1.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)江中上游漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，武漢 430223)

圓筒吻鮈(Rhinogobiocylindricus)，隸屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)鮈亞科(Gobioninae)吻鮈屬(Rhinogobio)，主要分布在長(zhǎng)江上游干流及其支流(如岷江、金沙江、嘉陵江等)[1-2]，近年有研究表明在長(zhǎng)江中游也有分布[3]，是長(zhǎng)江主要經(jīng)濟(jì)魚類[4]。圓筒吻鮈喜生活于流水或緩流水環(huán)境，有洄游產(chǎn)卵行為[5]，主要以底棲生物(如搖蚊幼蟲)為食[6]。資源調(diào)查表明，目前長(zhǎng)江上游圓筒吻鮈資源開發(fā)率偏高，存在過度開發(fā)現(xiàn)象，資源量呈下降趨勢(shì)[9]。圓筒吻鮈產(chǎn)漂流性魚卵，受精卵隨江水漂流發(fā)育，長(zhǎng)江干流水利工程建設(shè)改變了河流自然水文狀況、流水江段長(zhǎng)度變短、阻隔了魚類的洄游通道[4]，嚴(yán)重影響了其種質(zhì)資源，大壩建設(shè)對(duì)圓筒吻鮈繁殖習(xí)性同樣產(chǎn)生嚴(yán)重影響，進(jìn)一步威脅其生存。迄今，有關(guān)圓筒吻鮈研究報(bào)道主要在生物學(xué)[4]、物種分化[7]、組織學(xué)[8]、資源量[9]等方面，在遺傳學(xué)方面，曾曉蕓對(duì)其遺傳結(jié)構(gòu)分析也有了初步研究[10]，其研究區(qū)域?yàn)殚L(zhǎng)江上游宜賓至萬州庫(kù)區(qū)江段以及主要支流，屬于長(zhǎng)江上游及其支流，而長(zhǎng)江中游卻未見相關(guān)報(bào)道。

線粒體DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、呈母系遺傳、拷貝數(shù)量大、進(jìn)化速率快、無組織特異性等特點(diǎn)，被廣泛運(yùn)用于物種分化、群體遺傳多樣性[10，19]、種屬親緣關(guān)系遠(yuǎn)近等研究中[11]。細(xì)胞色素b(Cytb)基因的結(jié)構(gòu)和功能在mtDNA 13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中了解的最為全面，且其進(jìn)化速度適中、轉(zhuǎn)換或顛換占很大比例等特點(diǎn)，被認(rèn)為是研究種內(nèi)或近緣中間系統(tǒng)發(fā)育、種質(zhì)資源狀況和群體遺傳結(jié)構(gòu)的理想工具，成為魚類遺傳多樣性研究中常見的分子標(biāo)記[14，26，27]。本實(shí)驗(yàn)采用線粒體Cytb序列分析長(zhǎng)江中上游圓筒吻鮈群體的遺傳多樣性及種群結(jié)構(gòu)，以闡明其遺傳多樣性和群體分化狀況，為圓筒吻鮈種質(zhì)資源開發(fā)和保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2017年7～10月在長(zhǎng)江上游干流的宜賓(YB)、瀘州(LZ)、合江(HJ)、江津(JJ)、巴南(BN)、涪陵(FL)及長(zhǎng)江中游的黃岡(HG)7個(gè)采樣點(diǎn)共采集圓筒吻鮈140尾(表1)，各采樣點(diǎn)位置見圖1。所有樣本根據(jù)其形態(tài)鑒定后剪取鰭條，保存于無水乙醇。

