范成堅，蘇博洋，蘇建國

(1.華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院，武漢 430070；2.武漢市洪山高級中學，武漢 430070)

草魚(Ctenopharyngodonidella)是我國產(chǎn)量最高的大宗淡水魚，2016年草魚產(chǎn)量達589.88萬噸，占我國淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量的18.55%[1]，對穩(wěn)定我國水產(chǎn)品市場具有舉足輕重的作用。草魚養(yǎng)殖業(yè)長期受到病害問題的困擾。每年因草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV)引起的草魚出血病造成的直接經(jīng)濟損失高達十多億元[2-3]。闡明草魚抗病毒免疫機制，為新型疫苗研究提供支撐。

2015年草魚基因組數(shù)據(jù)庫在Nature genetics上發(fā)表并公布，為深入系統(tǒng)研究草魚基因功能奠定了堅實的基礎[4]。I型干擾素在抗病毒免疫應答中發(fā)揮著至關重要的作用[5]。系統(tǒng)篩查草魚基因組發(fā)現(xiàn)草魚Ⅰ型干擾素有4個成員組成(IFN1-4)，II型干擾素有2個成員組成(IFNγ1-2)[6]。草魚IFN3位于草魚2號染色體上，基因體1 770 bp，包含4個內(nèi)含子，編碼序列564 bp，編碼的前體蛋白由187個氨基酸組成。成熟肽由167個氨基酸組成，分子量19.23 kD，等電點4.77。草魚IFN3含有4個半胱氨酸，屬于I型II群IFNc亞群[4]。草魚腎細胞系(C.idellakidney，CIK)在草魚抗病毒免疫研究中廣泛使用。在CIK細胞系中，IFN1和IFN3的表達量比IFN2和IFN4高出3個數(shù)量級[7]。在RIG-I(Retinoic acid-inducible gene I)和MDA5(Melanoma differentiation-associated gene 5)過表達的細胞系中，GCRV感染或poly(I∶C)(Polyinosinic∶polycytidylic acid)刺激早期，IFN3的表達量極顯著上調(diào)[7]。這些現(xiàn)象表明草魚IFN3在抗病毒免疫應答中發(fā)揮著重要作用。

本研究構建草魚IFN3成熟肽原核表達載體，轉化表達菌株，IPTG誘導蛋白表達，將純化后的蛋白免疫BALB/c小鼠，制備多克隆抗體。間接ELISA方法測定抗體效價，western blot鑒定多克隆抗體特異性。在草魚個體水平和CIK細胞水平上檢測草魚IFN3的蛋白表達。為進一步深入解析草魚抗病毒免疫機制奠定蛋白水平上檢測的基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

草魚呼腸孤病毒(GCRV)097株由中國科學院水生生物研究所汪亞平研究員惠贈，屬于GCRV-II型；草魚腎細胞系(CIK)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司；PCR Mix、BamH I酶、XhoI酶、T4連接酶和質(zhì)粒提取試劑盒等購自武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司；大腸桿菌BL21(DE3)pLysS菌株、pGEX-4T-1質(zhì)粒由本實驗室保存。

1.2 實驗動物

6周齡體重16～18克的BALB/c小鼠5只，在華中農(nóng)業(yè)大學實驗動物中心飼養(yǎng)并制備抗體用；500 g左右草魚購于湖北省武漢市團風百榮漁場，在華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)暫養(yǎng)3周以上。

1.3 草魚IFN3基因擴增

根據(jù)GenBank(KU182642)中草魚IFN3的mRNA序列，分析得到編碼成熟肽的序列，設計引物，上游引物：5′-GATGGATCCTTGCCAACAAACTGCATCCT-3′；下游引物：5′-ATACTCGAGCTAGGGTTGTGGAGATTCATACAT-3′(下劃線序列分別為BamH I和XhoI酶切位點)。20 μL PCR反應體系：10 μL Primerstar，上、下游引物分別為0.5 μL，1 μL草魚頭腎巨噬細胞cDNA作為模版，ddH2O 8 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min，94 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