圖1 采樣點(diǎn)地理位置Fig.1 Sampling stations of R.cylindricus in the Yangtze River

1.2 基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

剪取適量鰭條，雙蒸水洗去乙醇，用高鹽法提取總DNA[12]。用魚類通用引物擴(kuò)增線粒體DNA Cytb序列，引物序列為L(zhǎng)14724：5′-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′和H15915：5′-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3′[13]。PCR 擴(kuò)增體系50 μL，包括：10× buffer(Mg2+)5 μL，dNTPs(10 md/L)0.5 μL，正反引物各2 μL，Taq DNA Polymerase(2 U)0.4 μL，50 ng/μL DNA模板2 μL，滅菌去離子水補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸8 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，條帶明亮、清晰、單一的樣品，交由生物公司進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序引物與PCR擴(kuò)增引物相同。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Lasergene v7.1軟件包的Seqman進(jìn)行拼接，序列的對(duì)位排列用Clustal X軟件完成。用MEGA v6.0分析軟件統(tǒng)計(jì)序列的堿基組成、轉(zhuǎn)換/顛換比率，并構(gòu)建鄰接系統(tǒng)發(fā)育(NJ)樹，樹檢驗(yàn)采用bootstrap法，設(shè)1 000次重復(fù)。使用DnaSP v5.0獲得單倍型分布，統(tǒng)計(jì)變異位點(diǎn)(s)、單倍型數(shù)目(h)、單倍型多樣性指數(shù)(Hd)和核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)，并進(jìn)行中性檢驗(yàn)和歧點(diǎn)分布分析及Nm值計(jì)算。應(yīng)用Arlequin v3.11軟件進(jìn)行AMOVA分析及群體的遺傳分化指數(shù)FST。使用Network v5.003程序構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖，對(duì)單倍型之間的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析。根據(jù)公式τ=2 ut估算種群擴(kuò)張時(shí)間，其中τ是擴(kuò)張時(shí)間參數(shù)；u=2μk，其中μ為每個(gè)核苷酸的變異速率，k為序列長(zhǎng)度；t表示自擴(kuò)張以來所經(jīng)歷的代數(shù)；擴(kuò)張時(shí)間T=t×代時(shí)。Beast 2.4.3.0進(jìn)行Bayesian Skyline Plots(BSP)分析，采用鯉科魚類常用的進(jìn)化速率每百萬年1%[14]，MCMC長(zhǎng)度為100 000 000，在TRACER ver.1.4構(gòu)圖，各項(xiàng)參數(shù)的ESS均大于200。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列變異

經(jīng)校正和比對(duì)后得到圓筒吻鮈線粒體Cytb有效序列長(zhǎng)度為998 bp，約為Cytb基因全長(zhǎng)的87%。序列中的轉(zhuǎn)換數(shù)(Ts)明顯高于顛換數(shù)(Tv)，Ts/Tv =6.01。A、T、C、G的平均含量分別為27.64%，30.85%，27.11%和14.40%，A+T(58.49%)大于C+G(41.51%)，并顯示明顯的反G含量?jī)A向，與其他硬骨魚類的情況相似。

在998 bp序列中發(fā)現(xiàn)14個(gè)變異位點(diǎn)，其中7個(gè)單一突變位點(diǎn)，另7個(gè)為簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，序列間平均核苷酸差異數(shù)(K)為0.772。140個(gè)個(gè)體中共檢測(cè)到15個(gè)單倍型(GenBank登錄號(hào)：MH673879-MH673893)，其中單倍型H_4出現(xiàn)的頻率最高，為58.6%，其次是H_2(13.6%)和H_3(12.1%)，有7個(gè)單倍型僅出現(xiàn)1次。7個(gè)群體中，江津群體的單倍型數(shù)最多為13個(gè)，涪陵的單倍型數(shù)最少，僅有1個(gè)(表3)。群體平均單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)分別為0.625和0.000 77，最高的是瀘州群體，其次是巴南群體，涪陵群體最低(表1)。

表1 圓筒吻鮈線粒體Cyt b遺傳多樣性Tab.1 Genetic diversity parameters within R.cylindricus based on mtDNA Cyt b sequences

2.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)

群體間分子變異方差分析(AMOVA)顯示，群體主要變異來源為群體內(nèi)，占101.00%，群體間的遺傳分化指數(shù)FST為 -0.998%(P>0.1)(表2)，表明圓筒吻鮈7個(gè)群體間未出現(xiàn)顯著遺傳分化。

表2 圓筒吻鮈群體間分子變異分析Tab.2 Analysis of molecular variance(AMOVA)among R.cylindricus populations

對(duì)兩兩群體間的FST值進(jìn)行計(jì)算(表4)，種群間FST值均低于0.05，說明群體之間未出現(xiàn)遺傳分化。Nm值表示群體間基因交流程度，其Nm>1則表明群體間存在基因交流[15]，經(jīng)計(jì)算總?cè)后wNm值為115.80，兩兩群體Nm值見表4。

表3 圓筒吻鮈群體線粒體Cyt b序列單倍型數(shù)目及分布Tab.3 MtDNA Cyt b haplotype distribution across R.cylindricus populations

表4 圓筒吻鮈群體間的FST值(對(duì)角線下方)和基因流Nm值(對(duì)角線上方)Tab.4 Pairwise FST(below diagonal)and Nm values(above diagonal)among R.cylindricus populations