1.4 pGEX-4T-1原核表達載體構建

用限制性內(nèi)切酶BamH I和XhoI對PCR擴增、純化的草魚IFN3片段和表達載體pGEX-4T-1進行雙酶切，37 ℃水浴酶切3.5 h，純化后連接。反應體系：T4連接酶1 μL，Buffer 1 μL，pGEX-4T-1載體2 μL，IFN3片段6 μL。16 ℃水浴連接過夜。轉化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS菌株，提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I和XhoI雙酶切鑒定正確后，送樣至武漢奧科鼎盛生物科技有限公司測序，經(jīng)確認的重組載體命名為pGEX-4T-1-IFN3。

1.5 誘導表達IFN3蛋白及純化

將上述陽性菌在LB/Amp液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)(分5管)，測定光密度為(A600=1)時，加入IPTG(終濃度分別為：0、0.5、1、2、3 mmol/L)誘導10 h，收集菌體，超聲波(工作5 s，間歇10 s，功率250 W)裂解菌體(注意保持低溫環(huán)境)，收集破碎后的上清和沉淀。SDS-PAGE分析目的蛋白的表達情況及表達形式。按Novagen GST 試劑盒中的操作手冊進行純化。

1.6 IFN3多克隆抗體的制備

用5只6周齡、體重16～18 g BALB/c小鼠制備多克隆抗體，其中1只每次注射等量生理鹽水為陰性對照?？乖榛瑢π∈筮M行皮下多點注射，免疫劑量50、100、150和200 μg。初次免疫使用弗氏完全佐劑，之后均使用弗氏不完全佐劑。第0周、第2周和第4周各免疫一次，第5周進行斷尾取血，測定抗體效價。效價達到要求，可再加強一次免疫，一周后摘眼球取血，收集血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 間接ELISA檢測血清抗體效價

用pH9.6濃度為0.05 mol/L的碳酸鹽緩沖液將純化的重組蛋白稀釋為50 ng/mL，包被96孔酶標板，每孔100 μL，4 ℃冰箱包被過夜。次日每孔加1% BSA 200 μL在37 ℃封閉2 h后，用pH 7.4的PBST洗滌3次。加入等梯度稀釋(1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200)的血清各100 μL，陰性對照為1∶50稀釋的免疫前血清，空白對照為鼠血清稀釋液(PBS)，每份3個平行，37 ℃孵育1 h后，同上洗滌3次。每孔加入HRP標記的羊抗鼠IgG(1∶5 000稀釋)100 μL，37 ℃孵育1 h后，同上洗滌3次。每孔加入100 μL的TMB顯色液，37 ℃避光反應20 min后，每孔加入50 μL 2 mol/L的H2SO4終止液。酶標儀上讀取A450值，(樣品吸光值-空白吸光值)/(陰性吸光值-空白吸光值)>2.1為陽性。

1.8 Western blot分析IFN3抗體特異性

將純化的IFN3重組蛋白、CIK細胞提取蛋白分別進行SDS-PAGE電泳，半干轉膜法轉移至NC膜上，于2%的BSA封閉液中室溫封閉2 h；一抗為1∶1 000稀釋的上述血清，4 ℃孵育過夜；二抗為1∶5 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG，37 ℃作用1 h；每次反應后均用TBST洗3～5次，每次5 min。用TMB顯色劑顯色并觀察結果。

1.9 細胞水平病毒感染后不同時間點IFN3蛋白表達

CIK細胞傳代至6孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞長至單層鋪滿80 %左右后，感染GCRV-097病毒，未感染病毒的正常細胞作為陰性對照。感染后6、12、24、48和72 h收集細胞，提取蛋白。Western blot檢測IFN3在CIK細胞感染GCRV后不同時間點的蛋白表達。