利用NETWORK里Nedian Joining方法構(gòu)建圓筒吻鮈Cytb序列的單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)如圖2所示。圓筒吻鮈單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖以H_4為中心呈星狀結(jié)構(gòu)，相鄰單倍型之間均是通過一個(gè)突變步驟連接。

以長(zhǎng)鰭吻鮈(R.ventralis)為外類群，采用NJ法(neighbor-joining)構(gòu)建的單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示，系統(tǒng)樹未出現(xiàn)高支持率(均低于60%)的分支，說明群體內(nèi)部沒有明顯遺傳分化。

圖2 基于線粒體Cyt b序列構(gòu)建圓筒吻鮈單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Haplotype network of R.cylindricus based on the mtDNA Cyt b sequences

圖3 圓筒吻鮈線粒體Cyt b 單倍型NJ樹Fig.3 NJ phylogenetic tree of mtDNA Cyt b in R.cylindricus

2.3 歷史種群動(dòng)態(tài)

種群擴(kuò)張歷史動(dòng)態(tài)利用Tajima′sD和Fu′sFs中性檢驗(yàn)和堿基錯(cuò)配來評(píng)估。中性檢驗(yàn)的Tajima′sD=-1.821 88(P<0.05)及Fu′sFs=-12.199(P<0.05)，均為顯著性負(fù)值。單倍型錯(cuò)配分布分析顯示圓筒吻鮈群體的歧點(diǎn)分布表現(xiàn)為單峰(圖4)且BSP分析結(jié)果均表明圓筒吻鮈近期發(fā)生過經(jīng)歷過種群擴(kuò)張。鯉科魚類常用的進(jìn)化速率每百萬年1%[14]，根據(jù)τ=1.179，計(jì)算圓筒吻鮈在距今0.06 Ma(百萬年)前發(fā)生過種群擴(kuò)張。

圖4 圓筒吻鮈Cyt b序列單倍型錯(cuò)配分布圖及BSP分析Fig.4 Mismatch distribution(A)and BSP analysis(B)of R.cylindricus based on the mtDNA Cyt b sequences

3 討論

3.1 遺傳多樣性

遺傳多樣性是生物多樣性的總和，存在于生物種群間、種群內(nèi)，是生物對(duì)環(huán)境適應(yīng)性和進(jìn)化的基礎(chǔ)，物種遺傳多樣性的高低通常與該物種對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力具有一定的線性關(guān)系，表現(xiàn)為遺傳多樣性越高，則表明對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力越強(qiáng)[16-17]。單倍型多樣性指數(shù)(Hd)和核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)是衡量物種遺傳多樣性水平高低的兩個(gè)重要指標(biāo)[18]，Pi值越大則表示群體多態(tài)性較高，反之亦然[16]。與長(zhǎng)江上游其它魚類，如紅唇薄鰍(L.rubrilaris)[19](Pi=0.006)、長(zhǎng)鰭吻鮈[20](Pi=0.001)、異鰾鰍鮀(X.boulengeri)[21](Pi=0.002)等比較，長(zhǎng)江中上游圓筒吻鮈群體遺傳多樣性處于較低水平。本研究以前，曾曉蕓[10]也采用Cytb分析過長(zhǎng)江上游圓筒吻鮈群體遺傳結(jié)構(gòu)，得到Pi=0.010 06，明顯大于本研究的結(jié)果，暗示圓筒吻鮈群體遺傳多樣性存在下降趨勢(shì)。從單倍型來看，曾曉蕓的研究結(jié)果中，頻率最高的3個(gè)單倍型(Hap_1：45.1%、Hap_2：20.5%和Hap_3：8.2%)占總樣本量為73.8%，本研究的頻率最高的3個(gè)單倍型比例為84.3%，提示近年來圓筒吻鮈群體同質(zhì)化有所提高，值得關(guān)注。造成圓筒吻鮈遺傳多樣性下降的原因可能是過度捕撈造成種群大小下降，引起群體遺傳漂變加劇。研究表明，長(zhǎng)江上游圓筒吻鮈資源開發(fā)率偏高[6，9]，資源量呈下降趨勢(shì)。

研究還發(fā)現(xiàn)位于三峽庫(kù)區(qū)的庫(kù)尾涪陵群體沒有檢測(cè)到遺傳變異，僅有一個(gè)單倍型(表3)。圓筒吻鮈屬喜流水性魚類，涪陵江段在三峽水庫(kù)低水位時(shí)江水存在一定的流動(dòng)性，高水位時(shí)，江水幾乎不流動(dòng)，因此不是圓筒吻鮈適宜的棲息地，但該江段的研究有助于分析大壩建設(shè)形成的水庫(kù)對(duì)喜流水性魚類的影響。本研究還顯示，長(zhǎng)江中游的黃岡群體遺傳多樣性較低(表1)，有研究表明長(zhǎng)江上游圓筒吻鮈資源量大于中游[3，9]，說明長(zhǎng)江上游較中游而言是圓筒吻鮈較適宜的棲息地，并且圓筒吻鮈在中游面臨與更多大型魚類競(jìng)爭(zhēng)食物的壓力等，這些可能是造成其群體遺傳多樣性降低的原因。但由于這兩個(gè)群體的樣本量比較少，還需要加強(qiáng)采樣，進(jìn)一步研究。

3.2 遺傳結(jié)構(gòu)及種群歷史

溯祖理論[22]認(rèn)為分布最廣泛的單倍型為原始單倍型?；贑ytb序列的單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖(圖2)顯示，H_4位于網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中心，為主要單倍型，在7個(gè)群體中均有分布，說明H_4單倍型的圓筒吻鮈對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力較強(qiáng)。AMOVA和基因流及兩兩群體之間的遺傳分化分析均表明長(zhǎng)江中上游圓筒吻鮈群體遺傳分化不顯著(表2和表4)，但基因流檢測(cè)顯示，涪陵群體與其它群體(瀘州群體除外)的Nm均小于4，黃岡群體與其他群體(瀘州群體除外)的Nm值也均小于4(表4)，說明這些群體間的基因交流可能存在一定障礙?？紤]到涪陵和黃岡群體樣本量小，Cytb序列的變異位點(diǎn)數(shù)量也較少，對(duì)分析的結(jié)果可能會(huì)造成一定的影響，因此有必要采集更多樣本和采用多態(tài)性更高的標(biāo)記，如mtDNA控制區(qū)[23]、微衛(wèi)星DNA等進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

Grant等[24]根據(jù)海水魚類單倍型多樣性和核苷酸多樣性的高低推測(cè)群體歷史狀況之間的關(guān)系，可分為四種情況：(1)低單倍型多樣性(<0.5)和低核苷酸多樣性(<0.005)，說明種群近期發(fā)生瓶頸或奠定者由單個(gè)或少數(shù)mtDNA譜系組成；(2)高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性，說明群體種群發(fā)生瓶頸后迅速增長(zhǎng)并積累突變；(3)低單倍型多樣性和高核苷酸多樣性，說明地理隔離的亞群體出現(xiàn)分化；(4)高單倍型多樣性和高核苷酸多樣性，說明具有長(zhǎng)進(jìn)化歷史的穩(wěn)定群體或有譜系差異的群體再次融合。本研究結(jié)果顯示，圓筒吻鮈群體遺傳多樣性與上述第二種類型相符，說明圓筒吻鮈群體發(fā)生遺傳瓶頸和群體擴(kuò)張歷史，這與中性檢驗(yàn)、堿基錯(cuò)配分布及BSP分析的結(jié)果吻合。研究表明，長(zhǎng)江上游的一些魚類如紅唇薄鰍、長(zhǎng)薄鰍(L.elongate)[19]、長(zhǎng)鰭吻鮈[20]在長(zhǎng)江上游末次冰期，即大理亞冰期(1～11萬)發(fā)生過種群擴(kuò)張，此時(shí)期長(zhǎng)江上游氣溫回升，有利于魚類的生存和擴(kuò)張[25]。

3.3 保護(hù)建議

本研究顯示，長(zhǎng)江中上游圓筒吻鮈群體沒有發(fā)生遺傳結(jié)構(gòu)分化，與之前研究結(jié)果比較，其圓筒吻鮈群體遺傳多樣性存在下降趨勢(shì)，需要開展長(zhǎng)期遺傳多樣性監(jiān)測(cè)。近年來，漁民為了獲得更多利益而改變了網(wǎng)具規(guī)格，不斷縮小其網(wǎng)具的捕撈規(guī)格，資源量不斷減少，有效繁殖群體難以恢復(fù)。因此，應(yīng)采取有效措施(如禁漁期、漁民轉(zhuǎn)業(yè)等)并加強(qiáng)對(duì)圓筒吻鮈的保護(hù)力度。從本研究得知，7個(gè)群體之間及群體內(nèi)部都沒有明顯的遺傳分化，因此，我們建議將圓筒吻鮈作為一個(gè)整體進(jìn)行就地保護(hù)，并開展長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)。