1.10 個體水平不同組織IFN3蛋白表達

對暫養(yǎng)3周以上500 g左右的3尾草魚解剖，取免疫相關組織(頭腎、中腎、脾臟、肝胰腺、鰓、皮膚和腸)，3尾魚相應組織樣品混合提取蛋白。

Western blot檢測IFN3在草魚不同組織中的蛋白表達情況。

2 結果

2.1 PCR擴增IFN3及鑒定

PCR擴增IFN3，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果(圖1)顯示：在500 bp上方有一條特異性條帶，與理論大小一致。限制性內(nèi)切酶BamH I和XhoI對擴增片段及質(zhì)粒pGEX-4T-1進行雙酶切，連接、轉化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS菌株、雙酶切鑒定、測序確認。

圖1 草魚IFN3基因擴增PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Amplification result of grass carp IFN3 PCR product 1.IFN3基因PCR產(chǎn)物；M.DNA Marker 2000

2.2 IFN3蛋白原核表達和表達形式分析

陽性菌株用IPTG誘導表達，SDS-PAGE電泳結果(圖2)顯示：泳道1未出現(xiàn)明顯目標蛋白條帶，泳道2-5出現(xiàn)一條明顯的重組蛋白條帶(約45kD)，與理論大小相符。泳道6、7未見明顯的重組蛋白條帶(上清)，泳道8、9重組蛋白含量較多(沉淀)。表明目標蛋白主要以包涵體形式存在。

圖2 SDS-PAGE分析重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-IFN3表達產(chǎn)物及其可溶性Fig.2 The expression protein of pGEX-4T-1-IFN3 and the dissolubility of the recombinant protein by SDS-PAGE analysisA：誘導表達結果；B：可溶性結果。M.蛋白質(zhì)marker；1.未誘導；2.0.5 mmol/L的IPTG誘導表達；3.1 mmol/L的IPTG誘導表達；4.2 mmol/L的IPTG誘導表達；5.3 mmol/L的IPTG誘導表達；6～7.2 mmol/L的IPTG誘導表達產(chǎn)物上清；8～9.2 mmol/L的IPTG誘導表達產(chǎn)物沉淀

2.3 IFN3蛋白純化

純化后蛋白如圖3所示，條帶單一，無明顯雜帶，且大小與理論值(帶GST標簽后約45kD)一致，表明蛋白純化效果好。

圖3 IFN3重組蛋白純化后SDS-PAGE分析結果Fig.3 SDS-PAGE of the purified protein productsM.蛋白質(zhì)marker 1；1.純化的IFN3重組蛋白

2.4 血清抗體效價

使用間接ELISA法測定血清多克隆抗體效價，結果表明草魚IFN3重組蛋白制備的多克隆抗體效價約為1∶3 200。

2.5 Western blot檢測抗體特異性

為了檢測抗體的特異性，對IFN3重組蛋白及CIK細胞蛋白進行SDS-PAGE分析，結果如圖4所示。重組蛋白有一條約45kD的條帶(帶GST標簽)，GCRV刺激CIK細胞24 h后的細胞蛋白有一條約19 kD的條帶(內(nèi)源蛋白)。結果與理論一致且無明顯雜帶，表明所制備抗體的特異性強。

2.6 CIK細胞水平上的時間依賴性表達

GCRV感染CIK細胞后，IFN3在感染后6、12、24、48和72 h的蛋白表達如圖5所示。在感染早期，IFN3蛋白的表達檢測不到，在感染12 h后開始出現(xiàn)條帶，且隨著時間推移，目標條帶逐漸加深變寬，表明其表達量呈上升趨勢。

圖5 GCRV感染CIK細胞后不同時間點IFN3的表達Fig.5 IFN3 protein expressions in CIK cells post GCRV infection1.未感染；2.GCRV感染6 h；3.GCRV感染12 h；4.GCRV感染24 h；5.GCRV感染48 h；6.GCRV感染72 h

2.7 草魚個體水平上不同組織表達

IFN3蛋白在草魚免疫相關組織(頭腎、中腎、脾臟、肝胰腺、鰓、皮膚和腸)中的蛋白表達如圖6所示，僅在皮膚和肝胰腺中檢測到表達，其他組織表達量很低或不表達。

圖6 草魚主要免疫相關組織IFN3的表達Fig.6 IFN3 protein expressions in major immune-related tissues in grass carp1.腸；2.皮膚；3.鰓；4.肝胰臟；5.脾臟；6.中腎；7.頭腎

3 討論

干擾素屬于II型細胞因子，最初是因其具有干擾病毒復制的能力而命名為干擾素。1957年，在研究流感病毒時發(fā)現(xiàn)在雞胚中注射滅活病毒后，雞胚膜中產(chǎn)生一種抗病毒蛋白，即為“干擾素”(Interferon，IFN)[8]。現(xiàn)已證明干擾素作為多效性的細胞因子在生物體中普遍存在[9]，除了抗病毒作用外，它還參與其他重要的生理過程，如調(diào)節(jié)細胞的生長、分化、凋亡以及機體免疫反應等。所以，深入研究干擾素及其作用機制，對于魚類病毒性疾病的防治具有重要的理論和實際意義[10]。

IFN3屬于I型干擾素。目前I型干擾素是研究最多、最深入的干擾素[6]。魚類I型干擾素具有廣譜抗病毒活性。Altmann等[11]研究發(fā)現(xiàn)轉染了斑馬魚IFN基因的細胞對桿狀病毒的抵抗力顯著提高。不僅內(nèi)源性IFN具有抗病毒活性，體外重組表達的I型IFN對于機體或細胞也具有較好的保護作用[12]。Li等[13]研究斑馬魚重組IFN1(zfrIFN1)對傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)感染斑馬魚引起急性病毒感染的抑制作用，發(fā)現(xiàn)zfrIFN1能夠強烈抑制ISKNV對斑馬魚的急性感染并且啟動先天性免疫反應。在哺乳類和鳥類中，干擾素和重組干擾素已應用于臨床實踐，例如重組IFNα/β已被廣泛用于抑制腫瘤和治療病毒性疾病[14-15]，然而在魚類生產(chǎn)實踐中，應用干擾素提高魚類自身免疫力，增強其抗病力的工作尚在初級階段[16]。

盡管人們對草魚病毒病的防治進行了一些卓有成效的探索，但這些方法或多或少存在一些不足之處。具有廣譜抗病毒作用的干擾素可能是防治草魚病毒性疾病的一種新途徑[17]。邵健忠等[16]研究草魚干擾素對巨噬細胞的免疫調(diào)節(jié)功能，結果表明：草魚干擾素對草魚巨噬細胞(Mφ)具有顯著的激活作用，它能提高Mφ內(nèi)O2-、H2O2和ACP的活性與含量，促進Mφ的吞噬和殺菌作用。將人IFNα基因序列轉入到草魚基因組內(nèi)，成功獲得表達人IFNα蛋白的轉基因草魚，通過一段時間的養(yǎng)殖發(fā)現(xiàn)，轉基因草魚的抗病能力較普通草魚的抗病能力高[18-19]。吳初新等[20]純化草魚Ⅰ型干擾素重組蛋白，將重組蛋白添加到飼料中，投喂草魚2 d后進行攻毒試驗，結果顯示攻毒21 d后，投喂重組蛋白組的成活率達63.33%，表明重組IFN蛋白可以作為一種新型魚類免疫制劑。

通過本實驗，我們獲得了草魚IFN3多克隆抗體，并檢測了其在草魚不同免疫組織中的表達差異，以及其在CIK細胞中應對GCRV感染的時間依賴性表達。結果顯示在肝胰臟和皮膚中檢測到特異性條帶，在CIK感染GCRV 12 h后出現(xiàn)特異性條帶，這與邵健忠等[21]研究的草魚干擾素誘生結果一致。本研究為進一步深入解析草魚抗病毒免疫機制奠定蛋白水平上檢測的基礎，同時為干擾素在草魚病害防治上的開發(fā)和利用奠定了基礎。